Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

Published: September 14, 2016 doi: 10.3791/54468
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 2, 1
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

Introduction

מחקר ביולוגי לעתים קרובות דורש phenotyping ביותר, אשר מזוהה לעתים קרובות עם איזשהו ניתוח היסטולוגית 1-3. צורך זה בולט עוד יותר עם ​​פרויקטים שאפתניים לשבש כל גן של העכבר הגנום 4. ניתוחים היסטולוגית אלו יכולים לנוע בין הערכת מורפולוגיה תאים ו / או תכונות אנטומיות לביטוי מיפוי של גנים ספציפיים או חלבונים בתאים בודדים. למעשה, אחת תרומות יסוד של היסטולוגיה לתחום הגנומיקה היא היכולת לקשר בין אות מולקולרית ספציפית לסוג באזור או תאים ספציפי.

שיטות מסורתיות של היסטולוגיה, במיוחד עבור רקמות שריר-שלד, הם בדרך כלל זמן רב ומייגע, מחייב לפעמים שבועות כדי לתקן, decalcify, סעיף, כתם, ותמונת הדגימה מכן לנתח את התמונות באמצעות פרשנות אנושית. ניתוח אותות מולקולריים מרובים, אם באמצעות אימונוהיסטוכימיה, באתרו hybridizatיון, או כתמים מיוחדים, דורשים סעיפים רבים, ואפילו דגימות מרובות לביצוע כראוי. בנוסף, מספר תגובות האפשריות אלה לא יכולים להיות שותף מקומי לאותו תא ולפעמים לא יכול להיות שותף מקומי לאזור מסוים בתוך דגימה נתונה. ככל שתחום גנומיקה epigenomics נע לתוך העידן הדיגיטלי, בתחום היסטולוגית חייב גם בעקבותיהם לספק תפוקה גבוהה ביותר, וניתוח אוטומטי של מגוון של אותות מולקולריים בתוך קטע היסטולוגית יחיד.

אכן, יש ביקוש עבור טכניקות היסטולוגית משופרות שיכול לשייך אותות מולקולריים מרובים תאים ספציפיים בתוך דגימה נתונה. לאחרונה, פרסמנו שיטת cryohistological תפוקה הגבוהה חדשה להערכת אמצעי מענה כמה בתוך קטע נתון מרקמות mineralized 5-14. התהליך כרוך לייצוב cryosection עם cryotape הקפוא, דבקות בסעיף המודבק נוקשה לשקופית מיקרוסקופ, וניצוח מספר סבבי מכתים והדמיה על כל מקטע. הסיבובים האלה של תמונות אז מיושרים באופן ידני או באמצעות אוטומציה המחשב לפני ניתוח התמונה (איור 1). כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של תהליך זה ולספק דוגמאות בהן טכניקות אלה שיפרו את הבנתנו של תהליכים ביולוגיים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים מרכז בריאות קונטיקט ושימוש אישר את כל הנהלים בעלי חיים.

קיבוע 1. והטבעה

  1. להרדימו באמצעות מחנק CO 2 או שיטות מאושרות אחרות.
  2. קציר את הרקמה של עניין (למשל, איבר, חוליות, וכו ') ומניחים 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו על 4 מעלות צלזיוס עד שיתוקן כראוי. קח טיפול מיוחד כדי לשמור על מיקום האנטומי עקבי לפני הקיבוע. למשל, לתקן גפיים עם מפרקים על כיפוף עקבי, וסיבוב פנימי, וסיבוב חיצוני זוויות 11. בדרך כלל, לתקן גפי עכבר שלמים 1 - 3 ימים.
    זהירות: פורמלין רעיל יש לטפל במנדף כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים.
    הערה: מסגרת הזמן של קיבעון תלוי בגודל של הדגימה. אם הניסוי מאפשר, חיתוך ופתח את העצם ישפר קיבעון של תא המוח.דגימות מסוימות עשויות לדרוש קיבעון זלוף 15 למזער רקע ניאון (למשל, אותות ניאון קלושים בתוך מח עצם).
  3. העברת דגימות מן פורמלין 30% סוכרוז שנעשה 1x PBS ו דגירה במשך 12 - 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר וטופח במשך 12 - 24 שעות, דגימות אז יכולות להיות ממוקמות ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. שיטת אחסון זו מומלצת ניסויים שבהם החוקרים מתכוונים להטביע דוגמאות רבות באותו גוש אבל לא יכול לקצור את כל הדוגמאות להלן בעת ובעונה אחת (למשל, ניסויים עם נקודות זמן מרובים).
  4. הסר דגימות מן סוכרוז לנתח משם כל רקמה עודפת.
  5. ממלאים cryomold (גודל של עובש הוא תלוי בגודל הדגימה) חלק מהדרך עם קריו הטבעה בינוני. מניח מדגם עובש כך חיתוך מטוס עבור האזור של עניין מקביל עם החלק התחתון של התבנית.
    הערה: דוגמה למיקום רקמות ספציפיות והכיווןניתן למצוא באיור 2A - B.
  6. מניח את cryomold על פיסת קרח יבש עד שכבה דקה של קופא בינוני הטבעת קריו ובהמשך מתקן הדגימה במקום. מלא את נפח הנותרים של cryomold עם קריו הטבעה בינוני תוך שמירה על cryomold על גלולת הקרח היבשה.
  7. מניחים את cryomold במיכל המכיל מקורר-מראש בוטאן 2-מתיל ידי קרח יבש. לאחר דגימות קפואות לחלוטין, להסיר cryomolds ולהתנער 2-מתיל-בוטאן עודף. עוטפים בצלופן cryomolds ומניחים -20 ° C או -80 ° C במקפיא לאחסון.
    הערה: דוגמאות ניתן לייבש לאורך זמן כאשר הם מאוחסנים בינוני הטבעת קריו, במיוחד ב -20 ° C. אנו ממליצים אחסון של דגימות עבור יותר 1 - 2 חודשים קריו הטבעה בינוני ב -80 ° C או סוכרוז 30% ב -80 ° C (ראה שלב 1.3).

