Introduction
microinyección citoplasmática de embriones de 1 célula es una técnica muy poderosa. Puede ser utilizado para la entrega de cualquier solución en el embrión, por ejemplo, producir genes knock-outs para estudiar la función de genes o de genes para generar animales editado. Cigotos de animales de granja agrícolas más relevantes tienen una composición de ácidos grasos muy alto que hace que su citoplasma opacos y oscuros 1. También tienen una membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características hacen que la microinyección pronuclear mediante inyección convencional / citoplasmática como se utiliza en especies de roedores difíciles y, a menudo inexactos.
Microinyección citoplasmática tiene ventajas sobre la microinyección pronuclear, ya que es más fácil de realizar y también causa menos daño a los embriones inyectados, resultando en una mayor viabilidad 2. El objetivo general de este protocolo es demostrar un método exitoso para la entrega de soluciones en el citoplasma de cigotos de animales de granja. Para ser capaz de realizarmicroinyección citoplásmica con una alta eficiencia en embriones de ganado, se utiliza un láser para generar un agujero en la zona pelúcida (ZP) y luego una aguja de vidrio de extremo romo se utiliza para la microinyección. Esta estrategia tiene como objetivo reducir el daño mecánico impreso en el embrión durante la inyección. Entonces, la aspiración del contenido citoplasmático dentro de la aguja de inyección permite la rotura eficiente y seguro de la PM asegurar que la solución se suministra en el citoplasma del embrión.
Esta técnica ya se ha utilizado con éxito en los embriones de bovino para entregar siRNA en el citoplasma cigóticos 3,4 y para generar mutaciones utilizando las repeticiones agrupadas espaciadas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) / sistema CRISPR asociado 9 sistema 5 (Cas9). También es adecuado (con modificaciones menores) para inyectar la especie bovina ovocitos cumulus-cerrado 6. A continuación, describimos nuestro protocolo de inyección entrega de un medio de contraste, que puede ser aplicable a inyectar cualquier dessolución IRED en el zigoto, y muestran que el uso de esta técnica provoca la lisis mínima y no afecta el desarrollo embrionario temprano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Producción Micropipeta
- micropipeta de inyección
- Colocar un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro externo (OD): 1,0 mm, diámetro interior (ID): 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearla.
- Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga Tapper. (Ejemplo: Calor: 825; Tire: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 500).
- Retirar con cuidado las pipetas tirados desde el dispositivo y colocarlo en un microforge en una posición horizontal.
- Llevar la pipeta accionada y el filamento calefactor microforge con su cuenta de vidrio en el foco. Utilice la retícula ocular para medir el espesor deseado y mover la pipeta horizontalmente hasta que el filamento calentador alcanza el diámetro interior de destino (5 micras).
- Ajustar el calor a aproximadamente 45% y llevar suavemente la pipeta hacia abajo de manera que toque el filamento. Activar el calentador brevemente. esta wenfermo ligeramente fundir la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto.
Nota: Ajuste de la temperatura adecuada es clave en este paso ya que las temperaturas demasiado altas harán que la curva de la pipeta y por lo tanto un corte recto no serán posibles y las temperaturas demasiado bajas no serán suficientes para fundir la pipeta (Figura 1A). - Hacer un aproximado ángulo de 30 °, cerca de la punta de la pipeta al colocarla cerca de 10 m de distancia del filamento calefactor. Ajuste la temperatura a 60% y activar el calentador.
Nota: Esto doblar la pipeta sobre el filamento. Se desea Este ángulo de modo que la punta de la aguja es paralela a la superficie de la placa de inyección cuando está montado en el inyector (Figura 1B). - Manejar pipetas de microinyección con precaución, ya que son muy afiladas y frágil.
- sosteniendo micropipeta
- Coloque una borosiliccomió capilar de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) en un extractor de micropipeta (en el centro de los titulares de derechos y capilares izquierda) y bloquearlo.
