Introduction
Biologisk forskning kræver ofte effektiv fænotypebestemmelse, som ofte er forbundet med en slags histologisk analyse 1-3. Dette behov er endnu mere indlysende med de ambitiøse projekter til at forstyrre hvert gen i mus genom 4. Disse histologiske analyser kan spænde fra vurderingen cellemorfologi og / eller anatomiske træk til kortlægning ekspression af specifikke gener eller proteiner til de enkelte celler. Faktisk er en af de grundlæggende bidrag histologi til genomområdet er evnen til at associere en specifik molekylær signal til en bestemt region eller celletype.
Traditionelle metoder til histologi, især for muskuloskeletale væv, er ofte tidskrævende og besværlig, kræver nogle gange uger til at fastsætte, afkalke, sektion, bejdse, og image prøven derefter analysere billederne via menneskelig fortolkning. Analyse multiple molekylære signaler, enten via immunhistokemi, in situ hybridization, eller specielle pletter, kræver flere sektioner og endda flere prøver til at udføre korrekt. Desuden er disse flere svar kan ikke være co-lokaliseret til den samme celle og undertiden kan ikke være co-lokaliseret til en specifik region i en given prøve. Da genomforskning og Epigenomics felt bevæger sig ind i den digitale tidsalder, skal den histologiske felt også følge trop for at yde effektiv, high-throughput, og automatiseret analyse af en række molekylære signaler inden for en enkelt histologisk snit.
Faktisk er der et behov for forbedrede histologiske teknikker, der kan knytte flere molekylære signaler til specifikke celler inden en given prøve. For nylig har vi udgivet en ny high-throughput cryohistological metode til at vurdere flere respons foranstaltninger inden for en given sektion fra mineraliseret væv 5-14. Processen indebærer stabilisering kryosektionen med frosne cryotape, vedhængende tapede sektion stift til et objektglas, ogudførelse flere runder af farvning og billeddannelse på hver sektion. Disse runder af billeder er derefter justeret manuelt eller via computer automatisering inden billedanalyse (figur 1). Her præsenterer vi detaljerede protokoller i denne proces, og give eksempler, hvor disse teknikker har forbedret vores forståelse af forskellige biologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The University of Connecticut Health Center institutionel dyr pleje og brug Udvalget godkendte alle dyreforsøg.
1. Fiksering og Indlejring
- Aflive dyret via CO 2 kvælning eller andre godkendte metoder.
- Høst vævet af interesse (f.eks lemmer, ryghvirvler, etc.) og anbring i 10% neutral bufferet formalin ved 4 ° C, indtil korrekt fast. Vær særlig opmærksom på at opretholde konsekvent anatomisk placering før fiksering. For eksempel fastsætte lemmer med fuger på konsekvent fleksion, intern rotation, og ekstern rotation vinkler 11. Typisk fix hele mus lemmer for 1 - 3 dage.
Advarsel: Formalin er giftigt og bør håndteres i et stinkskab, mens iført egnede personlige værnemidler.
Bemærk: Tidsrammen for fiksering afhænger af størrelsen af prøven. Hvis eksperimentet tillader, vil skære åben knoglen forbedre fiksering af marv rum.Nogle prøver kan kræve perfusion fiksering 15 for at minimere fluorescerende baggrund (f.eks svage fluorescerende signaler inden knoglemarven). - Transfer enheder fra formalin til 30% saccharose lavet i 1x PBS og inkuberes i 12 - 24 timer ved 4 ° C.
Bemærk: Når inkuberet i 12 - 24 timer, kan prøverne derefter placeres ved -80 ° C til langsigtet opbevaring. Denne metode anbefales af lagerplads til forsøg, hvor forskere ønsker at indsætte flere prøver i den samme blok, men kan ikke høste alle disse prøver på samme tid (f.eks eksperimenter med forskellige tidspunkter). - Fjern prøver fra saccharose og dissekere det overskydende væv.
- Fyld en kryoformen (størrelse af mug er afhængig af modellen størrelse) en del af vejen med kryo indlejring medium. Anbring prøven i støbeformen, således at skæreplanet for regionen af interesse er parallel med bunden af formen.
Bemærk: Et eksempel på specifikke væv placering og orienteringkan findes i figur 2A - B. - Placer kryoformen på et stykke tøris indtil et tyndt lag af kryo indlejring mellemstore fryser og efterfølgende løser prøven på plads. Fyld den resterende mængde kryoformen med kryo omsluttende medium under opretholdelse kryoformen på tøris pellet.
- Placer kryoformen i en beholder indeholdende 2-methyl-butan forkølet af tøris. Når prøver helt frosset, fjerne cryomolds og ryst overskydende 2-methyl-butan. Wrap cryomolds i cellofan og anbringes i en -20 ° C eller -80 ° C fryser for lagring.
Bemærk: Prøver kan udtørre over tid ved opbevaring i cryo omsluttende medium, især ved -20 ° C. Vi anbefaler opbevaring af prøver i mere end 1 - 2 måneder cryo indlejringsmedium ved -80 ° C eller i 30% saccharose ved -80 ° C (se trin 1.3).
2. Tape-stabiliseret vævssektionering
- Fjern eksemplar blokke fra fryseren og læg i cryostat med temperaturen indstilles mellem -20 og -25 ° C.