2. חתך רקמות Tape מיוצב

  1. הסר בלוקים הדגימה מהמקפיא ומכניסים cryostat עם הטמפרטורה להגדיר בין -20 ו -25 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את הבלוק מן cryomold לקצץ משם קריו עודף הטבעה בינוני עם סכין גילוח.
  3. מקום קצת בינוני הטבעה קריו על גבי דיסק הדגימה ולאחר מכן יישרתי את הבלוק כך את פני השטח של דיסק הדגימה מקביל למשטח התחתון של הבלוק ובכך הקמת מטוס החיתוך הנכון עבור האזור של עניין.
  4. מניחים את הדיסק הדגימה ב cryostat ולאפשר עבור קריו הטבעה בינוני להקפיא.
  5. מניח את הדיסק הדגים על ראשו הדגימה ולהתאים את הראש כך קיצוצי להב מקבילים אל פני השטח של בלוק הדגימה.
  6. חתוך את הבלוק לרמה בתוך האזור של עניין לנער אותם שבבי מפני השטח של הבלוק.
  7. חותכים חתיכה של cryotape גדול מספיק כדי לכסות את האזור של עניין צמרמורת מראש ב cryostat.
    הערה: חתיכות מרובות ניתן לחתוך בגדלים עקביים מאוחסנות בתוך cryostב במהלך חתך.
  8. סור גיבוי לא חסיד מן cryotape ידי אחיזת הקלטת ידי הכרטיסיות לא דביק כסף / זהב באמצעות מלקחיים מכן למקם את הקלטת על הצד-הדביק לחסום למטה.
  9. הפעל לחץ קל על cryotape באמצעות הגלגלת (איור 2 ג).
  10. הפוך קטע (5 - 8 מיקרומטר) או באמצעות המנוע האוטומטי או גלגל חיתוך ידני של cryostat.
    הערה: זהו תרגול טוב כדי להחזיק את קצה cryotape כפי שהיא באה לבמה כך הסעיף אינו נופל מהבמה במהלך חתך (איור 2 ד).
  11. הנח את צד רקמות סעיף עד בשקופית מיקרוסקופ פלסטיק בתוך cryostat.
  12. להסיר את שקופית הפלסטיק מן cryostat ולאפשר מדיום הטבעת קריו להתמוסס כך בסעיף שומר על פני השקופית.
  13. חזור חתך עבור קטעי סדרה או אזורים אחרים בעלי עניין.
  14. בסיום, לאחסן את החלקים בתוך קופסת שקופיותt 4, -20 או -80 ° C בהתאם לאורך של האחסון הנדרשים ואת אמצעי המענה במורד הזרם. למשל, להשתמש בשקופיות כי הם הולכים להיות מוכתם עבור הפעילות האנזימטית (ראה 5.2 - 5.3) בתוך חודש אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.

3. הדבקה של סעיפים כדי שקופיות מיקרוסקופ

  1. UV- לריפוי שיטת דבק.
    1. לייבל שקופית מיקרוסקופ.
      הערה: ואוטומציה מוגברת, דוגמיות שקופיות יכולות להיות מתויגות עם ברקודים.
    2. החל ירידה של דבק אופטי מופעל UV לשתי שקופיות זכוכית ולהשתמש בקץ שקופית פלסטיק כדי להפיץ שכבה דקה של דבק על פני השטח של שקופיות הזכוכית.
    3. חותכים את הכרטיסייה כסף / זהב ולהניח בצד רקמות סעיף מודבק על הדבק של השקופית הראשונה. החל את הסעיף על תנועה סיבובית מקצה אחד לקצה השני כדי למזער את ההיווצרות של בועות בפח מתחת הקלטת.
      הערה: השקופית הראשונה משמשת טרום להרטיב את התחתון של tהוא הסרט לפני הצבתו בשקופית השנייה (הקבועה) (שלב 3.1.4).
    4. הסר את הקטע מוקלט מתוך השקופית הראשונה ולמקם אותו על שכבת הדבק של השקופית השנייה (איור 3 א). שוב, לטפל כדי למנוע הילכדות של בועות.
      הערה: שלב זה לוקח בפועל אמן.
    5. לאחר המספר המתאים של קטעים לניסוי הנתון מושם על כל שקופית, לקנח הדבק העודף מן האזורים הסמוכים.
    6. בדוק כל מקטע מקרוב על בועות או סיבים מתחת הקלטת. בצע בדיקה זו תחת זכוכית מיקרוסקופ או מגדלת. אם יש חסימות, להסיר את החלק הפרט, להסיר את החסימות, ולאחר מכן החל מחדש אותו לשקופית זכוכית.
    7. ברגע זה נקבע כי אין מכשולים על פי הסעיפים המודבקים, במקום שקופיות מיקרוסקופ תחת אור UV השחור עבור 5 - 10 דקות כדי crosslink הדבק.
  2. שיטת דבק Chitosan.
    1. כן הe 1% דבק chitosan. כן פתרון חומצה אצטית על ידי המסת 0.25 מיליליטר של חומצה אצטית מרוכזת במי DI 100 מיליליטר (0.25% v / v). ממיסים 1 גרם של אבקת chitosan ב 100 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית ומערבבים הפתרון O / N או עד שכל האבקה chitosan נמס.
      הערה: הפתרון הוא יציב ב RT.
    2. להפקיד ירידה של פתרון chitosan עבור כל מקטע שיונח בשקופית.
    3. חותך את כרטיסיית כסף / זהב של הקלטת ומניח בכל צד רקמות סעיף מודבק לעלות על (איור 3 א) הדבק. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע מלכודת של בועות.
    4. לאחר שכל המקטעים ממוקמים בשקופית, להטות את השקף על אחד הקצוות הארוכים שלו ולגרור chitosan המוגזם לקצה התחתון באמצעות מלקחיים.
    5. מניחים שקופיות בכיוון הזה על גבי מגבת נייר בתוך קופסת שקופיות. כוח המשיכה לגרום chitosan עודף ליפול על מגבת, מניב שכבה שטוחה ואחידה של chitosan.
    6. PlaCe בתיבת שקופיות עם המכסה שלה שנפתח במקרר O / N לאפשר chitosan להתייבש.
      הערה: ראה טבלת 1 עבור השוואה בין שתי השיטות דבקות.

