Introduction
Cytoplasmatische micro-injectie van 1-cel embryo is een zeer krachtige techniek. Het kan worden gebruikt voor het afleveren van elke oplossing in het embryo, bijvoorbeeld, produceren gen knock-outs voor bestudering van genfunctie of gen aangepast dieren te genereren. De meeste landbouw-relevante boerderijdier zygoten hebben een zeer hoge vetzuursamenstelling dat hun cytoplasma ondoorzichtig en donker 1 maakt. Ze hebben ook een vrij elastisch plasmamembraan (PM). Deze eigenschappen maken van micro-injectie met behulp van conventionele pronucleaire / cytoplasmatische injectie zoals gebruikt in knaagdieren uitdagende en vaak onnauwkeurig.
Cytoplasmatische micro-injectie heeft voordelen ten opzichte pronucleaire microinjectie omdat het makkelijker uit te voeren en veroorzaakt ook minder schade aan de geïnjecteerde embryo, wat resulteert in hogere levensvatbaarheid 2. Het algemene doel van dit protocol is om een succesvolle methode te demonstreren voor het leveren van oplossingen in het cytoplasma van de boerderij dierlijke zygoten. Om te kunnen presterencytoplasmatische micro-injectie met een hoge efficiëntie op vee embryo wordt een laser gebruikt om een gat in de zona pellucida (ZP) en vervolgens een stompe uiteinden glazen naald wordt gebruikt voor de micro-injectie genereren. Deze strategie is gericht op de mechanische schade afgedrukt op het embryo tijdens de injectie te verminderen. Vervolgens aspiratie cytoplasmatische inhoud binnen de injectienaald maakt een efficiënte en zekere breuk van de PM verzekeren dat de oplossing in het cytoplasma van de embryo wordt geleverd.
Deze techniek werd reeds met succes toegepast in runderembryo's naar siRNA geven in de zygotische cytoplasma 3,4 en mutaties met de geclusterde regelmatig op afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CRISPR systeemcomponent 9 (Cas9) systeem 5 genereren. Het is ook geschikt (met kleine wijzigingen) aan runder-cumulus ingesloten oöcyten 6 injecteren. Hier hebben we onze injectieprotocol leveren van een kleurstof beschreven, kunnen die welke voor het injecteren van elke des teIRED oplossing in de zygote, en laten zien dat met deze techniek geeft vrijwel geen lysis en heeft geen invloed op de vroege embryonale ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Micropipet Production
- injectie micropipet
- Plaats een borosilicaat glazen capillair (buitendiameter (OD): 1,0 mm, binnendiameter (ID): 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen.
- Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange tapper. (Voorbeeld: Heat: 825; Trek: 30; Velocity: 120; Tijd: 200; Pressure: 500).
- Haal de getrokken pipetten uit het apparaat en plaats het op een microforge in een horizontale positie.
- Breng de getrokken pipet en de microforge verwarming filament met zijn glazen kralen in beeld. Gebruik het oculair reticule tot de gewenste dikte te meten en zet de pipet horizontaal totdat het verhitterfilament het doel binnendiameter (5 pm) bereikt.
- Pas de warmte tot ongeveer 45% en voorzichtig breng de pipet naar beneden, zodat het de gloeidraad raakt. Activeer even de kachel. dit wziek enigszins smelt de pipet, zodat het voldoet aan de gloeidraad en bij afkoeling, zal de pipet te breken bij het contactpunt het genereren van een rechte snede.
Opmerking: de juiste temperatuurinstelling sleutel in deze stap, omdat te hoge temperaturen de pipet bocht maakt en dus een rechte snede niet mogelijk en temperatuur te laag niet voldoende om de pipet (figuur 1A) smelten. - Maak een geschatte hoek van 30 ° in de buurt van de pipet tip door het plaatsen van het ongeveer 10 micrometer uit de buurt van de verwarming filament. Stel de temperatuur in op 60% en de verwarming activeert.
