Introduction
microinjection cytoplasmic של עוברי 1 תאים היא טכניקה רבת עוצמה. זה יכול לשמש להעברת כל פתרון לתוך העובר, למשל, לייצר הגן לדפוק-outs ללמוד תפקוד הגן או כדי ליצור חיות הגן בעריכה. רוב חקלאי-רלוונטי zygotes חוות חיות יש רכב חומצות שומן מאוד גבוה שגורם הציטופלסמה שלהם אטום וחשוך 1. יש להם גם קרום פלזמה אלסטי למדי (PM). תכונות אלו הופכות את microinjection באמצעות pronuclear קונבנציונלי / הזרקת ציטופלסמית כפי שמוצגת במינים מכרסמים מאתגרים ולעתים קרובות לא מדויקים.
יש microinjection cytoplasmic יתרונות על פני microinjection pronuclear שכן הוא קל יותר לבצע וגם גורם פחות נזק את העוברים מוזרק, וכתוצאה מכך כדאיות גבוהה 2. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שיטה מוצלחת לאספקת פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes חיות משק. כדי להיות מסוגל לבצעmicroinjection cytoplasmic עם יעילות גבוהה על עוברי בעלי חיים, לייזר משמש כדי ליצור חור המעטפת השקופה (ZP) ולאחר מכן מחט זכוכית קהה-end משמש microinjection. אסטרטגיה זו שואפת להקטין את נזק מכני המוטבע על העובר במהלך ההזרקה. לאחר מכן, שאיפה של תוכן ציטופלסמית בתוך המזרק מאפשרת שבירה יעילה ובטוחה של ראש הממשלה להבטיח כי הפתרון מועבר לתוך הציטופלסמה של העובר.
טכניקה זו כבר נוצלה בהצלחה בעוברי שור לספק siRNA לתוך הציטופלסמה zygotic 3,4 וליצור מוטציות באמצעות חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / קשור CRISPR מערכת 9 (Cas9) מערכה 5. זה גם מתאים (עם שינויים קלים) להזרקת ביציות קומולוס סגורה שור 6. כאן אנו מתארים פרוטוקול ההזרקה שלנו ומספק צבע, שיכול לחול על הזרקת כל desפתרון IRED לתוך הזיגוטה, ולהראות כי באמצעות טכניקה זו גורמת תמוגה מינימלי ואינו להשפיע על התפתחות העובר המוקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור Micropipette
- micropipette הזרקה
- מניח זכוכית נימי בורוסיליקט (קוטר חיצוני (OD): 1.0 מ"מ, קוטר פנימי (ID): 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי ימין ושמאל נימים) ונעל אותו.
- השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם טאפר ארוך. (דוגמה: חום: 825; משוך: 30; מהירות: 120; זמן: 200; לחץ: 500).
- מוציאים בזהירות את טפטפות משך מהמכשיר והנח אותו על microforge במצב מאוזן.
- תביא פיפטה משכה נימת דוד microforge עם חרוז הזכוכית שלה אל מוקד. השתמש reticle העינית כדי למדוד את העובי הרצוי ולעבור פיפטה אופקית עד נימת הדוד מגיעה הקוטר הפנימי היעד (5 מיקרומטר).
- התאם את החום לכ -45% ובעדינות להביא את פיפטה למטה כך הוא בא במגע עם הנימה. הפעל את החימום בקצרה. w זהחולה מעט להמס את פיפטה כך שומר על הנימה ו בקירור, פיפטה תשבור בנקודת מגע יצירת חתך ישר.
הערה: הגדרת הטמפרטורה המתאימה היא המפתח בשלב זה מאז בטמפרטורות גבוהות מדי יגרום העיקול פיפטה ובכך חתך ישר לא ניתן יהיה וטמפרטורות נמוכות מדי לא יספיקו כדי להמיס את פיפטה (איור 1 א). - תן זווית משוערת 30 ° ליד קץ פיפטה ידי מיקומה על 10 מיקרומטר הרחק נימת הדוד. כוונו את הטמפרטורה ל -60% ולהפעיל את החימום.
הערה: זה יהיה לכופף את פיפטה על הנימה. זווית זו היא רצויה כך קצה המחט הוא במקביל לפני השטח של צלחת ההזרקה כאשר רכובים לתוך המזרק (האיור 1B). - טפל טפטפות microinjection בזהירות כפי שהם מאוד חדים ושבריר.
- micropipette החזקה
- מניחים borosilicזכוכית נימי אכלו (OD: 1.0 מ"מ, מזהה: 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי נימי ימין ושמאל) ונעל אותו.
- השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם ארוך אפילו להתחדד ו קירות מקבילים (דוגמה: חום: 815; משוך: 20; מהירות: 140; זמן: 175; לחץ: 200).
- מוציאים בזהירות את פיפטה משך מהמכשיר חולץ ומניחים אותו על בעל microforge במצב מאוזן. התאם את המיקוד על נימת חימום פיפטה.
- השתמש reticle העינית כדי למדוד את קוטר פיפטה ולהעביר את פיפטה עד קוטרו מעל הנימה מגיע 180 מיקרומטר.
- באותו הגודל המצוין, לסמן את נימי זכוכית עם עט בעל חוד יהלום, ולאחר מכן לחץ בעדינות על קצה המשך לשבור את הכוס. זה אמור לגרום חתך ישר (איור 1 ג).
- הזז את פיפטה לתנוחה אנכית עם קצו קרוב הנימה. הגדר את הטמפרטורה של microforge ל -60%.
- אש-פולני קצה פיפטה באמצעות טכניקות סטנדרטיות 7 עד שהוא מגיע מזהה של 40 מיקרומטר. השתמש reticle העינית יבדוק את התעודה (1D איור).
- תן זווית על פיפטה.
- תביאו פיפטה בחזרה למצב אופקי על 10 מיקרומטר הרחק נימה ו -5 מ"מ הרחק קצהו. הגדר את הטמפרטורה לכ 60% ולהפעיל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית רצויה (של כ -30 o) הוא הגיע. בדוק את זווית ראייה (1E איור).
הערה: פיפטה בדרך כלל רכובה על microinjector בזווית של כ -60 o ביחס לחלק התחתון של מנת ההזרקה. הטיפ של פיפטה מכופף כך שהוא מקביל התחתון של המנה, אשר הוא הכרחי עבור הזריקה הנכונה של העובר מטוס באמצע שלה.
- תביאו פיפטה בחזרה למצב אופקי על 10 מיקרומטר הרחק נימה ו -5 מ"מ הרחק קצהו. הגדר את הטמפרטורה לכ 60% ולהפעיל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית רצויה (של כ -30 o) הוא הגיע. בדוק את זווית ראייה (1E איור).
- בדוק כי microinjectors נטענים באופן מלא עם שמן וכי אין בועות אוויר במערכת (בועות microinjector למנוע בקרה טובה של הזרקה).
- בדוק כי micromanipulators נמצא בעמדת המרכז. זה יאפשר מגוון רחב של תנועה של טפטפות.
- הכנס פיפטה מחזיק לתוך מחזיק micromanipulator השמאל פיפטה הזריקה לתוך מחזיק המיקרומניפולציה התקין.
- אפשר שמן להיכנס טפטפות ידי קפילריות ולבדוק כי המערכת פועלת כראוי על ידי העברת הנפט מעלה ומטה בתוך פיפטה באמצעות הפקדים microinjector.
הערה: אם אין תנועה של שמן בתוך המחטים, ייתכן שיש לסתום. במקרה זה, השתמש מחט חדשה. - השתמש בפקדים micromanipulator להביא את טפטפות למרכז השדה של מיקרוסקופ מבט. באמצעות הגדלה 4X, לבדוק כי טיפים micropipette נמצאים בזווית הנכונה (עמ 'arallel אל החלק התחתון של המנה).
הערה: התקנה נכונה של המחטים היא מפתח עבור זריקה מוצלחת ועל עקביות תוצאות. - כייל את מערכת הלייזר הבאים במדריך כיול של היצרן.
3. הכנת צלחת הזרקה (איור 2)
- מניחים ירידה 50 μl של התחמם (37 ° C) SOF-HEPES (הרכב המפורטים בסעיף חומרים) בתוספת 20% עוברי בסרום שור (FBS) על במרכז המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ. מניחים 1 - ירידה μl 2 של הפתרון להיות מוזרק קרוב עד טיפת ההזרקה. ודא כי עוברי לא להתקרר מתחת RT.
הערה: בפרוטוקול זה נוסיף את צבען אדום-Dextran לפתרון ההזרקה כדי להיות מסוגל לדמיין באתר ההזרקה ולעקוב אחר זה מאוחר יותר. - מכסים את טיפות בצלחת ההזרקה באמצעות כ 10 מ"ל של שמן מינרלי.