4. בקשה של סמני הפניה ל'מצגות

  1. כן פתרון סמן הפניה ידי המסת 50 μl של ירוק 50 μl של microspheres האדום 100 μl של מים. אחסן את הפתרון בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
  2. מניחים 10 μl או 20 μl טיפ pipet לתוך התמיסה microsphere. הוסף טיפה קטנה של פתרון microsphere לכל קטע סמוך לאזור של עניין (איור 3 ג). היזהר שלא לקבל את microspheres בתוך האזור של עניין.
  3. יבש את השקופיות ב RT (מוגן מפני אור) למשך 30 דקות אם עיבוד השקופיות באותו יום. אם לא, במקום שקופיות בתיבת שקופיות ב 4 ° C.
    הערה: כל עוד הפתרון microsphere מתייבש לפני לחות השקופיות, MIcrospheres יישאר דבקה השקופיות במהלך סבבים רבים של מכתים / הדמיה.

5. סבבים רבים של מכתים

הערה: על ידי בחירת רצף תואם של הדמיה, מכתים, וצעדי reimaging, אפשר לזהות ושיתוף בתרגום אותות ביולוגיים רבים על אותו קטע הרקמה. כל סיבוב של reimaging הדמיה / מכתים / יש שיפותח עבור השאלה היסטולוגית בפרט. הדמיה / מכתים / רצף reimaging כרוך בדרך כלל רכישת אותות ניאון אנדוגני (למשל, ה- GFP הסלולר, צבעי מינרליזציה, in vivo בדיקות הדמיה) על הסיבוב הראשון של הדמיה ואחריו immunostaining מרובב פלורסנט סבבים רבים של כתמים הפעילות האנזימטית. לבסוף, בחלק ניתן מוכתמים באמצעות צבעים chromogenic (למשל, H & E, toluidine כחול, safranin O, וכו ') כדי להדגיש את מבנה רקמה. המוצגות בסעיף זה הם שיטות מותאמות אישית מותאמותפרוטוקולים זמינים מסחרי.