- Utilice un programa apropiado para tirar del capilar de vidrio por lo que se traduce en una punta fina con una larga incluso estrecharse y paredes paralelas (Ejemplo: Calor: 815; Tire: 20; Velocidad: 140; Tiempo: 175; Presión: 200).
- Retirar con cuidado la pipeta retirado del dispositivo extractor y colocarlo en el soporte microforge en una posición horizontal. Ajuste el enfoque en el filamento calefactor y pipeta.
- Utilice la retícula ocular para medir el diámetro de la pipeta y mover la pipeta hasta que su diámetro por encima del filamento llega a 180 micras.
- En el tamaño indicado, marcar el capilar de vidrio con una pluma de punta de diamante, y luego presione suavemente en la punta tirado para romper el vidrio. Esto debe resultar en un corte recto (Figura 1C).
- Mover la pipeta a una posición vertical con su punta cerca del filamento. Ajuste la temperatura de la microforge a 60%.
- Fuego esmalte de la punta de la pipeta usando técnicas estándar 7 hasta que alcanza una ID de 40 micras. Utilice la retícula ocular para comprobar el ID (Figura 1D).
- Hacer un ángulo de la pipeta.
- Llevar la pipeta de vuelta a una posición horizontal sobre 10 m de distancia del filamento y 5 mm de distancia de la punta. Ajustar la temperatura a aproximadamente 60% y activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se alcanza un ángulo deseado (de alrededor de 30 o). Compruebe el ángulo visual (Figura 1E).
Nota: La pipeta se monta generalmente a la microinyector en un ángulo aproximado de 60 o con respecto a la parte inferior de la placa de inyección. La punta de la pipeta se dobla de modo que es paralelo al fondo de la placa, que es necesaria para la inyección correcta del embrión en su plano medio.
- Llevar la pipeta de vuelta a una posición horizontal sobre 10 m de distancia del filamento y 5 mm de distancia de la punta. Ajustar la temperatura a aproximadamente 60% y activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se alcanza un ángulo deseado (de alrededor de 30 o). Compruebe el ángulo visual (Figura 1E).
- Compruebe que los microinyectores están completamente cargados con aceite y que no haya burbujas de aire en el sistema (burbujas en el microinyector impiden un control preciso de la inyección).
- Compruebe que los micromanipulador están en la posición central. Esto permitirá una amplia gama de movimiento de las pipetas.
- Inserte la pipeta en el soporte que sostiene micromanipulador izquierda y la pipeta de inyección en el soporte de micromanipulación derecha.
- Deje que el aceite entre en las pipetas por capilaridad y comprobar que el sistema está funcionando correctamente moviendo el petróleo hacia arriba y abajo dentro de la pipeta usando los controles microinyector.
Nota: Si no hay circulación de aceite en el interior de las agujas, puede haber una obstrucción. En este caso, utilice una aguja nueva. - Utilice los controles micromanipulador para traer las pipetas en el centro del campo de visión del microscopio. El uso de magnificación 4X, comprobar que las puntas de micropipeta están en el ángulo correcto (pan paralelo a la parte inferior del plato).
Nota: Una configuración correcta de las agujas es clave para una inyección de éxito y los resultados consistencia. - Calibrar el sistema láser siguiente manual de calibración del fabricante.
3. Preparación de plato de la inyección (Figura 2)
- Coloque una gota 50 l de calentado (37 ° C) SOF-HEPES (composición se detalla en la sección de materiales) suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS) en el centro de la tapa de un 100 mm placa de Petri. Colocar un 1 - drop l 2 de la solución a inyectar cerca de la caída de la inyección. Asegúrese de que los embriones no se enfría por debajo de la temperatura ambiente.
Nota: En este protocolo vamos a añadir el colorante rojo-dextrano a la solución de inyección para poder visualizar el sitio de la inyección y hacer un seguimiento posterior. - Cubrir las gotas en la placa de inyección utilizando aproximadamente 10 ml de aceite mineral.
