בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש צורך הולך וגובר בפנוטיפ והיסטופתולוגיה יעילים של מגוון רקמות. הצורך הזה בפנוטיפ ניכר בפרויקטים השאפתניים לשבש כל גן בגנום העכבר. קהילת המחקר זקוקה לאמצעים מהירים וזולים לפנוטיפ רקמות באמצעות היסטולוגיה. ניתוחים היסטולוגיים של רקמות השלד הם לרוב גוזלים זמן וכמותיים למחצה במקרה הטוב, ודורשים באופן קבוע פרשנות סובייקטיבית של שקופיות מאנשים מאומנים. כאן, אנו מציגים פרדיגמה קריוהיסטולוגית לפנוטיפ יעיל וזול של רקמות מינרליות. ראשית, אנו מציגים שיטה חדשה של הקפאה מיוצבת סרט המשמרת את המורפולוגיה של רקמות מינרליות. לאחר מכן חלקים אלה מודבקים בצורה נוקשה לשקופיות זכוכית ומצולמים שוב ושוב על פני מספר סבבי צביעה. לאחר מכן, התמונות המתקבלות מיושרות באופן ידני או באמצעות תוכנת מחשב כדי להפיק ערימות מורכבות של מספר תמונות בשכבות. הפרוטוקול מאפשר לוקליזציה משותפת של אותות מולקולריים רבים לתאים ספציפיים בתוך קטע נתון. בנוסף, ניתן לכמת את האותות הפלואורסצנטיים הללו באופן אובייקטיבי באמצעות תוכנת מחשב. פרוטוקול זה מתגבר על רבים מהחסרונות הקשורים להיסטולוגיה של רקמות מינרליות ויכול לשמש פלטפורמה לפנוטיפ בעל תפוקה גבוהה ותכולה גבוהה של רקמות שריר ושלד בתנועה קדימה.
מבוא
מחקר ביולוגי לעתים קרובות דורש phenotyping ביותר, אשר מזוהה לעתים קרובות עם איזשהו ניתוח היסטולוגית 1-3. צורך זה בולט עוד יותר עם פרויקטים שאפתניים לשבש כל גן של העכבר הגנום 4. ניתוחים היסטולוגית אלו יכולים לנוע בין הערכת מורפולוגיה תאים ו / או תכונות אנטומיות לביטוי מיפוי של גנים ספציפיים או חלבונים בתאים בודדים. למעשה, אחת תרומות יסוד של היסטולוגיה לתחום הגנומיקה היא היכולת לקשר בין אות מולקולרית ספציפית לסוג באזור או תאים ספציפי.
שיטות מסורתיות של היסטולוגיה, במיוחד עבור רקמות שריר-שלד, הם בדרך כלל זמן רב ומייגע, מחייב לפעמים שבועות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
האוניברסיטה של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים מרכז בריאות קונטיקט ושימוש אישר את כל הנהלים בעלי חיים.
קיבוע 1. והטבעה
- להרדימו באמצעות מחנק CO 2 או שיטות מאושרות אחרות.