Opmerking: Dit zal de pipet buigen over de gloeidraad. Deze hoek is gewenst dat de punt van de naald parallel aan het oppervlak van de injectieplaat bij montage in de injector (Figuur 1B). - Handvat micro-injectie pipetten met de nodige voorzichtigheid als ze zijn zeer scherp en kwetsbaar.
- Holding micropipet
- Plaats een borosilicat glazen capillair (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen.
- Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange, zelfs taps en parallelle wanden (Voorbeeld: Heat: 815; Trek: 20; Velocity: 140; Tijd: 175; Pressure: 200).
- Haal de getrokken pipet uit de trekker apparaat en plaats het op de microforge houder in een horizontale positie. Pas de focus op de verwarming filament en pipet.
- Gebruik het oculair vizier naar de pipet diameter meten en beweeg de pipet totdat de diameter over de gloeidraad 180 pm bereikt.
- Op de aangegeven maten, merk de glazen capillair met een diamant tip pen, en dan zachtjes druk op de trok tip om het glas te breken. Dit moet resulteren in een rechte snede (figuur 1C).
- Verplaats de pipet om verticaal met de punt dicht bij de gloeidraad. Stel de temperatuur van de microforge tot 60%.
- Brand-polish de punt van de pipet met standaardtechnieken 7 tot deze een ID van 40 urn bereikt. Gebruik het oculair vizier om de ID (figuur 1D) te controleren.
- Maak een hoek op de pipet.
- Breng de pipet naar een horizontale positie ongeveer 10 urn van het filament en 5 mm van de punt. Stel de temperatuur tot ongeveer 60% en activeren van de verwarming de pipet via filament buigen. Verhit tot een gewenste hoek (ongeveer 30 °) bereikt. Controleer de hoek visueel (figuur 1E).
Opmerking: De pipet is meestal gemonteerd op de microinjector in een hoek van circa 60 ° ten opzichte van de bodem van de schotel injectie. De punt van de pipet wordt gebogen, zodat het evenwijdig aan de bodem van de schaal, die nodig is voor de juiste injectie van het embryo in het middenvlak is.
- Breng de pipet naar een horizontale positie ongeveer 10 urn van het filament en 5 mm van de punt. Stel de temperatuur tot ongeveer 60% en activeren van de verwarming de pipet via filament buigen. Verhit tot een gewenste hoek (ongeveer 30 °) bereikt. Controleer de hoek visueel (figuur 1E).
- Controleer of de microinjectors volledig geladen met olie en dat er geen luchtbellen in het systeem (bellen in het microinjector voorkomen fijne controle van de injectie).
- Controleer of de micromanipulators zijn in de middelste stand. Dit zal zorgen voor een breed scala van de beweging van de pipetten.
- Plaats de pipet die in de micromanipulator houder linker en de injectie pipet in de juiste micromanipulation houder.
- Laat de olie in de pipetten te gaan door capillaire werking en controleer of het systeem goed werkt door op en neer bewegen van olie in de pipet met behulp van de microinjector controles.
Let op: Als er geen beweging van olie in de naalden, kan er een klomp te zijn. In dit geval, gebruik dan een nieuwe naald. - Gebruik de micromanipulator controles om de pipetten in het centrum van het gezichtsveld van de microscoop brengen. Met behulp van 4X vergroting, controleren of de micropipet tips zijn in de juiste hoek (parallel naar de bodem van de schaal).
Opmerking: Een correcte opstelling van de naalden is de sleutel voor een succesvolle injectie en voor resultaten consistentie. - IJk het lasersysteem na kalibratie van de fabrikant handleiding.
3. Bereiding van Injectie Dish (figuur 2)
- Plaats een 50 ul druppel verwarmd (37 ° C) SOF-HEPES (samenstelling beschreven in de paragraaf materialen) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) op het midden van het deksel van een 100 mm petrischaal. Plaats een 1-2 ul druppel van de oplossing te injecteren dicht bij de injectie druppel. Zorg ervoor dat de embryo's niet af te koelen onder de RT.
Opmerking: In dit protocol zullen we de Dextran rode kleurstof toevoegen injectie oplossing kunnen de injectieplaats visualiseren en volgen later. - Bedek de druppels in de injectie plaat met behulp van ongeveer 10 ml van minerale olie.