- Tag blok fra kryoformen og trimme væk overskydende cryo indlejring medium med et barberblad.
- Placere nogle cryo omsluttende medium på objektpladen og ret blokken således at overfladen af emnet disken er parallel med bundfladen af blokken derved bestemme den korrekte skæreplanet for regionen af interesse.
- Placer objektpladen i kryostaten og muliggøre kryo omsluttende medium til at fryse.
- Placer prøven disk objekthovedet og justere hovedet, således at skærer parallelt med overfladen af prøven blokken.
- Trimme blok ned til et niveau inden for området af interesse og børst eventuelle spåner fra overfladen af blokken.
- Skær et stykke af cryotape store nok til at dække området af interesse og præ-chill i kryostaten.
Bemærk: Flere stykker kan skæres af sammenhængende størrelser og oplagres i cryostpå under sektionering. - Fjern ikke-klæbende opbakning fra cryotape ved at gribe tapen af de ikke-klæbende sølv / guld faner bruger pincet derefter placere tapen på blokken klistrede nedad.
- Påfør tryk på cryotape hjælp valsen (Figur 2C).
- Foretag en sektion (5 - 8 um) under anvendelse af enten den automatiske motor eller manuel skærehjul af kryostaten.
Bemærk: Det er god praksis at holde kanten af cryotape som det kommer ind på scenen, således at afsnittet ikke falder ned fra scenen under sektionering (figur 2D). - Placer vævssnittet opad på en plast mikroskopobjektglas inden kryostaten.
- Fjern plastik objektglasset fra kryostat og tillade kryo omsluttende medium til at smelte, således at sektionen klæber til overfladen af objektglasset.
- Gentag sektionering for serielle snit eller andre områder af interesse.
- Når færdig, gemmer sektionerne i et dias kasse ett 4, -20 eller -80 ° C afhængigt af længden af opbevaring kræves, og de nedstrøms modforanstaltninger. For eksempel bruger dias, der vil blive farvet for enzymatisk aktivitet (se 5,2-5,3) inden for en måned, hvis den opbevares ved 4 ° C.
3. Adhæsion af Sektioner til objektglas
- UV-hærdeligt klæbemiddel metode.
- Mærk mikroskopobjektglasset.
Bemærk: For øget automatisering, prøver og dias kan mærkes med stregkoder. - Påfør en dråbe UV-aktiverede optisk klæbemiddel til to glasplader og bruge kanten af en plast slide til at sprede et tyndt lag klæbemiddel hen over overfladen af objektglas.
- Skær / guld fanen sølv og lægge tapede vævssnittet side op på limen af det første dias. Påfør sektion i en rullende bevægelse fra den ene kant til den anden for at minimere dannelsen af indespærrede bobler nedenunder båndet.
BEMÆRK: Første slide bruges til at pre-fugte undersiden af than tape forud for at placere den på den anden (permanent) dias (trin 3.1.4). - Fjern tapede afsnit fra første dias og placere den på det klæbende lag af den anden glider (figur 3A). Igen, sørge for at undgå indfangning af bobler.
BEMÆRK: Dette trin kræver øvelse at mestre. - Når det passende antal sektioner for den givne eksperiment er placeret på hver slide, tørre overskydende lim fra de omkringliggende områder.
- Undersøg hver sektion nøje for bobler eller fibre nedenunder båndet. Udfør denne inspektion under et mikroskop eller forstørrelsesglas. Hvis der er forhindringer, fjern den enkelte sektion, fjerne forhindringer, og derefter genanvende det til objektglasset.
- Når det fastslås, at der ikke er forhindringer under tapede sektioner, placere objektglas under UV sort lys i 5 - 10 min til tværbinding af klæbemidlet.
- Mærk mikroskopobjektglasset.
- Chitosan klæbende metode.
- Forbered the 1% chitosan klæbemiddel. Forbered eddikesyreopløsning ved opløsning 0,25 ml koncentreret eddikesyre i 100 ml DI-vand (0,25% v / v). Opløs 1 g chitosan pulver i 100 ml eddikesyre-opløsning og omrør opløsningen O / N eller indtil al chitosan pulveret er opløst.
BEMÆRK: Løsningen er stabil ved stuetemperatur. - Indbetal en dråbe af chitosan løsning for hvert afsnit, som vil blive placeret på objektglasset.
- Skær fanen sølv / guld af båndet og placere hver tapede sektion væv side op på limen (figur 3A). Brug stor omhu for at undgå indfangning af bobler.
- Når alle sektioner er placeret på dias, vippe slide op på en af sine lange kanter og træk overdreven chitosan til den nederste kant med pincet.
- Anbring objektglassene i denne orientering oven på et stykke køkkenrulle i et dias boks. Gravity vil så bevirke, at overskydende chitosan til at falde ned på håndklædet, hvilket giver en flad og ensartet lag af chitosan.
- Place objektglasset kassen med låget holdes åben i køleskabet O / N at tillade chitosan tørre.
BEMÆRK: Se tabel 1 for en sammenligning mellem de to klæbende metoder.
- Forbered the 1% chitosan klæbemiddel. Forbered eddikesyreopløsning ved opløsning 0,25 ml koncentreret eddikesyre i 100 ml DI-vand (0,25% v / v). Opløs 1 g chitosan pulver i 100 ml eddikesyre-opløsning og omrør opløsningen O / N eller indtil al chitosan pulveret er opløst.
4. Anvendelse af referencemarkørerne til Slides
- Forbered referencemarkør opløsning ved opløsning af 50 pi grøn og 50 pi røde mikrokugler i 100 pi vand. løsningen i mørke ved 4 ° C opbevares.
- Placer en 10 pi eller 20 pi pipettespids i mikrosfæren opløsning. Tilføj en lille dråbe mikrosfæren opløsning til hver sektion støder op til området af interesse (figur 3C). Vær omhyggelig med at ikke få mikrokugler i regionen af interesse.
- Tør dias ved RT (beskyttet mod lys) i 30 min, hvis behandling af dias på den pågældende dag. Hvis ikke, skal du placere dias i et dias boks ved 4 ° C.
Bemærk: Så længe mikrosfære løsningen tørrer før fugtgivende dias, den microspheres forbliver overholdt dias under flere runder af farvning / billeddannelse.
5. Flere runder af Farvning
BEMÆRK: Ved at vælge en kompatibel sekvens af billeddannelse, farvning, og reimaging trin, er det muligt at detektere og co-lokalisere mange biologiske signaler på samme vævssnit. Hver runde af imaging / farvning / reimaging skal udvikles til den særlige histologiske spørgsmål. Den billedbehandling / farvning / reimaging sekvens involverer typisk erhverve de endogene fluorescerende signaler (f.eks cellulære GFP, mineralisering farvestoffer, in vivo imaging prober) på den første runde af imaging efterfulgt af fluorescerende multiplex immunfarvning og flere runder af enzymatiske aktivitet pletter. Endelig kan sektionen farves ved anvendelse af kromogene farvestoffer (fx H & E, toluidinblåt, safranin O, etc.) for at fremhæve vævet arkitektur. Præsenteret i dette afsnit er brugerdefinerede metoder tilpasset frakommercielt tilgængelige protokoller.
- Calcein blåfarvning af akkumulerede mineral
BEMÆRK: Calcein blåfarvning giver en konsistent mineral overflade, der er modtagelig for automatiseret billedanalyse modsætning mørkefelt eller differential interferens kontrast (DIC) billeddannelse. Problemet med calcein blåfarvning er, at den fluorescerende spektrum overlapper med tetracyclin og Demeclocycline mærkning. Derfor, hvis prøven indeholder disse mineralske etiketter, billede etiketterne i den første runde af imaging før farvning med calcein blå.- Hvis de endogene signaler i vævet afbildes forud for denne farvning trin, nedsænkes dias fra den forrige billedbehandling rundt i en Coplin-skål fyldt med 1 x PBS indtil dækglas falder væk fra dias. Fjern og tørre dækglas.
- Forbered 30 mg / ml af calcein blå opløsning i 2% NaHCO3 (fremstillet ved opløsning af 2 g NaHCO3 i 100 ml H2O og justering til pH 7,4 med HCI). Alikvot og opbevar opløsningen ved -20 ° C.
- Fordyb dias i en Coplin-skål, der indeholder 1x PBS i 15 min til hydrat sektionerne, hvis det ikke allerede hydreret fra forrige runde.
- Fjern dias og tør ryggen og kanter med en køkkenrulle.
- Påfør 100 - 500 pi calcein blå opløsning pr slide og inkuberes i 10 minutter i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.
- Skyl dias i 1x PBS i 10 min med 3 ændringer.
- Anvend ~ 200 pi 50% glycerol i 1x PBS til hvert dias og montere dækglasset.
- Fjern overskydende glycerol og tørre bunden af objektglassene.
- Tartrat-resistent syrephosphatase (TRAP) enzymatisk aktivitet farvning
BEMÆRK: TRAP udtrykkes af flere celletyper i en hæmatopoietisk linje, herunder osteoclaster. TRAP-farvning præsenteres her anvender en gul fluorescerende syrephosphatase substrat. Visse fluorescerende signaler ovERLAP med brugerdefinerede gule filter sæt med tetracyclin / Demeclocycline mineralisering etiketter, calcein blåsplint og DAPI kontrastfarve.- Sænk slides fra den forrige billedbehandling rundt i en Coplin-skål fyldt med 1x PBS indtil dækglas falder væk fra dias. Fjern og tørre dækglas.
- Forbered buffer 1 ved at opløse 9,2 g vandfrit natriumacetat og 11,4 g natriumtartrat dibasisk dihydrat i vand og bringe slutvolumenet til 1000 ml. PH justeres til 4,2 med koncentreret iseddikesyre (~ 1,5 - 2 ml). opløsningen ved 4 lagre ° C i op til 12 måneder.
- Forbered Buffer 2 ved at opløse 40 mg natriumnitrit i vand og bringe slutvolumenet til 1 ml. opløsningen ved 4 ° C i op til 1 uge lagre.
- På dagen for farvning, forberede reaktionsbuffer ved blanding 7,5 ml buffer 1 og 150 pi puffer 2.
- Påfør reaktionspuffer uden substratet til objektglassets i 10 - 15 min til ækvilibrering af vævet ved lavere pH.
BEMÆRK: Den typiske volumen er ~ 200 pi, men skal være stort nok til at dække alle sektioner. - Fortynd gult fluorescerende syrephosphatase substrat mellem 1:50 og 1: 100 i reaktionspuffer.
BEMÆRK: Fortynding vil blive dikteret af TRAP aktivitet i prøven. - Hæld reaktionsblandingen buffer off af objektglassene og anvende reaktionsbuffer med den gule fluorescerende substrat til objektglassene.
- Objektglassene anbringes under UV sort lys for ~ 5 min at aktivere underlaget.
BEMÆRK: Inkubationstid kan variere TRAP aktivitet i prøven. - Skyl dias i 1x PBS i 10 min med 3 ændringer.
- Anvend ~ 200 pi 50% glycerol i 1x PBS til hvert dias og montere dækglasset.
- Fjern overskydende glycerol og tørre bunden af objektglassene.
BEMÆRK: Den sure TRAP buffer vil afkalke sektionerne. Den ekstra fordel af decalcification er, at visse farver vil være til rådighed igen for downstream farvning (f.eks mineralisering etiketter). For eksempel vil calcein blåfarvning fjernes under TRAP-farvning. Derfor kan DAPI kontrastfarve afbildes i denne kanal under en efterfølgende runde.
- Alkalisk phosphatase (AP) enzymatisk aktivitet farvning
BEMÆRK: Flere celletyper involveret med mineralisering herunder osteoblaster og mineralisering chondrocytter udtrykker AP. Fast Red substrat, der anvendes i denne protokol fremkalder både en fluorescerende rød og kromogene rødt signal. På grund af dette, vil det kromogene substrat slukke fluorescerende signaler i de regioner, hvor substratet udfælder. Derfor er det bedst at gøre dette plet efter billeddannelse de fluorescerende signaler, der kan standses ved AP-substrat.- Sænk slides fra den forrige billedbehandling rundt i en Coplin-skål fyldt med 1x PBS indtil dækglas falder væk fra dias. remove og tør dækglas.
- Forberede 1 M Tris ved opløsning 12,1 g Tris i 100 ml vand. Indstil pH til 9,5 med 1 M NaOH.
- Forberede 1 M MgCl2 hexahydrat ved opløsning 20,33 g MgCl2 i 100 ml deioniseret vand.
- Forbered 2 M NaCl ved opløsning 11,68 g NaCl i 100 ml deioniseret vand.
- Forbered 100x (20 mg / ml) stamopløsning af Fast Red TR-salt ved at opløse 1 g pulver i 50 ml deioniseret vand. Gør 100 pi alikvoter og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered 100x (10 mg / ml) Naphthol AS-MX fosfat stamopløsning ved at opløse 500 mg pulver i 50 ml N, N dimethylformamid. Gør 100 pi alikvoter og opbevares ved -20 ° C.
- På dagen for farvning, forberede AP puffer ved tilsætning af 1 ml 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl2, 0,5 ml 2 M NaCl og bringe slutrumfanget til 10 ml under anvendelse deioniseret vand (slutkoncentrationer: 100 mM Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
- Placer AP Buffer på hvert objektglas og inkuberes i et fugtigt kammer i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered AP substratbuffer ved at fortynde 100x lagre af Fast Red TR Salt og Naphthol AS-MX til 1x i AP puffer.
- Hæld AP buffer ud af dias og erstatte med AP substratbuffer. Inkuberes slides i 5 - 10 min i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Inkubationstid vil blive dikteret af AP aktivitet af prøven. - Wash slides 3x i 1x PBS i 5 minutter hver.
- Mount dækglas med DAPI kontrastfarvning opløsning (1: 1.000 fortynding af DAPI i 50% glycerol i 1x PBS).
- Toluidinblåt O (TB) kromogent farvning
BEMÆRK: Da alle tidligere trin afbildet under midlertidig vandig montering i 50% glycerol / PBS opløsning, det kromogene skridt også afbildet under vandige betingelser. Imidlertid kan farvningsopløsningen tendens til at sive ud med tiden. Derfor foreslås det at afbilde toluidinblåt snarest muligt efter farvning.- Sænk slides fra forrige billedbehandling rundt i en Coplin-skål fyldt med deioniseret vand, indtil dækglas falder væk fra dias. Fjern og tørre dækglas.
- Efter fjernelse af dækglas, erstatte med frisk vand og inkuber objektglassene i mindst 10 min, således at salte fra PBS er tilstrækkeligt fjernet fra vævet.
- Forbered 0,025% TB opløsning i deioniseret vand.
- Objektglassene anbringes i TB opløsning til 1 - 5 min.
BEMÆRK: Inkubationstiden er afhængig af brugerens præferencer, men bør holdes konsistent på tværs af alle prøver. - Anbring objektglassene i Coplin-skål med deioniseret vand og skylning af objektglas 3x i 5 min hver.
- Mount dækglas med 30% glycerol opløst i deioniseret vand (IKKE 1x PBS da dette vil medføre pletten udvaskes ud fra vævet). BEMÆRK: Glycerol monteringsmedium kan være substitueret med fructose syrup, som hjælper med at forhindre diffusion af pletten fra vævet. Tilforberede fructosesirup, opløses 30 g fruktose i 10 ml deioniseret vand og opvarm til 60 ° C indtil opløsning.
6. Flere runder af Imaging
- Læg glider ind mikroskop bakker (Figur 3D).
Bemærk: Bakkerne er fjederbelastet. - Sæt bakkerne i bakken stak af det slide-scanning mikroskop (figur 3E).
- Klik på profillisten at indlæse en profil for hvert dias med passende tidspunkter eksponering for hver fluorophor. Klik på det dias navn for at navngive hvert dias manuelt eller har den software læse stregkoden findes på dias etiketten. Klik på startknappen forhåndsvisning scanning at tage et eksempelbillede af dias.
- Indstil regioner af interesse i guiden vævet afsløring og gemme dem til senere runder af billeddannelse. Når hvert dias er setup, starte scanningen ved at klikke på knappen Start scanning.
Bemærk: Systemet kan indeholde op til 100 SLIdes på et tidspunkt. - Når billedbehandling er færdig, eksportere billederne fra hver enkelt kanal og billedbehandling runde som .tif eller .jpg-filer til billede samling og analyse.
7. Billede Assembly
- Manuel metode ved hjælp af Photoshop (eller lignende software billedredigering stand til at producere lagdelte billeder).
- Åbn hver enkelt kanal billede fra hver imaging runde.
- Saml de enkelte billeder som lag i en sammensat billede. For at gøre dette, skal du klikke på lag i lag paletten fra et billede. Træk derefter lag på et andet billede. Denne træk og slip operation vil oprette et nyt lag i billedet. Gør dette for alle andre billeder. Alternativt kan du bruge et script (Filer> Scripts> Indlæs filer i stak ...) for at automatisere denne proces ved at indlæse flere billedfiler som lag i et billede stack.
- Når hvert billede er opført som en individuel lag i det sammensatte billede, at dobbeltklikke på lagets navn omdøbe layers efter behov for at skelne de forskellige kanaler.
- For at se gennem hvert lag og skabe en virkelig sammensat billede, ændre blend mode for hvert lag fra "Normal" til "skærm" i laget paletten.
Bemærk: For at fremskynde dette trin, ændre et enkelt lag til at screene, højreklik på laget, skal du vælge "copy layer style", så fremhæve alle andre lag og vælg "indsæt lag stil" at anvende skærmen stil til den anden lag. - Hvis det ønskes, reduceres opaciteten (ændre værdien til 10 - 40%) af det kromogene lag (dvs. toluidinblåt) bedre at visualisere de fluorescerende signaler gennem det chromogene lag.
Bemærk: Den flisebelagte scanning mikroskop anvendes i denne protokol holder dias på 3 kanter, og derved minimere mængden af rotation, der kan forekomme til dias i hver runde af billeddannelse. Derfor er det meget lettere for brugeren manuelt justere billeder uden at skulle rotere billeder afledtfra forskellige runder af billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generel Workflow for High-gennemløb, Multi-Image Cryohistology
Figur 1 viser den overordnede arbejdsgang anvendes til denne teknik. Det omfatter flere trin fra fiksering gennem flere runder af billedbehandling og endelig billede justering / analyse. Processen kan tage så lidt som en uge til at gå fra prøven fiksering gennem 4 runder af billedbehandling, hvilket er mindre tid end det tager at afkalke disse type prøver. Rækkefølgen af imaging begynder typisk med de endogene signaler, der allerede er i prøven (f.eks GFP'er, mineralisering etiketter, etc.), så multiplex fluorescerende immunfarvning efterfulgt af fluorescerende enzymatisk aktivitet analyser (f.eks., TRAP, AP, etc.) og cellecyklus analyse analyser (f.eks EDU) og endelig afsluttes med et kromogent plet (f.eks toluidinblåt O, hematoxylin, safranin O, etc.).
Repræsentant Eksempel fra en Juvenile ankelleddet 6
Formålet med denne særlige undersøgelse var at demonstrere korrelationen mellem ekspression af forskellige typer af collagen (dvs. COL1A1, COL2A1 og Col10a1) med mineralisering af fiberbrusk af achillessenen-til-knogle insertionssted (dvs. enthesis). Derfor blev en tredobbelt transgen fluorescerende reporter mus herunder COL1A1-GFPTpz, COL2A1-FFP, og Col10a1-mcherry bruges til at identificere celler, der udtrykker hver transgen. Den første runde af billeddannelse var af den endogene transgenekspression fra en to uger gammel mus, hvilket svarer til, når enthesis mineralizes i akillessenen (figur 4B). Den anden runde af billeddannelse blev dernæst udført på denmultifoton mikroskop for at erhverve billeder af kollagen arkitektur via to foton anden harmoniske generation (SHG, figur 4C). Dette trin blev anvendt til at identificere celler ved basis af collagenfibrene i enthesis. Den tredje runde af billeddannelse var en immunfarvning skridt for Indian hedgehog (IHH), som er en af de vigtigste signaling ligander, som fremmer mineralisering af enthesis (figur 4D). Den fjerde runde af billeddannelse var AP-farvning ved anvendelse af en blå alkalisk phosphatase-substrat kit, som fremkalder både Cy5 fluorescens og blå chromogene signaler, for at visualisere områder med aktiv mineralaflejring (Figur 4E). Endelig den femte runde af billeddannelse var TB-farvning for at visualisere anatomiske træk, herunder proteoglycanindhold i fiberbrusk (Figur 4F). Alle billeder blev manuelt justeret inden billedredigeringsprogram. De fem runder af imaging blev gennemført over en periode på 4 dage, der fulgte 3dage prøve forarbejdning og udskæring (7 dage i alt).
Repræsentant Eksempel fra en voksen Knæleddet 11
Formålet med dette forsøg var at bestemme mineraliseringen forandringer, der sker i enthesis af det mediale kollaterale ligament (MCL) af knæet følgende fælles destabilisering via overskæring af forreste korsbånd (ACL). Mineralisering ændringer kan ses i MCL enthesis så tidligt som to uger efter operation i disse 3-måneder gamle mus. Til overvågning mineralappositionshastighed af fibrobrusk i enthesis, blev et mineral etiket givet til musene på dagen for kirurgi (demeclocyclin) og dagen før aflivning (calcein) ved 2 uger efter operation. Musene omfattede også COL1A1-FFP og Col10a1-mcherry fluorescerende reportere til at overvåge kollagen udtryk for umineraliseret og mineraliseret fibrochondrocytes henholdsvis. Den første runde af billeddannelse var de endogene signaler, som i dette tilfælde svarede til de fluorescerende proteiner og fluorescerende mineralisering etiketter (figur 5A). Den anden runde inkluderet TRAP-farvning til at påvise ekspression af dette enzym i mineraliseringsmidler fibrochondrocytter i enthesis samt osteoklaster i den underliggende knoglemarv (figur 5B). Den tredje runde var AP farvning at demonstrere regioner af aktiv mineralisering af fibrochondrocytter samt osteoblaster af den underliggende knogle (figur 5C). Endelig blev TB farvning gennemført for fjerde runde (figur 5D). Alle billeder blev manuelt justeret inden billedredigeringsprogram. Igen den samlede tid taget fra væv høst til billedet justering var 7 dage.
Repræsentativt eksempel på trabekulær knogle fra distale femur
(figur 3B). Denne proces blev udført på 8 kvinder og 8 mænd mus ved 3 forskellige niveauer i knoglemarven, hvilket gav et samlet antal på 12 objektglas. De referencemarkørerne (mikrosfærer) blev anvendt inden for epifysen og mid-diafysen på de tørre sektioner (figur 3C). Alle 12 objektglas blev farvet for calcein blå og filmede for akkumulerede mineral (calcein blå) og mineralisering etiketter (calcein og alizarin complexon) i den første runde af imaging (figur 6A). Glassene blev derefter filmede for TRAP-aktivitet (figur 6B) i anden runde og AP-aktivitet (figur 6C) i tredje runde af billeddannelse. Endelig blev objektglassene farvet med toluidinblåt i fjerde runde (fig 6D). De referencemarkørerne blev afbildet i løbet af hver billedbehandling runde, herunder kromogene runde, og blev justeret ved hjælp af brugerdefineret software. At give en idé om throughput for denne procedure, 32 knogler (16 lårben og 16 ryghvirvler) blev indlejret i 8 blokke, blev 3 sektioner taget fra hver blok blev snittene fordelt på 12 slides, og de 12 dias blev afbildet 4 gange producerer 96 sammensatte billedstakke. Den samlede tid til at udføre dette forsøg var 8 dage.
Figur 1. Typisk Workflow for protokollen. Generelle skridt omfatter en) vævsfiksering, 2) tape-stabiliseret cryosectioning, 3) overholdelse af tapede sektioner til objektglas, 4) anvendelse af referencemarkørerne, 5) flere runder af farvning og 6) billedbehandling, og 7) billede samling, justering og analyse. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. High-throughput Indlejring og Tape-stabiliseret Cryosectioning. På grund af stabiliteten i cryotape giver, kan flere knogler indlejres ved siden af hinanden (AB) og sektioneret samtidigt (CD). Et stykke tøris anvendes underindlejring proces til stift fastsætte knoglerne på plads inden frysning hele cryo-blokken (B). Den cryotape rulles på blokken (C) og afsnittet er fortsat fast til båndet under sektionering (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Overholdelse af Tapede Sektioner til Glass Slides, Anvendelse af reference Markers, og Loading af Slides i bakke af Slide-scanning mikroskop. Tapede sektioner er limet til overfladen af objektglas med enten UV-hærdende eller chitosan klæbestoffer (A ). Efter hærdning eller tørring, kun en tynd, flad klæbemiddellag forbliver mellem cryotape og glasoverfladen (B). henvisning markers anvendes på tørre dias (C, pilen peger på falde af mikrosfære opløsning). Slides derefter monteret i mikroskop bakker (D) og indlæses i mikroskop (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fem runder af Imaging af achillessenen fra en to uger gammel mus. Det sammensatte billede stack (A) blev skabt af fem runder af billeddannelse. Runde 1 (B): endogene COL1A1-GFPTpz, COL2A1-FFP, og Col10a1-mcherry transgen ekspression. Runde 2 (C): kollagen anden harmoniske generation (SHG) på to foton mikroskop. Runde 3 (D): immunfarvning for IHH. runde 4(E): AP enzymatisk aktivitet. Runde 5: toluidinblåt O (F). Dette tal er blevet ændret fra Dyment et al., 2015 6. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fire runder af Imaging af MCL Enthesis Efter fælles destabilisering. Knees blev destabiliseret i tre måneder gamle mus, hvilket fører til øget mineralisering af MCL enthesis. En Demeclocycline mineral etiket fik operationsdagen og et calcein mineral etiket fik dagen før aflivning. Runde 1 (A): endogene COL1A1-CFP, Col10a1-mcherry transgen udtryk med Demeclocycline og calcein mineralske etiketter. Runde 2 (B) </ Strong>: TRAP enzymatisk aktivitet. Runde 3 (C): AP enzymatisk aktivitet. Round 4 (D): toluidinblåt O. TRAP og AP signal blev overlejret på toppen af TB-signalet i paneler BC. Den gule kanal kan igen bruges til TRAP fordi TRAP buffer decalcifies vævet, fjerne Demeclocycline etiket. Dette tal er blevet ændret fra Dyment et al., 2015 11. Scale bar = 200 um. Dem: Demeclocycline, TRAP: tartrat-resistent syrephosphatase, AP: alkalisk fosfatase, MCL: mediale sideledbånd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Fire runder af Imaging inden distale femur Indeholder Mikrosfærepellets reference Markers. Tre måneder gamle mikrofone fik calceinholdige og alizarin complexon mineralske etiketter Runde 1 (AA):. endogene calceinholdige og alizarain complexon etiketter foruden calcein blåfarvning af akkumuleret mineral Runde 2 (BB.): TRAP enzymatisk aktivitet Runde 3 (CC '). :. AP enzymatisk aktivitet round 4 (DD): toluidinblåt O. de grønne mikrosfærer blev afbildet i hver runde (A'-D ', pil angiver den samme mikrosfære i alle billeder). Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Chitosan lim | UV-hærdende lim | |
| Adhesive mekanisme | Fordampning | UVpolymerisation |
| Hærdetid | > 24 timer | <20 min |
| Kan sektioner fjernes efter selvklæbende kur? | Ja | Ingen |
| Hærdes klæbemiddel opløseligt? | Ja, i sure opløsninger med lavt pH | Ingen |
| Er klæbemiddel modstå varme antigen hentning? | Ingen | Ja |
| Er klæbende autofluorescente? | Ingen | Minimal i UV-området |
Tabel 1. Sammenligning mellem Chitosan Lim og UV-hærdende Lim
| Cryotape | Tape-Transfer System | |
| Muligt at sektion mineraliseret knogle ved hjælp af dette system? | Ja | Ja, men stykker af mineraliseret knoglemå ikke overdrage helt til dias |
| Muligt at afsnittet mineraliserede samlinger ved hjælp af dette system? | Ja | Ja |
| Muligt at afsnittet hjernen ved hjælp af dette system? | Ja, men væv kan falde af bånd efter flere runder af billedbehandling | Ja |
| Muligt at skære flere prøver indlejret i den samme blok? | Ja | Ja |
| Muligt at foretage flere runder af billedbehandling på samme sektion? | Ja | Ja |
Tabel 2. Sammenligning mellem Cryotape System og Tape-transfer System
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi præsenteret en detaljeret cryohistology protokol til at co-lokalisere og kvantificere flere biologiske foranstaltninger ved at tilpasse billeder fra flere runder af farvning / billedbehandling på et enkelt afsnit. Metoden under anvendelse af cryotape er særligt nyttigt, da det opretholder morfologien af vanskelige at vævssnittet (f.eks mineraliseret knogle og brusk). Desuden er det i snit væv klæbet fast til objektglasset, der giver mulighed for flere runder af farvning / billeddannelse af den samme sektion; i modsætning til traditionelle metoder, hvor serielle sektioner er hver farvet med en anden protokol. Brug af serielle snit kan udgøre et problem, når de forsøger at co-lokalisere signaler mellem sektionerne, hvilket ikke er et problem med enkelte sektioner, der er blevet farvet og afbildes med multiple runder.
Den første tape-stabiliseret væv sektionering produkt på markedet var en overførsel tape-system 16, 17. Det bruger plast tape belagtmed en kold temperatur klæbemiddel, der er placeret på overfladen af vævet cryoblock. Når snittene kryostat klinge beneath båndet er sektionen fjernes intakt og klæbende til båndet. Efterfølgende båndet placeres prøvesiden ned på objektglas, der er belagt med UV-hærdende lim, således at vævet bliver stift fastgjort til objektglasset. Når tapen er skrællet væk fra afsnittet, kan den være forarbejdet til enten fluorescens eller kromogent histologi. Baggrundsfluorescensen af limene er lav, og flere runder af farvning og billeddannelse fungerer godt med de fleste bløde væv. Men med mineraliserede sektioner, kan der være tab af mineralske fragmenter, når der overføres vævet fra klæbebåndet til objektglas. Desuden er det et relativt dyrt system til at installere i kryostaten (> $ 8000) og forbrugsmaterialer omkostninger er høje (> $ 2 / slide).
En anden stabilisering tape strategi udviklet af Dr. Tadafumi Kawamoto bruger enklæbemiddelbelagte polyvinylidenchloridfilm at indfange vævssnittet. I deres protokol, er en frisk frosset væv sektioneret på båndet og straks fikseret i PFA eller ethanol 18. Efterfølgende båndet farves og derefter monteret på et objektglas med prøvesiden nedad til mikroskopisk undersøgelse. Således hver farvningsprotokollen udføres på en anden tapede sektion.
Vi har modificeret og tilsat til Kawamoto protokollen i en række måder, herunder fastsættelse prøven i formalin forud for indlejring. Dette trin er kritisk at fastsætte den opløselige cytoplasmatiske GFP af transgene dyr inden for cellen. Vi har benyttet cryotape for en lang række vævstyper 5-13. Laboratorie personale med begrænset histologisk erfaring kan producere sektioner af høj kvalitet med denne metode. De primære fordele ved denne protokol er den relative lave omkostninger (ingen specielle instrumenter, <$ 1,00 pr dias), ingen tab af mineralske fragmenter,og evnen til at udføre flere runder af farvning og billeddannelse på samme sektion.
Fordi billeddannelse de samme områder i et dias flere gange i gentagelse ville være urimeligt for et stort antal dias selv ved hjælp af en motoriseret scene, en anden afgørende skridt i denne protokol er udnyttelsen af en slide-scanning mikroskop for at øge sammenhængen og gennemløb. Mikroskopet er et digitalt dias scanner, der opererer under både epifluorescens og transmitteret lys. Den er udstyret med en 10-stilling motoriseret tårn og både B & W og farvekameraer. Den sande nyhed af systemet, i vore hænder, er, at specifikke områder af interesse kan hurtigt og nemt defineres af brugeren eller detekteres automatisk af billedbehandlingssoftware. Disse regioner af interesse kan derefter gemmes fra første runde af billedbehandling og derefter genindlæses hurtigt i løbet af de efterfølgende runder. Derfor er de samme områder af interesse afbildet i hver runde af billeddannelse. Baseret på bruger-definerede parametre i softwaren, vil mikroskopet autofokus og scanne flisebelagte billeder, der sys under erhvervelse i områder af interesse.
Rækkefølgen, hvorved brugeren udfører de multiple runder af farvningen er vigtig. Den generelle ordre er skitseret i figur 1. Antallet af fluoroforer, der kan passende adskilt via fluorescerende mikroskopi er den primære begrænsende faktor for antallet af modforanstaltninger, der kan erhverves på en given sektion. Imidlertid kan fluorescerende kanaler genanvendes i visse tilfælde. For eksempel calcein blå og demeclocyclin begge udsender et stærkt signal i den gule kanal, der anvendes til at måle TRAP-aktivitet. Denne gennemblødning undgås men fordi TRAP buffer decalcifies sektionen og derved fjerne mineralet forud for billeddannelse af TRAP-aktivitet. Desuden vil DAPI kontrastfarve udsender i den gule kanal samt. Imidlertid kan brugeren erstatte DAPI med anden kontrastfarve i the rød eller langt-røde område. Derudover kan antistoffer strippet og igen farvet med forskellige antistoffer under anvendelse af de samme fluorescerende kanaler. Derfor er denne metode er ganske tilpasses øge antallet af modforanstaltninger, der kan optages på en given sektion.
Der er visse begrænsninger med den præsenterede protokol. 1) cryotape må ikke klæbe tilstrækkeligt til visse væv. For eksempel formalin-fikserede hjernesnit tendens til at falde af båndet efter multiple runder af farvning. For væv, såsom denne, kan båndet transfersystemet være mere passende som vævet klæbes til glasoverfladen via UV-aktiveret klæbemiddel (se tabel 2 til sammenligning mellem disse to metoder). 2) chitosan klæbemiddel, samtidig med transparente optiske egenskaber, vil ikke overleve barske bearbejdningstrin, der omfatter høje temperaturer eller stærke syrer. Derfor er UV-aktiverede klæbemiddel er mere egnet til disse anvendelser (se tabel 1 feller sammenligning mellem disse to klæbemidler).
De cryohistological protokoller præsenteres her også egner sig til højere gennemløb og automatisering. For eksempel stabilisering tape tilvejebragt af cryotape muliggør relativt nybegyndere at skære flere knogler eller led på en gang i den samme blok, signifikant øger datahastigheden. Ved hjælp af en automatiseret scanner reducerer tekniker tid og omkostninger i forbindelse med billedbehandling, som typisk har været den hastighedsbegrænsende trin i vores erfaring betydeligt. At være i stand til konsekvent og pålideligt billede af samme region i renter flere gange i en kort periode giver en platform til automatiseret, objektiv analyse af væv. Faktisk har vores gruppe udviklet en platform for computer-automatiseret tilpasning og histomorfometri af knogle. Først softwaren justerer de multiple runder af billeder baseret på de fluorescerende referencemarkørerne. Derefter er de aligned billeder føres til en histomorfometri rørledning hvor compuER software definerer området af interesse og objektivt måler flere statiske og dynamiske målinger (se mere på www.bonebase.org) 13. Denne platform blev gjort muligt på grund af øget gennemløb og konsistens tilvejebringes af cryotape sektionering, digital slide-scanning-mikroskop, og brugerdefinerede analyse software. Denne protokol er et betydeligt fremskridt i high throughput cryohistology og bør være til nytte for dem billeddannelse vanskeligt at afsnittet væv såsom knogle såvel som dem uerfaren med vævssektionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