  1. Calcein כתמים כחולים על מינרלים שנצבר
    הערה: כתמי כחולי Calcein מניב משטח מינרליים עקבי כי ניתן ניתוח תמונה אוטומטית בניגוד בניגוד התערבות darkfield או הפרש הדמיה (DIC). הבעיה עם כתמים כחולים calcein הוא שהספקטרום פלורסנט חופפת טטרציקלין וסימון demeclocycline. לכן, אם המדגם מכיל תוויות מינרלים אלה, תמונה תוויות בסיבוב הראשון של הדמיה לפני צביעה עם כחול calcein.
    1. אם האותות אנדוגני בתוך הרקמה הם צילמו לפני צעד מכתים זה, להטביע את שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא 1xPBS עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. הכן 30 מ"ג / מ"ל של תמיסת כחול calcein ב 2% 3 NaHCO (מיוצר על ידי המסת 2 גרם NaHCO 3 ב 100 מ"ל H 2 O ולהתאיםing ל- pH של 7.4 עם HCl). Aliquot ולאחסן את הפתרון ב -20 ° C.
    3. לטבול את השקופיות בצנצנת coplin המכילות 1X PBS במשך 15 דקות כדי ללחלח את הסעיפים, אם לא כבר hydrated מן הסיבוב הקודם.
    4. הסר את השקופיות ולייבש אחורי וקצוות עם מגבת נייר.
    5. להחיל 100 - 500 μl של פתרון כחול calcein לכל שקופית דגירה במשך 10 דקות בתא לחות ב RT.
    6. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
    7. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
    8. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
  2. Tartrate עמיד phosphatase חומצה (TRAP) מכתים הפעילות האנזימטית
    הערה: TRAP מתבטאת סוגי תאים מרובים בשושלת hematopoietic כולל osteoclasts. מכתים TRAP המוצג כאן משתמש מצע phosphatase צהוב ניאון החומצה. אותות ניאון מסוימים יהיו overlap עם סט מסנן צהוב מותאם אישית כולל תוויות מינרליזציה טטרציקלין / demeclocycline, calcein כתם כחול, counterstain DAPI.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. הכן הצפת 1 על ידי המסת 9.2 גרם של נטול מים אצטט נתרן 11.4 גרם של מימית dibasic tartrate נתרן במים והבאת נפח סופי 1,000 מ"ל. התאם את ה- pH ל -4.2 עם חומצה אצטית קרחונית מרוכזת (~ 1.5 - 2 מיליליטר). אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 12 חודשים.
    3. כן ההצפה 2 על ידי המסת 40 מ"ג של סודיום ניטריט במים והבאת הנפח הסופי עד 1 מיליליטר. אחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע.
    4. ביום מכתים, להכין את החיץ התגובה על ידי ערבוב 7.5 מ"ל של חיץ 1 ו 150 μl של חיץ 2.
    5. החל למאגר התגובה בלי המצע לשקופיתים במשך 10 - 15 דקות כדי לאזן את הרקמה על pH הנמוך.
      הערה: ההיקף הטיפוסי הוא ~ 200 μl אבל צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את כל החלקים.
    6. לדלל את מצע phosphatase חומצת ניאון הצהוב בין 01:50 ו -1: 100 במאגר התגובה.
      הערה: דילול יהיה מוכתב על ידי פעילות TRAP בתוך המדגם.
    7. יוצקים את מאגר התגובה הנחה של שקופיות ולהחיל למאגר התגובה עם המצע ניאון צהוב על השקופיות.
    8. מניחים את השקופיות תחת אור שחור UV עבור ~ 5 דקות כדי להפעיל את המצע.
      הערה: זמן דגירה עשוי להשתנות בהתאם לפעילות TRAP בתוך המדגם.
    9. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
    10. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
    11. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
      הערה: מאגר TRAP חומצי יהיה decalcify הסעיפים. היתרון הנוסף של decalcification הוא כי צבעים מסוימים יהיו זמינים שוב מכתימים במורד זרם (למשל, תוויות מינרליזציה). לדוגמה, כתמים כחולים calcein יוסרו במהלך מכתים TRAP. לכן, DAPI counterstain ניתן הדמיה באפיק זה במהלך סבב שלאחר מכן.
  3. Phosphatase אלקליין (AP) פעילות אנזימטית מכתים
    הערה: סוגי תאים מרובים מעורב עם מינרליזציה כולל osteoblasts ו chondrocytes mineralizing להביע AP. המצע האדום המהיר בשימוש בפרוטוקול זה מעורר אות אדומה אדומה chromogenic פלורסנט שניהם. בגלל זה, המצע chromogenic יהיה להרוות אותות ניאון באזורים בהם המצע משקעים. לכן, עדיף לעשות את הכתם הזה לאחר הדמית אותות הניאון כי ניתן רווה ידי מצע AP.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. רמתיve ולייבש את התלושים לכסות.
    2. כן 1 M טריס ידי המסת 12.1 גרם של טריס ב 100 מ"ל מים. התאם ל- pH 9.5 עם 1 M NaOH.
    3. כן 1 M MgCl 2 hexahydrate ידי המסת 20.33 גרם של MgCl 2 ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
    4. הכן 2 M NaCl ידי המסת 11.68 גרם NaCl ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
    5. הכן 100x (20 מ"ג / מ"ל) פתרון המניות של מלח TR האדום מהיר על ידי המסת אבקת 1 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
    6. הכן 100x (10 מ"ג / מ"ל) Naphthol פתרון מניות פוספט AS-MX ידי המסת אבקת 500 מ"ג ב 50 מ"ל של N, dimethylformamide N. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
    7. ביום מכתים, להכין את החיץ AP על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של 1 M טריס, 0.5 מ"ל של 1 M 2 MgCl, 0.5 מ"ל של 2 M NaCl ולהביא את נפח סופי 10 מ"ל באמצעות מים ללא יונים (ריכוזים הסופי: 100 מ"מ טריס, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl).
    8. מניחים ב APuffer על כל שקופית הדגירה בתא לחות במשך 10 דקות ב RT.
    9. הכן חיץ המצע AP ידי דילול 100x מניות של מלח TR האדום מהיר Naphthol AS-MX כדי 1x במאגר AP.
    10. יוצקים AP חיץ הנחה של שקופיות ולהחליף עם חיץ המצע AP. דגירה שקופיות עבור 5 - 10 דקות בתא לחות ב RT.
      הערה: זמן דגירה יהיה מוכתב על ידי פעילות AP של המדגם.
    11. לשטוף מחליק 3x ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    12. כיסוי הר מחליק עם פתרון counterstaining DAPI (1: 1,000 דילול DAPI ב 50% גליצרול ב PBS 1x).
  4. O toluidine כחול (TB) מכתים chromogenic
    הערה: בגלל כל השלבים הקודמים הם צלמו תחת הרכבה מימית זמנית 50% גליצרול / פתרון PBS, צעד chromogenic גם צלם בתנאים מימיים. עם זאת, הפתרון המכתים עשוי נוטה לדלוף החוצה במשך זמן. לכן, הוא הציע כדי שזה יקלוט את toluidine הכחול בהקדם האפשרי לאחר צביעה.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא מים ללא יונים עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. לאחר הסרת מכסה מחליק, להחליף עם מים מתוקים דגירה השקופיות במשך 10 דקות לפחות כך מלחים PBS מוסרים מספיק מן הרקמה.
    3. כן פתרון TB 0.025% במי deionized.
    4. מניח את שקופיות פתרון TB עבור 1 - 5 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי העדפת המשתמש אבל צריך להישמר עקבי לאורך כל הדגימות.
    5. מקום שקופית לתוך צנצנת coplin עם מגלשות מים לשטוף deionized 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    6. להחליק את המכסה הר עם 30% גליצרול מומס במים ללא יונים (NOT 1X PBS כמו זה יגרום הכתם ליץ החוצה מן הרקמה). הערה: הרכבה בינונית גליצרול ניתן להחליף עם סירופ פרוקטוז, אשר מסייע למנוע דיפוזיה של הכתם מן הרקמה. למכינים את הסירופ פרוקטוז, לפזר 30 גרם של פרוקטוז ב 10 מ"ל של מים וחום deionized ל -60 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה.

6. טיולי הדמיה מרובים

  1. טען את השקופיות במגשי מיקרוסקופ (איור 3D).
    הערה: מגשי קפיץ.
  2. הכנס את המגשים לתוך ערימה מגש של המיקרוסקופ סריקת שקופיות (איור 3E).
  3. לחץ על רשימת הפרופיל לטעון פרופיל עבור כל שקופית עם זמני חשיפה מתאימים לכל fluorophore. הקש על שם שקופית לתת שם לכל שקופית באופן ידני או לקבל את התוכנה לקרוא את הברקוד הניתן על תווית השקופיות. לחץ על לחצן הסריקה מקדימה התחלה לקחת תמונת תצוגה מקדימה של השקופית.
  4. הגדר את האזורים של עניין באשף זיהוי הרקמות ולשמור אותם לסיבובים הבאים של הדמיה. לאחר כל שקופית מוגדרת, להתחיל את תהליך הסריקה על ידי לחיצה על הכפתור התחל סריקה.
    הערה: המערכת יכולה להכיל עד 100 SLIdes בכל פעם.
  5. לאחר ההדמיה סיימה, לייצא את התמונות כל סיבוב ערוץ והדמית פרט .tif או קבצי jpg להרכבת תמונה וניתוח.