- Plaats de injectie schotel op het stadium van het omgekeerde microscoop en breng de pipEttes in de injectie druppel. Controleer of de naalden zijn in focus in de drop. Passen hun hoogte indien nodig met de micromanipulator controles.
- Met een microdispenser, laadt ongeveer 20-30 zygoten (17-20 uur na bevruchting (HPF)) in de bovenzijde van de injectie druppel. Voer injectie op kamertemperatuur zodat het aantal embryo's in de druppel injectie wordt bepaald door de snelheid waarmee de persoon die kan injecteren. Niet meer embryo niet laden dan degene die in 30 minuten kan worden geïnjecteerd.
- Om de embryo's in de microdispenser te laden, op de zuiger volledig en dompel de punt in de oplossing die de embryo's. Raak de embryo's om te worden opgehaald met de punt van de glazen capillair (één op het moment) en langzaam los van de zuiger, zodat elk embryo komt in de capillaire. Herhaal dit totdat alle embryo's worden opgenomen of de microdispenser capaciteit is vol.
- Om de geladen embryo's vrij te geven, drukt u de zuiger voorzichtig tot het gehele volume containing de embryo vrijkomt uit het capillair.
4. Micro-injectie
- Met behulp van de 4X doel, laadt u de oplossing in de injectie pipet worden geïnjecteerd door het toepassen van negatieve druk (opzuigen). Laad afdoende oplossing te injecteren 2-3 zygoten. Ga dan naar de injectie druppel.
- Binnen de injectie drop, verplaatsen de holding pipet, zodat de tip komt dicht bij een zygote. Solliciteer negatieve druk (aspireren) samen met het bedrijf microinjector zodat de zygote wordt bevestigd aan het bedrijf pipet en wijziging van een 20x doelstelling.
- Zodra de zygote het aanhouden pipet is bevestigd, controleert de kwaliteit ervan met behulp van het injecteren pipet om voorzichtig te bewegen het embryo zonder los te maken. Een goede kwaliteit zygote dienen beide polaire lichamen (hoewel soms slechts één zichtbaar) en een homogeen cytoplasma. Niet injecteren abnormale zygoten (figuur 3A).
- Indien nodig, de positie van de embryo voor een goede injectielocatie. Een goede positionering zou zijn dat waar er enige ruimte tussen de ZP en PM, zodat de PM niet beschadigd door de laser.
- Controleer of de injectiepipet wordt op het embryo middenvlak door voorzichtig de zygote op de injectieplaats raken. Als het niet op het middenvlak, de naald de neiging om het embryo te roteren in plaats van de punctie. De hoogte van de injectiepipet indien nodig.
- Een gat in de ZP behulp van een laser (figuur 3B).
- Met de laser software plaats de laser dradenkruis in de ZP waar het gat wordt gemaakt (aan de kant waar het embryo tot het bedrijf pipet bevestigd). Met behulp van de laser controle venster klik op de vuurknop. Blijft de grootte van het gat groot genoeg is om een opening in de ZP van de naald maken te passeren zonder schade aan de PM (Voorbeeld: 0,662 msec pulsduur / 6,9 um gat grootte).
- Steek de injectienaalddoor het gat in de ZP en contact maken met de PM. Ga door het indrukken van de pipet naar voren totdat de naald is ¾ van de weg naar het embryo (Figuur 3C).
- Op de positie van de meniscus bij de oplossing interfase-olie, omdat dit wordt gebruikt om consistent injectievolume regelen.
- Toepassen onderdruk (aspiraat) op de injectie pipet, wat zal resulteren in PM en cytoplasma wordt ingeademd in de injectienaald. Doorgaan tot het verkeer van cytoplasma in de naald versnelt of wanneer cytoplasma inhoud mengen met injectieoplossing te zien. Deze zullen breuk van de PM (figuur 3D) te geven.
- Injecteer terug de cytoplasmatische inhoud gevolgd door de oplossing in het cytoplasma van de zygote door toepassing van positieve druk (injecterende), totdat de meniscus aan de oplossing-olie interfase is geavanceerd equivalente diameter een zygote verleden uitgangspunt.