- Coloque el plato de inyección en la platina del microscopio invertido y llevar el PIPETTES en la gota de inyección. Compruebe que las agujas están en foco dentro de la gota. Ajustar su altura, según sea necesario utilizando los controles micromanipulador.
- El uso de un microdispensador, cargar sobre 20-30 cigotos (17 a 20 horas después de la fecundación (HPF)) en el lado superior de la caída de la inyección. Realizar inyección a temperatura ambiente por lo que el número de embriones en la caída de la inyección se determina por la velocidad a la que la persona puede inyectar ellos. No cargue más embriones que los que se pueden inyectar en 30 min.
- Para cargar los embriones en el microdispensador, presione el émbolo completamente y sumerja la punta en la solución que contiene los embriones. Tocar los embriones para ser recogidos con la punta del capilar de vidrio (uno a la vez) y liberan lentamente el émbolo para cada embrión entra en el capilar. Repita esto hasta que todos los embriones son recogidos o la capacidad microdispensador está llena.
- Para liberar los embriones cargados, presione el émbolo suavemente hasta que todo el volumen de containing los embriones se libera del capilar.
4. La microinyección
- Usando el objetivo 4X, cargar la solución que se inyecta en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa (aspiración). Cargar solución suficiente para inyectar 2 - 3 cigotos. A continuación, pasar a la caída de la inyección.
- Dentro de la caída de la inyección, mover la pipeta que sostiene que la punta se acerca a un cigoto. Aplicar presión negativa (aspirado) con el microinyector de retención por lo que el cigoto se fija a la pipeta de sujeción y el cambio a un objetivo de 20X.
- Una vez que el cigoto se une a la pipeta de sujeción, comprobar su calidad usando la pipeta de inyección para mover suavemente el embrión alrededor sin separarlo. Un cigoto buena calidad debe tener los dos cuerpos polares (aunque a veces solamente se ve) y un citoplasma homogéneo. No se inyecte cigotos anormales (Figura 3A).
- Si es necesario, vuelva a colocar el embrión para una inyección adecuadaubicación. Un buen posicionamiento sería aquel en el que hay algo de espacio entre la ZP y la PM, por lo que la PM no se dañe por el láser.
- Compruebe que la pipeta de inyección se coloca en plano medio del embrión tocando con suavidad el cigoto en el sitio de la inyección. Si no está en su plano medio, la aguja tenderá a hacer girar el embrión en lugar de la punción. Ajuste la altura de la pipeta de inyección según sea necesario.
- Hacer un agujero en la ZP utilizando un láser (Figura 3B).
- El uso de software lugar del láser el retículo láser en el ZP donde se hará el agujero (en el lado opuesto a donde el embrión está unido a la pipeta de sujeción). Uso de la ventana de control del láser, haga clic en el botón de disparo. Asegúrese de que el tamaño del agujero es lo suficientemente grande para crear una abertura en la ZP para la aguja de pasar a través sin dañar el PM (Ejemplo: 0,662 mseg de ancho de impulso / 6,9 m Tamaño del agujero).
- Pasar la aguja de inyeccióna través del agujero en la ZP y hacer contacto con la PM. Continúe empujando la pipeta hacia adelante hasta que la aguja es ¾ de la forma en el embrión (Figura 3C).
- Observe la posición del menisco en la interfase solución de aceite, ya que esto puede utilizar para controlar constantemente el volumen de inyección.
- Aplicar presión negativa (aspirado) en la pipeta de inyección, lo que resultará en PM y el citoplasma se aspiran en la aguja de inyección. Continuar hasta que el movimiento de citoplasma en la aguja acelera o cuando el contenido de citoplasma mezclar con una solución de inyección puede ser visto. Estos indicarán la rotura de la PM (Figura 3D).
- Inyectar de nuevo el contenido citoplasmático, seguido de la solución en el citoplasma del cigoto mediante la aplicación de presión positiva (inyección), hasta que el menisco en la interfase solución de aceite ha avanzado diámetro equivalente de un cigoto pasado el punto de partida.