7. תמונה האסיפה

  1. שיטה ידנית באמצעות פוטושופ (או תוכנת עריכת תמונה דומה מסוגלת לייצר תמונות שכבתיות).
    1. פתח כל תמונת ערוץ פרט מפני כל סיבוב הדמיה.
    2. הרכב את התמונות הבודדות כאילו שכבות בתוך תמונה אחת מרוכבים. לשם כך, לחץ על השכבה בתוך לוח שכבה מתמונה אחת. לאחר מכן גרר את השכבה גבי תמונה אחרת. בפעולת גרור ושחרר זו תיצור שכבה חדשה בתמונה. בצע פעולה זו עבור כל תמונות אחרות. לחלופין, להשתמש בסקריפט (File> Scripts> קבצים טען לתוך ערימה ...) כדי להפוך את התהליך הזה על ידי טעינת קבצי תמונה מרובים כשכבות אותה במערך התמונה.
    3. לאחר כל תמונה מופיעה כנדבך בודד התמונה המורכבת, לחיצה כפולה על שם השכבה כדי לשנות את שם layers לפי הצורך להבחין הערוצים השונים.
    4. כדי לראות דרך כל שכבה וליצור תמונה מורכבת באמת, לשנות את מצב תערובת לכל שכבה מן "רגיל" ל "מסך" בתוך לוח השכבה.
      הערה: כדי להאיץ את הצעד הזה, לשנות בשכבה אחת להקרין, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על השכבה, בחר "העתק סגנון שכבה", ואז לסמן את כל השכבות האחרות ובחר "דבק סגנון שכבה" כדי להחיל את סגנון המסך לצד השני שכבות.
    5. אם תרצה, להקטין את (ערך שינוי עד 10 - 40%) אטימות השכבה chromogenic (כלומר, toluidine כחול) כדי להמחיש טוב יותר את האותות פלורסנט דרך שכבת chromogenic.
      הערה: מיקרוסקופ סורק הרעפים בשימוש בפרוטוקול זה מחזיק את השקופיות על 3 קצוות, ובכך לצמצם את כמות הסיבוב שיכול להתרחש לשקופית במהלך כל סיבוב של הדמיה. לכן, זה הרבה יותר קל עבור המשתמש כדי ליישר את התמונות באופן ידני מבלי לסובב תמונות נגזרומ סיבובים שונים של הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבודה כללית עבור התפוקה הגבוהה, רבה-תמונת Cryohistology

איור 1 מייצג את זרימת העבודה הכללית המשמשת עבור טכניקה זו. היא כוללת מספר צעדים מן הקיבעון דרך מספר סבבי ההדמיה ולבסוף יישור תמונה / ניתוח. התהליך יכול לקחת קצת כמו בשבוע לצאת מן הקיבעון מדגם דרך 4 סיבובים של הדמיה, המהווה פחות זמן ממה שנדרש כדי decalcify אלה סוג של דגימות. סדר הדמיה בדרך כלל מתחיל עם אותות אנדוגני שכבר נמצאים הדגימה (למשל, GFPs, תוויות מינרליזציה, וכו '), אז immunostaining פלורסנט מרובב ואחריו מבחני הפעילות האנזימטית ניאון (למשל., TRAP, AP, וכו') מבחני ניתוח מחזור התא (לדוגמא, edu) ולבסוף מסיים עם כתם chromogenic (למשל, O toluidine כחול, שוליatoxylin, safranin O, וכו ').

דוגמה מייצגת מתוך 6 משותפות לנוער קרסול

מטרת המחקר המסוים הזה היה כדי להדגים את הקשר בין הביטוי של סוגים שונים של קולגן (כלומר, Col1a1, Col2a1, ו Col10a1) עם מינרליזציה של fibrocartilage של הכניסה לאתר גיד אל העצם אכילס (כלומר, enthesis). לכן, עכבר כתב ניאון משולש מהונדס כולל Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP, ו Col10a1-mCherry שמש לזיהוי תאי מבטאים כל transgene. הסיבוב הראשון של הדמיה היה של ביטוי transgene אנדוגני מתוך עכבר שני שבועות בן, אשר תואמת כאשר mineralizes enthesis בגיד אכילס (איור 4B). הסיבוב השני של הדמיה מכן נערך עלmultiphoton מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות של אדריכלות קולגן באמצעות שני דור ההרמוני שני פוטון (SHG, איור 4C). צעד זה נעשה שימוש כדי לזהות תאים בבסיס של סיבי קולגן בתוך enthesis. הסיבוב השלישי של הדמיה היה צעד immunostaining עבור הקיפוד ההודי (IHH), שהיא אחת של הליגנדים איתות העיקרי שמקדם מינרליזציה של enthesis (איור 4D). הסיבוב הרביעי של הדמיה היה מכתים AP באמצעות ערכת מצע phosphatase כחולה אלקליין, אשר מעוררת הן קרינת Cy5 אותות chromogenic כחולים, לדמיין תחומים בתצהיר מינרליים פעיל (האיור 4E). לבסוף, בסיבוב החמישי של הדמיה היה מכתים TB לדמיין את תכונות אנטומיות כולל התוכן proteoglycan בתוך fibrocartilage (איור 4F). כל התמונות היו מיושרות באופן ידני בתוך תוכנת עריכת תמונות. חמשת סבבי הדמיה נערכו על פני תקופה של 4 ימים, שבאה לאחר 3ימים של עיבוד חתך מדגם (7 ימים בסך הכל).