- קציר את הרקמה של עניין (למשל, איבר, חוליות, וכו ') ומניחים 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו על 4 מעלות צלזיוס עד שיתוקן כראוי. קח טיפול מיוחד כדי לשמור על מיקום האנטומי עקבי לפני הקיבוע. למשל, לתקן גפיים עם מפרקים על כיפוף עקבי, וסיבוב פנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבודה כללית עבור התפוקה הגבוהה, רבה-תמונת Cryohistology
איור 1 מייצג את זרימת העבודה הכללית המשמשת עבור טכניקה זו. היא כוללת מספר צעדים מן הקיבעון דרך מספר סבבי ההדמיה ולבסוף יישור תמונה / ניתוח. התהליך יכול לקחת קצת כמו בשבוע לצאת מן הקיבעון מדגם דרך 4 סיבובים של הדמיה, המהווה פחות זמן ממה שנדרש כדי decalcify אלה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן הצגנו פרוטוקול cryohistology מפורט לשתף למקם ולכמת כמה צעדים ביולוגיים על ידי יישור תמונות סבבים רבים של מכתים / הדמיה על קטע יחיד. השיטה התוותה באמצעות cryotape שימושית במיוחד כפי שהיא שומרת את המורפולוגיה של קשה רקמות סעיף (למשל, עצם וסחוס mineralized). בנוסף, רקמת מחולק היא דבקה בחוזקה לשקופית זכוכית, המאפשר סבבים רבים של מכתים / הדמיה של אותו סעיף; בניגוד לשיטות מסורתיות שם קטעי סדרה הם כל מוכתם בפרוטוקול אחר. באמצעות קטעי סדרה יכול להוות בעיה כאשר מנסים לשתף בתרג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להכיר במקורות המימון הבאים: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 ו-T90-DE021989.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% פורמלין ניטרלי | חומצי סיגמא אולדריץ' | HT501128-4L | מספר ספקים זמינים. רעיל. ניתן להחליף ב-4% פרפורמלדהיד. |
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' | S9378 | מספר ספקים זמינים. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | מספר ספקים זמינים. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | ניתן להשתמש בגדלים שונים בהתאם לרקמה |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | ניתן להחליף בקריומטריה אחרת. עם זאת, שרפים מבוססי PVA/PEG עבדו הכי טוב בידיים שלנו. |
| 2-מתיל-בוטאן | סיגמא אולדריץ' | M32631 | מספר ספקים זמינים. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | במותגים/דגמים אחרים. |
| דיסק דגימה | Leica Biosystems | 14037008587 | ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים. |
| להבי Cryostat | Thermo Scientific | 3051835 | ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | במותגים/דגמים אחרים. |
| שקופיות מיקרוסקופ פלסטיק | מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים | 71890-01 | ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים. |
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית | Thermo Scientific | 3051 | ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים. |
| דבק אופטי נורלנד, 61 | דבק אופטי נורלנד אופטי | נורלנד, 61 | |
| אור שחור UV | ג'נרל אלקטריק | F15T8-BLB | |
| חומצה אצטית קרחונית | סיגמא אולדריץ' | ARK2183 | מספר ספקים זמינים. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | מספר ספקים זמינים. |
| מיקרוסקופים אדומים InSpeck | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | מספר ספקים זמינים. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | מספר ספקים זמינים. |
| קומפלקס אליזרין | סיגמא אולדריץ' | A3882 | מספר ספקים זמינים. |
| דמקלוציקלין | סיגמא אולדריץ' | D6140 | מספר ספקים זמינים. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | מספר ספקים זמינים. |
| גליצרול | סיגמא אולדריץ' | G5516 | מספר ספקים זמינים. |
| ELF 97 מצע פוספטאז חומצה פלואורסצנטית צהובה | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף ב-Hoechst 33342 או בצבעים גרעיניים אחרים. |
| TO-PRO-3 (כתם נגד גרעיני Cy5) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | מספר ספקים זמינים. |
| נתרן אצטט נטול מים | Sigma Aldrich | S2889 | מספר ספקים זמינים. |
| נתרן טרטרט דו-בסיסי דיהידרט | סיגמא אולדריץ' | T6521 | מספר ספקים זמינים. |
| נתרן ניטריט | סיגמא אולדריץ' | S2252 | מספר ספקים זמינים. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | מספר ספקים זמינים. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | מספר ספקים זמינים. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | מספר ספקים זמינים. |
| מהיר אדום TR מלח | סיגמא אולדריץ' | F8764 | מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף גם בערכות מצע אחרות כגון Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | סיגמא אולדריץ' | N4875 | מספר ספקים זמינים. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | מספר ספקים זמינים. |
| טולואידין כחול O | Sigma Aldrich | T3260 | מספר ספקים זמינים. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | ניתן להשתמש גם בסורקים ליניאריים או אריחים אחרים. |
| סט מסנני DAPI | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| סט מסנני CFP | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| סט מסנני GFP | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| סט מסנני YFP | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| סט מסננים צהוב מותאם אישית (ELF 97) | Chroma Technology Corp. | מנהג; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC סט מסננים | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 סט מסננים | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane מערכת העברת קלטות | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 62800-10 | מספר ספקים זמינים. |
| CryoJane קלטת חלונות | אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה | 62800-72 | מספר ספקים זמינים. |
| CryoJane דבק שקופיות אלקטרונים | מדעי מיקרוסקופיה | 62800-4X | מספר ספקים זמינים. |
מקורות
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