Let op: Onder onze voorwaarden, deze vertegenwoordigt ongeveer 7 pl van geïnjecteerde oplossing (figuur 3E). - Wijziging van een 4X doelstelling en verplaats de geïnjecteerde embryo / s aan de onderkant van de injectie druppel. Laat het embryo door het toepassen van positieve druk op het bedrijf microinjector. Houd de niet-geïnjecteerde embryo's aan de bovenzijde en de geïnjecteerde die op de onderzijde van de druppel te helpen houden van de geïnjecteerde / niet-geïnjecteerde embryo en efficiënt werken.
5. Embryo Herstel en Injection Resultaten
- Voeg 3 druppels van ongeveer 200 pi in een nieuwe schaal met voorverwarmd SOF-HEPES. Verzamel de geïnjecteerde embryo's met een microdispenser (zoals hierboven beschreven). Was de geïnjecteerde embryo's door ze te verplaatsen door middel van de 3 SOF-HEPES daalt.
- Tel de embryo's gelyseerd tijdens micro-injectie en gooi ze weg.
Opmerking: Een gelyseerd zygote kan gemakkelijk te onderscheiden van een intact zijn, want de eerste doorschijnende verschijnt, vul het hele ZP, en het heeft meestal cytoplasmainhoud lekken naar de buitenzijde van het embryo. - Optioneel, controleer dan de micro-injectie-efficiëntie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wees ervan bewust dat blootstelling aan UV-licht embryo schade die van invloed kan zijn verdere ontwikkeling kan induceren.
- Cultuur groepen van 25 geïnjecteerde embryo's in 50 pl druppels kalium simplex optimalisatie medium (KSOM) aangevuld met 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) onder minerale olie bij 38,5 ° C, 5% CO2 in lucht en vocht tot verzadiging.
- Vul het kweekmedium met 5% FBS twee dagen na de injectie.
- Controleer blastocyst (BL) tarieven 7 dagen na de injectie. Bereken BL tarieven als het totale aantal blastocyst embryo's / totaal aantal embryo's gekweekt in die druppel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser-assisted cytoplasmatische microinjectie is een krachtige en betrouwbare protocol oplossingen in het cytoplasma van vee zygoten. Figuur 3 toont een algemeen overzicht van de zygoten voor en na injectie en de totale omtrek van de techniek. Dextran-rood wordt toegepast als injecteren oplossing volgstation van injectie en injectie efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk. Succesvolle levering van de oplossing is geïllustreerd in figuur 4 toont een recent ingespoten embryo waarin de kleurstof homogeen verdeeld in het cytoplasma. Met deze techniek 100% van de embryo's worden geïnjecteerd in het cytoplasma.
Dit protocol heeft aangetoond minimale lysis prijzen voor runderen en schapen zygoten hebben. Slechts 15,6 ± 5 en 5,8 ± 3,9% van de geïnjecteerde embryo's werden gelyseerd bij runderen en schapen respectievelijk als gevolg van micro-injectie
Deze resultaten geven aan dat laser-assisted intracytoplasmatische injectie veroorzaakt minimale schade tijdens injectie en resultaten in normale blastocyst ontwikkelingstarieven.