דוגמא מייצגת מתוך ברך למבוגר 11 משותף

מטרת הניסוי הייתה לקבוע את השינויים מינרליזציה המתרחשים enthesis של הרצועה בטחונות המדיאלי (MCL) של הברך לאחר יציבות משותפת באמצעות חיתוך רוחב של הרצועה הצולבת הקדמית (ACL). שינויים מינרליזציה ניתן לראות כבר שבועיים לאחר הניתוח enthesis MCL בעכברים 3 חודשים הישנים האלה. כדי לפקח מינרליים למגע שבין fibrocartilage בתוך enthesis, תווית מינרל ניתנה העכברים ביום הניתוח (demeclocycline) ושלשום הקרבה (calcein) ב -2 שבועות לאחר הניתוח. העכברים כללו גם Col1a1-CFP ו Col10a1-mCherry כתבי ניאון כדי לפקח ביטוי קולגן של fibrochondrocyt unmineralized ו mineralized es, בהתאמה. הסיבוב הראשון של הדמיה היה של אותות אנדוגני, אשר במקרה זה תואם את חלבוני ניאון ותוויות מינרליזציה ניאון (איור 5 א). הסיבוב השני כלל TRAP מכתים להפגין ביטוי אנזים זה fibrochondrocytes mineralizing ב enthesis וכן osteoclasts במח העצם הבסיסי (איור 5). הסיבוב השלישי היה AP מכתים להפגין אזורים של מינרליזציה הפעילה של fibrochondrocytes וכן אוסטאובלסטים של העצם הבסיסי (איור 5 ג). לבסוף, מכתים TB נערך לסיבוב הרביעי (איור 5D). כל התמונות היו מיושרות באופן ידני בתוך תוכנת עריכת תמונות. שוב הזמן הכולל שנלקח קציר רקמות כדי יישור תמונה היה 7 ימים.

דוגמה מייצגת של trabecular עצם מן דיסטלי עצם הירך

p-together.within-page = "1"> מטרת מחקר זה היא פנוטיפ השלד של עכברים עם רקע גנטי שונה על ידי ביצוע histomorphometry דינמי אוטומטי (www.bonebase.org). שלושה חודשים ישנים עכברים קבלו שתי תוויות מינרליזציה (calcein 7 ימים לפני להקריב Alizarin complexone 2 ימים לפני להקריב). עצמות ירך דיסטלי מארבעה עכברים נפרדים מוטבעות בתוך אותו הגוש הקפוא ולאחר מכן לחתוך ביחד. החלק המכיל ארבע עצמות היה מודבק למטה לשקופית. לאחר מכן, קטע נוסף המכיל 4 עצמות נוספות מודבק למטה סמוך החלק הראשון. לכן, בסך הכל 8 עצמות יושמו כל שקופית (איור 3 ב). תהליך זה נערך ב -8 נקבה ו -8 עכברי זכרים ב 3 רמות שונות בתוך מח העצם, דבר שמניב מספר כולל של 12 שקופיות. סמני ההפניה (microspheres) יושמו בתוך epiphysis ואת באמצע diaphysis על הסעיפים היבשים (איור 3 ג). כל 12 מגלשות הוכתמו FO r calcein כחול צילמו עבור מינרליים שנצבר (כחול calcein) ותוויות מינרליזציה (calcein ו Alizarin complexone) במהלך הסיבוב הראשון של הדמיה (איור 6 א). השקופיות היו צילמו אז עבור פעילות TRAP (6B איור) בסיבוב השני ופעילות AP (איור 6 ג) בסיבוב השלישי של הדמיה. לבסוף, את השקופיות הוכתמו toluidine כחול בסיבוב הרביעי (איור 6 ד). סמני ההתייחסות הם צלמו במהלך כל סיבוב הדמיה, כוללים בסיבוב chromogenic, והיו מיושרים באמצעות התוכנה המותאמת אישית. כדי לתת מושג על התפוקה עבור הליך זה, 32 עצמות (16 עצמות הירך ו -16 חוליות) היו משובצים 8 בלוקים, 3 חלקים נלקחו כל בלוק, בסעיפים פוזרו ברחבי 12 שקופיות, ו -12 מגלשות הם צילמו 4 פעמים הפקת 96 ערימות תמונה מורכבת. הזמן הכולל לביצוע הניסוי הזה היה 8 ימים.

> איור 1
באיור 1. Workflow אופיינית עבור הפרוטוקול. צעדים כלליים כוללות 1) קיבעון רקמות, 2) cryosectioning מיוצב קלטת, 3) דבקות סעיפים מודבקים שקופיות זכוכית, 4) יישום של סמני התייחסות, 5) סבבים רבים של מכתים ו -6) הדמיה, ו -7) הרכבת תמונה, יישור, וניתוח. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
Embedding איור 2. תפוקה גבוהה מיוצב סרט Cryosectioning. בגלל היציבות cryotape מספק, עצמות מרובות יכולות להיות מוטבעות סמוכות זו לזו (AB) מחולק זמנית (CD). חתיכת קרח יבש משמש במהלךהטבעת תהליך לתקן את העצמות למקום בחוזקה לפני ההקפאה-בלוק קריו כולו (B). Cryotape הוא התהפך על הגוש (C) ואת החלק נשאר תקוע לקלטת במהלך חתך (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
דבקות איור 3. סעיפים מודבקים זכוכית שקופיות, הנחת סמני הפניה ויש טוען של שקופיות לתוך המגש של מיקרוסקופ שקופיות סריקה. סעיפים מודבקים מודבקות אל פני השטח של שקופיות זכוכית עם או UV-ריפוי או מבוסס דבק chitosan (א ). בעקבות ריפוי או ייבוש, רק שכבה דקה, שטוחה של דבק נשארת בין משטח cryotape וזכוכית (B). הפניה marKERS מוחל שקופיות יבשות (C, נקודות חצים כדי הירידה של פתרון microsphere). שקופיות אז הם רכובים במגשים מיקרוסקופ (D) וטעון מיקרוסקופ (E). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. חמישה סבבים של הדמיה של גיד אכילס מתוך עכבר שני שבועות בן. מחסנית התמונה המורכבת (א) נוצרה מתוך חמישה סיבובים של הדמיה. סיבוב 1 (B): אנדוגני Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP, והביטוי transgene Col10a1-mCherry. סיבוב 2 (ג): דור ההרמוני השני קולגן (SHG) על מיקרוסקופ שני פוטונים. סיבוב 3 (ד): immunostaining עבור IHH. סיבוב 4(ה): הפעילות האנזימטית AP. סיבוב 5: O toluidine הכחול (F). נתון זה יש הבדל בין ואח Dyment. 2015 6. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. ארבעה סיבובים של הדמיה של MCL Enthesis בעקבות ערעור יציבות משותפת. ברכיים מעורערות בעכברים בן שלושת חודשים, מה שמוביל מינרליזציה מוגברת של enthesis MCL. תווית מינרליים demeclocycline ניתנה ביום הניתוח ותווית מינרליים calcein ניתנה היום לפני הקרבה. סיבוב 1 (א): אנדוגני Col1a1-CFP, ביטוי transgene Col10a1-mCherry עם תוויות מינרליים demeclocycline ו calcein. 2 עגולים (B) </ Strong>: הפעילות האנזימטית TRAP. סיבוב 3 (ג): הפעילות האנזימטית AP. סיבוב 4 (ד): O. toluidine כחול המלכודת ואת האות AP היה מעולף על גבי אות שחפת לפנה"ס לוחות. הערוץ הצהוב ניתן להשתמש שוב בפח בגלל למאגר TRAP decalcifies הרקמה, הסרת תווית demeclocycline. נתון זה יש הבדל בין ואח Dyment. 2015 11. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. Dem: demeclocycline, TRAP: phosphatase חומצה tartrate עמידים, AP: phosphatase אלקליין, MCL: רצועה בטחונות המדיאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. ארבעה סיבובים של הדמיה בתוך עצם הירך דיסטלי המכילים מרקרים הפניה Microsphere. מיקרופון שלושה חודשים הישןדואר ניתנו calcein ו Alizarin complexone תוויות מינרליים סיבוב 1 (AA '):. calcein אנדוגני ותוויות alizarain complexone בנוסף calcein כתמים כחולים של מינרלים שנצבר 2 עגול (BB.'): הפעילות האנזימטית TRAP 3 עגול (CC "). :. הפעילות האנזימטית AP 4 עגול (DD '): The microspheres ירוק O. toluidine כחול הם צילמו במהלך כל סיבוב (A'-ד', חץ מציין אותו microsphere בכל התמונות). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דבק chitosan UV ריפוי דבק
מנגנון דבק אידוי UVפלמור
זמן אשפרה > 24 שעות <20 דק '
ניתן להסיר חלקים לאחר מרפא דבק? כן לא
הוא נרפא נמסים דבקים? כן, בפתרונות חומצי עם pH נמוך לא
האם דבק לעמוד תחזור אנטיגן חום? לא כן
האם אוטומטי ניאון דבק? לא מינימל ב UV טווח