- מניח את צלחת ההזרקה על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה ולהביא החרצןettes לתוך ירידת ההזרקה. בדוק כי המחטים הן בפוקוס בתוך הטיפה. וכוון את גובהם לפי הצורך באמצעות הפקדים micromanipulator.
- באמצעות microdispenser, לטעון על 20 - 30 zygotes (17 - 20 שעות לאחר ההפריה (hpf)) בצד העליון של ירידה ההזרקה. בצע הזרקה בטמפרטורת חדר כך את מספר העוברים בירידת ההזרקה נקבע לפי המהירות שבה האדם יכול להזריק אותם. אל תטען יותר עוברים יותר מאלה שיכולים להיות מוזרק 30 דקות.
- כדי לטעון את העוברים לתוך microdispenser, לוחץ על המתג לחלוטין לטבול את הקצה לתוך התמיסה המכילה את העוברים. געו העוברים שיאספו אותו עם הקצה של נימי הזכוכית (אחד בכל הפעם) ולאט לאט לשחרר את הבוכנה כך כל עובר נכנסה לתוך הנימים. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספים או יכולת microdispenser מלאה.
- כדי לשחרר את העוברים הטעונים, לוחץ על המתג בעדינות עד שיתוף כל הנפחntaining עובר הוא שוחרר מן הנימים.
4. Microinjection
- באמצעות מטרת 4X, טען את הפתרון להיות מוזרק לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי (aspirating). טען פתרון מספיק להזריק 2 - 3 zygotes. לאחר מכן להעביר עד טיפת ההזרקה.
- בתוך טיפת ההזרקה, להזיז את פיפטה מחזיק כך שהקצה מתקרב קרוב זיגוטה. החל לחץ שלילי (לשאוב) עם microinjector ההחזקה כך הזיגוטה מקבל קבוע פיפטה מחזיקה ותיקונים לבוא מטרה 20X.
- לאחר הזיגוטה מחוברת פיפטה מחזיקה, לבדוק את איכותו בעזרת פיפטה ההזרקה כדי להזיז את העובר בעדינות ממקום למקום מבלי לנתק אותו. זיגוטה באיכות טובה צריכה שני גופים הקוטביים (אם כי לפעמים רק אחד נתפס) ו הציטופלסמה הומוגנית. אין להזריק zygotes נורמלי (איור 3 א).
- במידת הצורך, לשנות את מיקום העובר עבור זריקה נכונהמקום. מיצוב טוב יהיה זה שבו יש קצת מקום בין ZP וראש הממשלה, כך ראש הממשלה אינו ולהינזק ידי לייזר.
- בדוק כי פיפטה ההזרקה ממוקמת על-המטוס באמצע של העובר על ידי נגיעת הזיגוטה בעדינות באתר הזרקה. אם זה לא על אמצע המטוס שלה, המחט תהיה נוטה להפוך את העובר לסובב במקום לנקב. התאם את הגובה של פיפטה הזריק לפי צורך.
- הפוך חור ZP באמצעות לייזר (איור 3 ב).
- תוך שימוש במקום התוכנה של לייזר צלב הכיוון לייזר ZP איפה החור ייעשה (בצד הנגדי למקום שבו העובר מחוברת פיפטה מחזיקה). באמצעות קליק חלון בקרת לייזר על כפתור האש. ודא כי גודלו של החור הוא גדול מספיק כדי ליצור פתח ZP עבור המחט לעבור מבלי לפגוע PM (דוגמה: 0.662 רוחב פולס msec / 6.9 מיקרומטר גודל חור).
- להעביר את מחט הזריקהדרך חור ZP וליצור קשר עם ראש הממשלה. המשך לדחוף פיפטה קדימה עד שהמחט נמצאת ¾ של הדרך אל העובר (איור 3 ג).
- שים את המיקום של המניסקוס על שלבי פתרון-שמן, כמו זה ישמש לשלוט נפח הזרקה בעקביות.
- החל לחץ שלילי (לשאוב) על פיפטה ההזרקה, אשר תגרום PM ו הציטופלסמה להיות aspirated לתוך מחט הזריקה. המשך עד שהתנועה של הציטופלסמה לתוך המחט מאיצה או כאשר תוכן הציטופלסמה ערבוב עם פתרון הזרקה ניתן לראות. אלה יציינו שבירה של ראש הממשלה (איור 3D).
- להזריק בחזרה התוכן ציטופלסמית ואחריו הפתרון לתוך הציטופלסמה של הביצית המופרית על ידי הפעלת לחץ חיובי (הזרקה), עד המניסקוס על שלבי פתרון-שמן התקדם מקביל בקוטר של הזיגוטה אחד בעבר לנקודת ההתחלה.
הערה: בתנאים שלנו, repre זהsents כ 7 pl של פתרון מוזרק (איור 3E). - שינוי מטרת 4X להזיז את העובר / הים המוזרק אל הצד התחתון של ירידת ההזרקה. שחרר את העובר על ידי הפעלת לחץ חיובי על microinjector ההחזקה. שמור את העוברים הלא מוזרק בצד העליון ואת אלה מוזרקים בצד התחתון של הירידה כדי לסייע במעקב אחר של עוברים המוזרקים / הלא מוזרק ולעבוד ביעילות.
5. שחזור העובר תוצאות הזרקה
- הפוך 3 טיפות של כ 200 μl בצלחת חדשה עם טרום חימם SOF-HEPES. אסוף את העוברים מוזרק באמצעות microdispenser (כמתואר לעיל). לשטוף את העוברים מוזרק על ידי העברתם דרך 3 SOF-HEPES טיפות.
- לספור את העוברים lysed במהלך microinjection וזורקים אותן.
הערה: זיגוטה lysed ניתן להבחין בקלות מתוך אחד שלם מאז הראשון מופיע שקוף, מלא את כל ZP, וזה בדרך כלל יש cytoplasmicתוכן דולף החוצה של העובר. - לחלופין, סמן את יעילות microinjection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עליך להיות מודע לכך חשיפה לאור UV יכול לגרום נזק לעובר שיכולים להשפיע על התפתחות שלאחר מכן.
- קבוצות התרבות של 25 עוברים מוזרק 50 טיפות μl של המדיום אופטימיזציה סימפלקס אשלגן (KSOM) השלימו עם 4 מ"ג / אלבומין בסרום שור מ"ל (BSA) תחת שמן מינרלי על 38.5 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באוויר, והלחות לרוויה.
- להשלים את תרבות התקשורת עם 5% FBS יומיים לאחר ההזרקה.
- בדוק הבלסטוציסט (BL) מחירים 7 ימים לאחר ההזרקה. חישוב שיעורי BL כמו מספר כולל של עוברי הבלסטוציסט / מספר כולל של עוברים בתרבית הטיפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ליזר בסיוע microinjection cytoplasmic הוא פרוטוקול חזק ואמין כדי לספק פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes בעלי החיים. איור 3 מראה בקווים כלליים את zygotes לפני ואחרי ההזרקה כמו גם את קווי המתאר הכלליים של הטכניקה. Dextran-אדום משמש הזרקת פתרון ולאפשר לאתר מעקב של יעילות הזרקת הזרקת ודיוק. משלוח מוצלח של הפתרון מתואר באיור 4 מראה עובר מוזרק לאחרונה שבה לצבוע מופץ בצורה הומוגנית בציטופלסמה. באמצעות טכניקה זו 100% מן העוברים מוזרקים הציטופלסמה שלהם.
פרוטוקול זה הוכיח להיות בעלי שיעור תמוגה מינימלי zygotes שור כבש. רק 15.6 ± 5 ו -5.8 ± 3.9% מן העוברים המוזרקים היו lysed ב בקר וצאן, בהתאמה, כתוצאת microinjection
תוצאות אלו מצביעות כי הזרקת intracytoplasmic בסיוע לייזר גורמת נזק מינימלי במהלך ההזרקה ותוצאות בשיעורי פיתוח הבלסטוציסט נורמלי.
איור 1: תרשים כללי מציג כיצד להפוך את פיפטות החזקה הזרקה. א.ב.) הזרקת פיפטה, CE) החזקת פיפטה. א) בעדינות לגעת נימה עם פיפטה משך את בקוטר הרצוי (5 מיקרומטר). הפעל את החימום לזמן קצר (הראה ב o טווח). זה יתמוסס פיפטה מעט ולכן שומר על הנימה ו בקירור, פיפטה תשבור בנקודת מגע יצירת חתך ישר. ב) להפוך וזווית ב פיפטה כ -0.5 סנטימטרים הרחק קצו ידי מיצוב פיפטה כ -10 מיקרומטר הרחק נימת הדוד. המשך חימום עד לזווית הרצויה מושגת. C) השתמש בעט קצה יהלום לסמן ולחתוך את פיפטה מחזיק בבית בקוטר הרצוי (180 מיקרומטר). ד) במצב אנכי, אש-פולני קצה פיפטה מחזיקה עד מגיע הקוטר הפנימי הרצוי (40 מיקרומטר). ה) תן זווית על פיפטה להביא פיפטה חזרה מיצוב אופק זוג מיקרומטר הרחק הנימה וכ -0.5 סנטימטרים הרחק קצו. הפעל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית הרצויה מושגת. ראה 8,9,10 לפרטים נוספים על איך לעשות מחטים.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:.. התקנה כללית של צלחת הזרקת סידור טפטפות, טיפות, ועובר מוצגים בציור זה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. פרוטוקול הזרקת Intracytoplasmic בסיוע לייזר א) תרשים כללי של זיגוטה מצורף פיפטה מחזיקה לפני הזריקה. PB: גופים פולאר, ZP: המעטפת השקופה, CYT: הציטופלסמה, PN: pronuclei, ראש הממשלה: פלזמה membran דואר, HP: פיפטה מחזיק, IP:. פיפטה הזרקת BE) צעדים Microinjection: B) הפוך חור ZP של זיגוטה מצורף פיפטה מחזיקה באמצעות לייזר C) הציגו את פיפטה הזרקת כלפי הצד הנגדי של העובר. . ודא עמדת המניסקוס (א). ד) לשבור את קרום התא על ידי aspirating תוכן ציטופלסמית בתוך פיפטה ההזרקה. E) להזריק בחזרה תוכן ציטופלסמית פתרון לתוך הציטופלסמה zygotic, עד המניסקוס מגיע בקוטר הזיגוטה אחד (ב) עבר את נקודת ההתחלה . מרחק ab מייצג ~ 7 pl של פתרון מוזרק. F) תרשים כללי של זיגוטה לאחר ההזרקה. ראוי לציין, כי הפתרון המוזרק מתפשט הומוגנית לתוך הציטופלסמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"1"> 
איור 4:.. איור נציג של זיגוטה מוזרקת עם Dextran-אדום א) תמונה בשדה בהירה של B הזיגוטה המוזרק) תמונה פלורסנט של הזיגוטה מוזרק אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. שיעור עוברים lysed לאחר זיגוטה Microinjection בשני מינים שונים נתונים מייצג 4 משכפל עבור עוברי שור (בסך הכול 103 zygotes מוזרק) ו -3 משכפל עבור עוברי כבש (סה"כ 173 zygotes מוזרק). ברי שגיאה מייצגים SEM אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. מחירים הבלסטוציסט ב שור ו כבש עוברים נתונים מייצגים 4 משכפל עבור מיני שור עם סך של 102 מוזרק ו -156 עוברים מלאים 3 משכפל עבור המין כבש עם סך של 163 והזריקו 239 עובר בקרה. ברי שגיאה מייצגים SEM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microinjection של zygotes הוא שיטה מבוססת היטב מציגים פתרונות לעוברי יונקים. עם כמה וריאציות תלויות המין ואת מטרת הניסוי, טכניקה זו יכולה להיות בשימוש נרחב. אנו מראים כיצד לבצע microinjection intracytoplasmic באמצעות לייזר כדי לסייע בכניסה של micropipette בוטה לקצה. Zygotes של כמה מיני בעלי חיים (כמו בקר, כבשים, חזירים) יש הציטופלסמה כהה, שימנע את להדמיה של פיפטה בזריקה אחת בתוך העובר. כמו כן, ממברנות הפלזמה שלהם הן מאוד אלסטי, מה שהופכים החדירה שלהם עם מחט משופע ממוסמר (בדרך כלל המשמש להזרקת zygotes של מינים מכרסמים) קשה להשיג. כדי להתגבר על המגבלות האלה, השתמשנו לייזר כדי לאפשר מעבר של מחט קהה-סוף דרך המעטפת השקופה והשאיפה הבאות של תוכן cytoplasmic על מנת להבטיח שבירה של קרום הפלזמה ואת שחרורו של הפתרון בתוך הציטופלסמה של העובר. יתר על כן, על ידי injecting באתר היפך כניסת המחט (כ 3/4 בתוך העובר) אנו שואפים לתפוס את PN ובכך למנוע שהאיפה / ההזרקה שלהם. יתר על כן, זה מספק יותר נקודת המגע עבור הקרום השבור לרפא, ובכך וכתוצאה מכך שיעור תמוגה נמוך.
הפקת micropipettes טוב (במיוחד פיפטה הזרקת) והולמת הגדרתן לתוך micromanipulator הוא המפתח להשגת תוצאות טובות עם הטכניקה הזו. מחט הזריקה יכולה לשמש כל עוד פתרון ההזרקה נע בצורה חלקה בתוך המחט. לפעמים, cytoplasmic תוכן או אפילו pronuclei תוכן נתקע בתוך קצה המחט, גרימת הזרימה לרוץ בצורה לא אחידה סיבוך הזרקה (זה גם מגביר את קצב תמוגה ומעכב את התהליך). החלפת מחט הזריקה כאשר זה קורה יש צורך לקבל תוצאות אופטימליות עם פרוטוקול זה. משך הזמן כי הם עוברים מחוץ לחממה הוא קריטיכדי לקבל שיעורי הישרדות עקביים לא יעלה על 30 דקות. אחרי אימון ותרגול, מפעילי בדרך כלל להשיג מהירות זריקה של 1-2 עובר מוזרקים לדקה. נקודה מרכזית נוספת להצלחה בפרוטוקול זה היא להזריק את אותו הסכום עקבי של עוצמת קול של פתרון לכל עובר. זה בקלות ובמדויק נשלט על ידי התבוננות העקירה של המניסקוס ממשק פתרון-שמן. חשוב כי קוטר פיפטה עולה בקנה אחד בין מניפולציות וכי הקצה בעל קוטר רגיל וקבוע. עם 5 טפטפות מיקרומטר מזהה על הטיפ, 7 - 10 pl של נפח הזרקה מושג על ידי הזרקה השווה באורך של הזיגוטה. הזרקה-Over לעתים קרובות תוצאות תמוגה העובר.
שימוש בפרוטוקול זה, 100% מן העוברים מוזרקים כמו שצריך לתוך הציטופלסמה, הימנעות זריקות שטח perivitelline שקרית לחלוטין (איור 4). זה ממקסם את אמינות שחזור של assay נעשה (תלות הפתרון המוזרק) מאז התוצאות הם רק בשל שפעת הפתרון המוזרק ולא עקביויות הזרקה. חלק zygotes מוזרק בדרך כלל יהיה lyse בשל נזק מכני במהלך ההזרקה. שיעור הרגיל של הישרדות לאחר ההזרקה הוא 75% 11. באמצעות שיטה זו, אנו מסוגלים לקבל שיעורים מינימאליים של עבר lysed (איור 5). כמו כן, שיעורי פיתוח הבלסטוציסט היו שווים-מוזרק הלא (שליטה) עובר (איור 6), המציין כי טכניקת ההזרקה אין השפעות מזיקות על פיתוח עובר מוקדם. היעילות של פרוטוקול זה הושוותה לאחרונה פרוטוקול microinjection cytoplasmic הקונבנציונלי (microinjection cytoplasmic הישיר באמצעות מחט זכוכית ממוסמרת משופעת ללא שימוש הליזר לחדור דה ZP) להזרקת zygotes שור 5. התוצאות הראו שיעורים גבוהים משמעותי של עבר lysed ושיעורים נמוכים יותר של היווצרות blastocysts עבור cytopl הישירהmicroinjection asmic. אנו מאמינים הבדלים אלה נובעים מנזק מכאני פחות במהלך חדירת מחט בעת שימוש microinjection cytoplasmic בסיוע הליזר, מה שהופך בפרוטוקול זה אחד המועדף להזרקת מיני בעלי חיים במעבדה שלנו.
כאן, אנו מציגים נתונים עבור עוברי שור כבש מתקבל על ידי הפריה חוץ-גופית, אלא גם בחנו את פרוטוקול באמצעות ב-vivo ו-גופית עוברים החזירים קבלת תוצאות דומות (מידע לא מוצג). בהתאם הפתרון המוזרק, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור יישומים רבים. לאחרונה, השתמשנו בו כדי להציג את מערכת CRISPR / Cas9 לדפוק קצוב גנים ספציפיים על עוברי שור מופרה חוץ גופייה ומוצאים שיעור גבוה של blastocysts רצף עם מוטציות: 50% מן העוברים (n = 6) היו מוטציות biallelic היו, 33% (n = 4) מוטציות monoallelic, ו -17% (n = 2) היו wild-type 5. פרוטוקול זה היה מאוד אמין ויכול לשמשכמה מינים ויישומים עצומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
- Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