Figuur 1: Een algemeen schema Resultaat Boeken bij de Holding en Injection pipetten maken. AB) injectie pipet, CE) Holding pipet. A) voorzichtig raak de gloeidraad met de getrokken pipet op de gewenste diameter (5 pm). Activeer de verwarming kort (zien op o range). Dit zal iets smelt de pipet, zodat het voldoet aan de gloeidraad en bij afkoeling, de pipet zal breken bij het contactpunt het genereren van een rechte snede. B) maken en de hoek in de pipet ongeveer 0,5 cm afstand van de punt door het positioneren van het pipet ongeveer 10 urn van het verhitterfilament. Verhit totdat de gewenste hoek is bereikt. C) Gebruik een diamant tip pen te markeren en snijd het bedrijf pipet op de gewenste diameter (180 pm). D) in een verticale positie, brand-polish de punt van het bedrijf pipet totdat het bereikt het gewenste inwendige diameter (40 pm). E) Maak een hoek op de pipet brengen van de pipet terug naar een horizontale positie een paar micrometer uit de buurt van de gloeidraad en ongeveer 0,5 cm afstand van de punt. Activeer de kachel naar de pipet over de gloeidraad buigen. Verhit totdat de gewenste hoek is bereikt. Zie 8,9,10 voor meer informatie over hoe u naalden te maken.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:.. General Setup van Injectie Dish Regeling van pipetten, druppels, en embryo's worden getoond in deze tekening Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Laser-assisted Intracytoplasmic Injection Protocol A) Een algemeen schema van een zygote vóór de injectie verbonden aan het bedrijf pipet. PB: Polar lichamen, ZP: zona pellucida, Cyt: cytoplasma PN: pronuclei, PM: Plasma membrane, HP: die pipet, IP:. injectiepipet BE) Microinjection stappen: B) Maak een gat in de ZP van een zygote bevestigd aan het bedrijf pipet met een laser C) Breng de injectie pipet naar de tegengestelde zijde van het embryo. . Controleer positie van meniscus (a). D) Breek de plasmamembraan door opzuigen cytoplasmatische inhoud in de injectiepipet E.) Injecteer terug cytoplasmatische inhoud en oplossing in de zygotische cytoplasma, totdat de meniscus een zygote diameter (b) voorbij het beginpunt bereikt . Afstand ab vertegenwoordigt ~ 7 pl van geïnjecteerde oplossing. F) een algemeen schema van een zygoot na injectie. Merk op dat de geïnjecteerde oplossing homogeen verspreid in het cytoplasma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:.. Vertegenwoordiger Figuur van een beeldveld van de geïnjecteerde zygote B Bright geïnjecteerd Zygote met Dextran-rood A)) TL-beeld van de geïnjecteerde zygote Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Aandeel van gelyseerde embryo's na Zygote Micro-injectie in twee verschillende Species Data vertegenwoordigt 4 repliceert voor de embryo's van runderen (totaal 103 geïnjecteerde zygoten) en 3 repliceert voor de schapen embryo's (in totaal 173 geïnjecteerde zygoten). Error bars vertegenwoordigt sem Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 6:. Blastocyst prijzen in runderen en schapen embryo gegevens vertegenwoordigt 4 repliceert voor de runderen met een totaal van 102 geïnjecteerd en 156 controle embryo's en 3 repliceert voor de schapen met een totaal van 163 geïnjecteerd en 239 controle embryo's. Error bars vertegenwoordigt sem Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Micro-injectie van zygoten is een bekende methode voor het introduceren van oplossingen in zoogdierlijke embryo. Bij sommige variaties afhankelijk van de soort en het doel van het experiment, kan deze techniek ruimer toegepast. We zien hoe intracytoplasmatische microinjectie uitvoeren aan laser naar de ingang van een stompe uiteinden micropipet staan. Zygoten van sommige diersoorten (zoals runderen, schapen en varkens) een donkere cytoplasma, belemmeren de visualisatie van de injectiepipet eenmaal in het embryo. Ook hun plasma membranen zeer elastisch, waardoor de penetratie met een afgeschuind puntige naald (gewoonlijk gebruikt om zygoten van knaagdieren injecteren) moeilijk te bereiken. Om deze beperkingen te overwinnen, gebruikten we een laser om de doorgang van een stomp uiteinde naald door de zona pellucida en de daaropvolgende aspiratie van cytoplasmatische inhoud mogelijk om breuk van het plasmamembraan en de vrijlating van de oplossing in het cytoplasma van embryo waarborgen. Bovendien, door injecting in de tegenovergestelde site van de naald ingang (ongeveer 3/4 in het embryo) willen we de PN verplaatsen en zo hun aspiratie / injectie te vermijden. Bovendien is dit zorgt voor meer aanspreekpunt voor de gebroken membraan te genezen, hetgeen resulteert in een lagere lysis tarieven.