השוואה בטבלה 1. בין דבק Chitosan ו דבק ריפוי UV

Cryotape מערכת סרט-Transfer
ניתן עצם סעיף mineralized באמצעות מערכת זו? כן כן, אבל פיסות עצם mineralizedלא רשאי להעביר לגמרי לשקופית
ניתן מפרקי mineralized סעיף באמצעות מערכת זו? כן כן
ניתן מוח סעיף באמצעות מערכת זו? כן, אבל רקמה עשויה לנפול של קלטת לאחר כמה סבבים של הדמיה כן
ניתן לחתוך דגימות מרובות מוטבעות באותו הגוש? כן כן
ניתן לבצע מספר סבבים של הדמיה על אותו סעיף? כן כן

השוואת טבלת 2. בין מערכת Cryotape מערכת סרט- העברה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן הצגנו פרוטוקול cryohistology מפורט לשתף למקם ולכמת כמה צעדים ביולוגיים על ידי יישור תמונות סבבים רבים של מכתים / הדמיה על קטע יחיד. השיטה התוותה באמצעות cryotape שימושית במיוחד כפי שהיא שומרת את המורפולוגיה של קשה רקמות סעיף (למשל, עצם וסחוס mineralized). בנוסף, רקמת מחולק היא דבקה בחוזקה לשקופית זכוכית, המאפשר סבבים רבים של מכתים / הדמיה של אותו סעיף; בניגוד לשיטות מסורתיות שם קטעי סדרה הם כל מוכתם בפרוטוקול אחר. באמצעות קטעי סדרה יכול להוות בעיה כאשר מנסים לשתף בתרגום אותות בין החלקים, משהו שהוא לא בעיה עם חלקים יחידים כי כבר מוכתמים צלמו עם סיבובים מרובים.

מוצר חתך הרקמות הראשון מיוצב קלטת בשוק היה מערכת העברת קלטת 16, 17. היא משתמשת סרט פלסטי צופהעם דבק טמפרטורה קר אשר ממוקם על פני השטח של cryoblock הרקמות. כאשר קיצוץ להב cryostat מתחת הקלטת, בסעיף המוסר שלם חסיד לקלטת. בהמשך הקלטת מושם בצד מדגם למטה על גבי שקופיות כי הם מצופים בדבק UV-ריפוי כך הרקמה נקשרת נוקשה לשקופית. לאחר הקלטת צלצלה במרחק מהמדור, השקופית ניתן לעבד גם קרינה או היסטולוגיה chromogenic. הקרינה רקע של דבקים הוא נמוך, סבבים רבים של מכתים הדמיה עובד היטב עם רוב הרקמות הרכות. עם זאת עם חלקי mineralized, עלול להיגרם אובדן של שברי מינרליים בעת העברת הרקמות מן הדבק על שקופיות הזכוכית. בנוסף, מדוברת במערכת יקרה יחסית להתקין ב cryostat (> 8,000 $) ועלויות מתכלות הם גבוהות (> 2 $ / שקופית).

אסטרטגיה נוספת ייצוב קלטת שפותחה על ידי ד"ר Tadafumi קאוואמוטו משתמשתדבק סרט כלוריד מצופה polyvinylidene ללכוד את קטע הרקמה. בפרוטוקול שלהם, רקמה קפואה מחולקת על הקלטת וקבועה מייד PFA או אתנול 18. בהמשך לכך, הקלטת מוכתמת ואז רכובה על שקופיות זכוכית עם הצד המדגם למטה לבדיקה מיקרוסקופית. לפיכך כל פרוטוקול מכתים מבוצע על קטע מוקלט שונה.