Nota: Bajo nuestras condiciones, esto representa aproximadamente 7 pl de solución inyectada (Figura 3E). - Cambio a un objetivo 4X y mover el inyectado embrión / s para el lado inferior de la caída de la inyección. Liberar el embrión mediante la aplicación de presión positiva en el microinyector explotación. Mantener los embriones no inyectados en el lado superior y los inyectados que están en el lado inferior de la gota para ayudar a mantener un registro de los embriones inyectados / no-inyectada y trabajar de manera eficiente.
5. Recuperación de embriones y la inyección Resultados
- Haga 3 gotas de aproximadamente 200 l en un nuevo plato con pre-calentado SOF-HEPES. Recoger los embriones inyectados usando un microdispensador (como se describe más arriba). Lavar los embriones inyectados moviéndolos a través de la SOF 3-HEPES gotas.
- Contar los embriones lisadas durante la microinyección y desecharlos.
Nota: Un cigoto se lisaron puede distinguirse fácilmente de uno intacto desde el primero aparece translúcida, llene toda la ZP, y por lo general tiene citoplasmáticacontenido de fugas hacia el exterior del embrión. - Opcionalmente, comprobar la eficacia de microinyección usando un microscopio de fluorescencia. Tenga en cuenta que la exposición a la luz UV puede provocar daños de embriones que pueden afectar el desarrollo posterior.
- Grupos de cultivo de 25 embriones inyectados en 50 gotas l de medio de optimización simplex de potasio (KSOM) suplementado con 4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) bajo aceite mineral en 38,5 ° C, 5% de CO2 en aire, y humedad de saturación.
- Complementar los medios de cultivo con 5% de SFB dos días después de la inyección.
- Compruebe blastocisto (BL) las tasas de 7 días después de la inyección. Calcular las tasas de BL como el número total de embriones de blastocisto / número total de embriones cultivados en esa gota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Asistida por láser microinyección citoplásmica es un protocolo potente y fiable para ofrecer soluciones en el citoplasma de cigotos de ganado. La figura 3 muestra un esquema general de los cigotos antes y después de la inyección, así como el esquema general de la técnica. Dextrano-rojo se utiliza como solución de la inyección para permitir sitio de seguimiento de la eficiencia y la precisión de la inyección y la inyección. El éxito de la entrega de la solución se ilustra en la Figura 4 que muestra un embrión recientemente inyectado en el que el tinte se distribuye homogéneamente en el citoplasma. Usando esta técnica 100% de los embriones se inyectan en su citoplasma.
Este protocolo ha demostrado tener tasas de lisis mínimos en zigotos bovinos y ovinos. Sólo 15,6 ± 5 y 5,8 ± 3,9% de los embriones inyectados fueron lisadas en ganado vacuno y ovino, respectivamente, como resultado de la microinyección
Estos resultados indican que la inyección intracitoplasmática asistida por láser causa daños mínimos durante la inyección y los resultados de las tasas de desarrollo de blastocistos normales.
Figura 1: un esquema general que muestran cómo hacer la explotación y pipetas de inyección. AB) de la pipeta de inyección, CE) Sosteniendo la pipeta. A) toca suavemente el filamento con la pipeta tirado en el diámetro deseado (5 micras). Activar el calentador brevemente (demostrada en O distancia). Esto derretirá ligeramente la pipeta por lo que se adhiere al filamento y tras el enfriamiento, la pipeta se romperá en el punto de contacto la generación de un corte recto. B) Hacer y el ángulo en la pipeta de aproximadamente 0,5 cm de distancia de su punta por el posicionamiento de la pipeta sobre 10 m de distancia del filamento calentador. Calentar hasta que se alcanza el ángulo deseado. C) Utilizar una pluma de punta de diamante para marcar y cortar la pipeta de sujeción en el diámetro deseado (180 micras). D) en posición vertical, extinción de esmalte de la punta de la pipeta de sujeción hasta que se alcanza el diámetro deseado interna (40 micras). e) forman un ángulo de la pipeta con lo que la pipeta nuevo a una posición horizontal un par m de distancia del filamento y aproximadamente 0,5 cm de distancia de la punta. Activar el calentador para doblar la pipeta sobre el filamento. Continuar calentando hasta que se consigue el ángulo deseado. Ver 8,9,10 para obtener más detalles sobre cómo hacer que las agujas.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:.. Configuración general del Plato inyección Disposición de las pipetas, gotas, y los embriones se muestran en este dibujo favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Intracitoplasmática de protocolo de inyección asistida por láser A) Un diagrama general de un cigoto unido a la pipeta de sujeción antes de la inyección. PB: cuerpos polares, ZP: zona pelúcida, Cit: citoplasma, PN: pronúcleos, PM: Membranas de plasmae, HP: sosteniendo la pipeta, IP:. pipeta de inyección BE) pasos de microinyección: b) realizar un orificio en la zona pelúcida de un cigoto unido a la pipeta de sujeción usando un láser C) Introducir la pipeta de inyección hacia el lado opuesto del embrión. . Posición del menisco (a). D Verificar) Romper la membrana plasmática mediante la aspiración de contenido citoplasmática dentro de la pipeta de inyección. E) Inyectar de nuevo contenido citoplásmico y la solución en el citoplasma cigóticos, hasta que el menisco alcanza un diámetro de cigoto (b) más allá del punto de partida . Distancia ab representa ~ 7 pl de solución inyectada. F) Un diagrama general de un cigoto después de la inyección. Tenga en cuenta que la solución inyectada se extiende de forma homogénea en el citoplasma. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:.. Figura Representante de un cigoto inyectado con dextrano-roja A) Imagen de campo brillante del cigoto inyectada B) Imagen fluorescente del cigoto inyectada Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Proporción de lisaron embriones después de la microinyección de cigotos en dos diferentes especies de datos representa 4 repeticiones para los embriones de bovinos (un total de 103 cigotos inyectados) y 3 repeticiones para los embriones ovinos (total de 173 cigotos inyectados). Las barras de error representan sem favor, haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Blastocito Tarifas en embriones bovinos y ovinos de datos representa 4 repeticiones para la especie bovina con un total de 102 y 156 embriones inyectados de control y 3 repeticiones para la especie ovina, con un total de 163 y 239 embriones inyectados de control. Las barras de error representan sem favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La microinyección de cigotos es un método bien establecido para la introducción de soluciones en embriones de mamíferos. Con algunas variaciones dependientes de la especie y el objetivo del experimento, esta técnica se puede utilizar ampliamente. Mostramos cómo realizar la microinyección intracitoplasmática de usar un láser para ayudar a la entrada de una micropipeta de extremos romos. Los cigotos de algunas especies de ganado (tales como ganado vacuno, ovejas y cerdos) tienen un citoplasma oscuro, dificultando la visualización de la pipeta de inyección una vez dentro del embrión. Además, sus membranas plasmáticas son muy elásticas, por lo que su penetración con una aguja de punta biselada (generalmente se usa para inyectar cigotos de especies de roedores) difícil de lograr. Para superar estas limitaciones, se utilizó un láser para permitir el paso de una aguja de extremo romo a través de la zona pelúcida y la posterior aspiración de contenido citoplásmico para asegurar la rotura de la membrana plasmática y la liberación de la solución en el interior del citoplasma del embrión. Por otra parte, por injecting en el sitio opuesto de la entrada de la aguja (aproximadamente 3/4 en el interior del embrión) nuestro objetivo es desplazar el PN y evitar así su aspiración / inyección. Además, esto proporciona mayor punto de contacto para la membrana rota para sanar, lo que resulta en tasas más bajas de lisis.
La producción de buenos micropipetas (especialmente la pipeta de inyección) y apropiadamente colocarlos en el micromanipulador es clave para lograr buenos resultados con esta técnica. La aguja de inyección se puede utilizar durante el tiempo que la solución de inyección se mueve suavemente dentro de la aguja. A veces, el contenido de contenido o incluso pronúcleos citoplásmica se queda atascado en el interior de la punta de la aguja, haciendo que el flujo se ejecute de forma desigual y complicando de inyección (esto también aumenta las tasas de lisis y retrasa el proceso). Cambio de la aguja de inyección cuando esto ocurre es necesario para obtener resultados óptimos con este protocolo. La cantidad de tiempo que los embriones están fuera de la incubadora es crucialpara obtener tasas de supervivencia consistentes y no debe exceder de 30 minutos. Después de la formación y la práctica, los operadores suelen alcanzar una velocidad de inyección de 1-2 embriones inyectados por minuto. Otro punto clave para el éxito de este protocolo es inyectar constantemente la misma cantidad de volumen de solución por embrión. Esto se controla fácilmente y con precisión mediante la observación del desplazamiento de la interfaz de menisco solución de aceite. Es importante que el diámetro de la pipeta es coherente entre manipulaciones y que la punta tiene un diámetro regular y constante. Con 5 pipetas ID M en la punta, un 7 - 10 l de volumen de inyección se consigue inyectando el equivalente a la longitud de un cigoto. El exceso de inyección a menudo resulta en la lisis de embriones.
El uso de este protocolo, el 100% de los embriones se inyectan correctamente en el citoplasma, evitando completamente falso perivitelino inyecciones espaciales (Figura 4). Esto maximiza la fiabilidad y reproducibilidad del ensayo se realiza (independientemente de la solución inyectada) ya que los resultados se deben únicamente al efecto de la solución inyectada y no a inconsistencias de inyección. Algunos de los cigotos inyectados generalmente lisar debido a los daños mecánicos durante la inyección. Una tasa habitual de la supervivencia después de la inyección es del 75% 11. Usando este método, somos capaces de conseguir tasas mínimas de embriones lisadas (Figura 5). Además, las tasas de desarrollo de blastocistos fueron comparables a no inyectado (de control) de embriones (Figura 6), que denota que la técnica de inyección no tiene efectos perjudiciales sobre el desarrollo embrionario temprano. La eficiencia de este protocolo fue recientemente en comparación con el protocolo de microinyección citoplasmática convencional (microinyección citoplasmática directa utilizando una aguja de vidrio de punta biselada sin el uso del láser para penetrar de ZP) para la inyección de cigotos bovinos 5. Los resultados mostraron tasas significativamente mayores de embriones lisadas y menores tasas de formación de blastocistos para el cytopl directamicroinyección asmic. Creemos que estas diferencias se deben a un menor daño mecánico durante la penetración de la aguja cuando se utiliza la microinyección citoplasmática asistida por láser, haciendo de este protocolo el preferido para la inyección de las especies de ganado en nuestro laboratorio.
A continuación, presentamos los datos para los embriones de bovinos y ovinos obtenidos por fecundación in vitro en ejercicio, sino que también hemos probado usando el protocolo in vivo e in vitro de embriones porcinos obteniendo resultados similares (datos no mostrados). Dependiendo de la solución inyectada, este protocolo se puede utilizar para muchas aplicaciones. Recientemente, hemos utilizado para introducir un sistema de CRISPR / Cas9 que ronda los genes específicos en fecundado in vitro de embriones de bovino y se encontró una alta proporción de blastocistos secuenciados con mutaciones: el 50% de los embriones (n = 6) tenían mutaciones bialélicas , el 33% (n = 4) tenían mutaciones monoallelic, y el 17% (n = 2) fueron de tipo salvaje 5. Este protocolo ha sido muy fiable y se podría utilizar envarias especies y aplicaciones innumerables.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
- Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