Het produceren van een goede micropipetten (speciaal het injecteren pipet) en op de juiste instelling ze in de micromanipulator is de sleutel tot het bereiken van goede resultaten met deze techniek. De injectienaald kan worden gebruikt zolang de injectieoplossing glijdt binnen de naald. Soms wordt cytoplasmatische inhoud of zelfs pronuclei inhoud in de punt van de naald steken, waardoor de stroom naar onregelmatig lopen en complicerende injectie (dit verhoogt ook lysis tarieven en vertraagt het proces). Vervanging van de injectienaald wanneer dit gebeurt moet optimaal resultaat met dit protocol verkregen. De hoeveelheid tijd die de embryo's zich buiten de incubator cruciaalvaste overlevingskansen krijgen en niet meer dan 30 min. Na een opleiding en praktijk, operators bereiken doorgaans een injectie snelheid van 1-2 geïnjecteerde embryo's per minuut. Een ander belangrijk voor het succes van dit protocol is om dezelfde hoeveelheid volume oplossing per embryo consistent injecteren. Dit is gemakkelijk en nauwkeurig gecontroleerd door het waarnemen van de verplaatsing van de oplossing-oliegrensvlak meniscus. Het is belangrijk dat de pipet diameter vergelijkbaar bij manipulaties en dat de punt een regelmatige en constante diameter. Met 5 uM ID pipetten aan het uiteinde, een 7 - wordt 10 pl van de injectie volume bereikt door het injecteren van het equivalent van de lengte van een zygote's. Over-injectie resulteert vaak in embryo lysis.
Met dit protocol wordt 100% van de embryo's goed geïnjecteerd in het cytoplasma volledig vermijden valse perivitelline ruimte injecties (figuur 4). Dit maximaliseert de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de test wordt gedaan (ongeacht de geïnjecteerde oplossing) omdat de resultaten verschuldigd is enkel het effect van de geïnjecteerde oplossing en niet injectie inconsistenties. Sommige van de geïnjecteerde zygoten meestal lyseren door mechanische beschadiging tijdens injectie. Een normale tarief van de overleving na de injectie is 75% 11. Met behulp van deze methode zijn we in staat om minimaal de tarieven van de gelyseerde embryo's (Figuur 5) te krijgen. Ook blastocyst ontwikkeling vergelijkbaar waren met niet-geïnjecteerde (controle) embryo (figuur 6), dat aangeeft Injecteer geen nadelige effecten op de vroege embryonale ontwikkeling. De efficiëntie van dit protocol werd onlangs tegenover conventionele cytoplasmatische micro-injectie protocol (directe cytoplasmatische micro-injectie met een schuine spiked glazen naald zonder het gebruik van de laser te dringen de ZP) voor het injecteren van runder zygoten 5. De resultaten toonden beduidend hogere tarieven van de gelyseerde embryo's en lagere tarieven van blastocysten formatie voor de directe cytoplasmic micro-injectie. Wij geloven dat deze verschillen zijn te wijten aan minder mechanische beschadigingen tijdens de naald penetratie bij gebruik van de laser-assisted cytoplasmatische micro-injectie, waardoor dit protocol heeft de voorkeur voor het injecteren van diersoorten in ons laboratorium.
Hier presenteren we gegevens van runderen en schapen embryo's verkregen door in vitro fertilisatie, maar ook getest protocol gebruikt in-vivo en in-vitro varkens embryo verkregen vergelijkbare resultaten (gegevens niet getoond). Afhankelijk van de geïnjecteerde oplossing, kan dit protocol worden gebruikt voor vele toepassingen. Onlangs hebben we het vroeger een CRISPR / Cas9 systeem knock-specifieke genen op in-vitro bevruchte runderembryo's introduceren en vonden een groot deel van opeenvolgende blastocysten met mutaties: 50% van de embryo's (n = 6) had biallelische mutaties , 33% (n = 4) had monoallelische mutaties, en 17% (n = 2) werden wildtype 5. Dit protocol is zeer betrouwbaar is en kan worden gebruikt inverschillende soorten en talloze toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
- Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