יש לנו שונה והוסיף לפרוטוקול קאוואמוטו במספר דרכים, כולל תיקון המדגם בפורמלין לפני הטבעה. שלב זה הוא קריטי לתקן את GFP cytoplasmic המסיס של חיות טרנסגניות בגבולות התא. יש לנו ניצלו את cryotape עבור מגוון רחב של סוגי רקמות 5-13. אנשי מעבדה עם ניסיון היסטולוגית מוגבל יכולים לייצר חלקים באיכות גבוהה עם שיטה זו. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם העלות הנמוכה יחסית (לא מכשור מיוחד, <1.00 $ לכל שקופית), ללא אובדן של שברי סלעים,ואת היכולת לבצע מספר שלבים של מכתים והדמיה על אותו סעיף.

בגלל הדמיה מאותם אזורים של מספר פעמים שקופית החזרה יהיה זה בלתי סביר עבור מספר גדול של שקופיות אפילו באמצעות הבמה ממונע, שלב קריטי נוסף של פרוטוקול זה הוא ניצול של מיקרוסקופ שקופיות סריקה להגדיל עקביות התפוקה. המיקרוסקופ הוא סורק שקופיות דיגיטלי הפועלת הן תחת epifluorescence ואור מועבר. הוא מצויד עם צריח ממונע 10 עמדה ושניהם B & W ומצלמות צבע. החידוש האמיתי של המערכת, בידינו, הוא כי באזורים ספציפיים של עניין ניתן בקלות ובמהירות מוגדר על ידי המשתמש או מזוהה באופן אוטומטי על ידי תוכנת ההדמיה. אזורים אלה של עניין ניתן לשמור אז מן הסיבוב הראשון של הדמיה ולאחר מכן מחדש במהירות במהלך הסיבובים שלאחר מכן. לכן, באותו אזורים של עניין הם צילמו במהלך כל סיבוב של הדמיה. בהתבסס על ידי המשתמשפרמטרים מוגדרים בתוכנה, המיקרוסקופ יהיה פוקוס אוטומטי לסרוק תמונות רעפים כי הם תפרו במהלך הרכישה בתוך אזורים של עניין.

הצו שבאמצעותו המשתמש מבצע סבבים רבים של מכתים חשוב. הסדר הכללי המתואר באיור 1. מספר fluorophores כי ניתן להפריד מספיק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא הגורם המגביל העיקרי למספר אמצעי המענה שניתן לרכוש בקטע. עם זאת, ניתן לעשות שימוש חוזר ערוצי ניאון במקרים מסוימים. למשל, calcein כחול ושניהם demeclocycline פולטים איתות חזקה בערוץ הצהוב המשמשת למדידת פעילות TRAP. לדמם דרך זה הוא נמנע אף כי למאגר TRAP decalcifies הסעיף, ובכך להסיר את מינרליים לפני הדמיה הפעילות TRAP. בנוסף, counterstain DAPI יפלוט בערוץ הצהוב גם כן. עם זאת, המשתמש יכול להחליף DAPI עם counterstain אחר הדואר מגוון אדום או מרחיקות אדום. בנוסף, נוגדנים ניתנים הפשיטו מחדש מוכתמים נוגדנים שונים באמצעות אותם ערוצי הניאון. לכן, שיטה זו היא די להתאמת הגדלת מספר צעדים בתגובה כי ניתן להקליט על קטע נתון.

ישנן מגבלות מסוימות עם הפרוטוקול המובא. 1) cryotape לא יכול לדבוק מספיק לרקמות מסוימות. למשל, חלקים במוח קבוע בפורמלין נוטים ליפול הקלטת לאחר כמה סבבים של מכתים. עבור רקמות כגון זו, מערכת העברת הסרט יכולה להיות מתאימה יותר כמו הרקמה מודבק על משטח הזכוכית באמצעות דבק מופעל UV (ראה טבלה 2 להשוואה בין שתי שיטות). 2) דבק chitosan, תוך מתן תכונות אופטיות שקופים, לא ישרדו מדרגות עיבוד קשים הכוללים טמפרטורות גבוהות או חומצות חזקות. לכן, דבק המופעל UV מתאים יותר עבור יישומים אלה (ראו טבלה 1 fאו השוואה בין שני דבקים אלה).

פרוטוקולי cryohistological המוצג כאן גם להשאיל את עצמם תפוקה ואוטומציה גבוהות. למשל, ייצוב הסרט שמספק cryotape מאפשר למשתמשים מתחילים יחסית לחתוך עצמות או מפרקים מרובים בו-זמנית באותו הבלוק, הגדלת תפוקה באופן משמעותי. באמצעות סורק אוטומטית מפחית באופן משמעותי טכנאי זמן ועלות קשור הדמיה, אשר בדרך כלל כבר את צעד שער הגבלה מניסיוננו. יכולת בעקביות ובאמינות תמונה באותו האזור של פעמי עניין כמה בתוך פרק זמן קצר של זמן מספק פלטפורמה אוטומטית, ניתוח אובייקטיבי של רקמות. למעשה, הקבוצה שלנו פתחה פלטפורמה עבור יישור מחשב אוטומטי histomorphometry של עצם. ראשית, התוכנה מיישרת את הסבבים הרבים של תמונות על סמך סמני התייחסות הניאון. לאחר מכן, את התמונות המיושרות מוזנות לתוך צינור histomorphometry שבו ייצור האוטואה תוכנה מגדיר את האזור של עניין ואובייקטיבי מודד כמה מדידות סטטיים ודינמיים (ראה עוד www.bonebase.org) 13. פלטפורמה זו התאפשרה בשל התפוקה והעקביות המוגברים שמספקת חתך cryotape, מיקרוסקופ שקופיות סריקה הדיגיטלית, תוכנת ניתוח מותאם אישית. פרוטוקול זה מייצג התקדמות משמעותית cryohistology תפוקה גבוהה צריך להיות שימוש לאלה הדמיה קשה לרקמות סעיף כגון עצם, כמו גם אלה חתך מנוסה עם רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 115 תפוקה גבוהה cryosectioning cryotape דימות פלואורסצנטי תוויות מינרליזציה חלבוני ניאון הדמית multiphoton
תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L.,… More

Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter