Introduction
La ricerca biologica richiede spesso fenotipizzazione efficiente, che è frequentemente associata con una sorta di analisi istologica 1-3. Questa necessità è ancora più evidente con progetti ambiziosi per interrompere ogni gene nel genoma murino 4. Queste analisi istologiche possono variare da valutare la morfologia delle cellule e / o le caratteristiche anatomiche di espressione mappatura di specifici geni o proteine alle singole celle. Infatti, uno dei contributi fondamentali istologia al campo della genomica è la possibilità di associare un segnale molecolare specifico per una regione o cella specifica tipologia.
I metodi tradizionali di istologia, in particolare per i tessuti muscolo-scheletrici, sono spesso in termini di tempo e laborioso, che richiede a volte settimane per riparare, Decalcificare, sezione, macchia, e l'immagine del campione poi analizzare le immagini tramite interpretazione umana. Analizzando i segnali molecolari multipli, sia tramite immunoistochimica, in situ hybridizatione, o colorazioni speciali, richiede più sezioni e anche campioni multipli per eseguire in modo appropriato. Inoltre, queste risposte multiple non possono essere co-localizzate alla stessa cella e talvolta non possono essere co-localizzato ad una regione specifica all'interno di un dato campione. Come il campo della genomica e epigenomics muove nell'era digitale, il campo istologico deve seguire l'esempio di fornire efficiente e di alta produttività, e l'analisi automatizzata di una varietà di segnali molecolari all'interno di una singola sezione istologica.
Infatti, vi è una domanda per il miglioramento delle tecniche istologiche che possono associare segnali molecolari multipli a cellule specifiche all'interno di un dato campione. Recentemente, abbiamo pubblicato un nuovo metodo cryohistological high-throughput per valutare diverse misure di risposta all'interno di una data sezione di tessuto mineralizzato 5-14. Il processo prevede la stabilizzazione del cryosection con cryotape congelati, aderendo alla sezione registrata rigidamente ad un vetrino da microscopio, elo svolgimento di diversi cicli di colorazione e di imaging su ogni sezione. Questi cicli di immagini vengono quindi allineati manualmente o tramite computer automazione prima analisi di immagine (Figura 1). Qui, vi presentiamo protocolli dettagliati di questo processo e fornire esempi in cui queste tecniche hanno migliorato la nostra comprensione dei diversi processi biologici.
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Protocol
L'Università del Connecticut Health Center comitato cura degli animali istituzionale e l'uso approvato tutte le procedure animali.
1. Fissazione e Embedding
- Eutanasia dell'animale tramite CO 2 asfissia o altri metodi approvati.
- Raccogliere il tessuto di interesse (ad esempio, degli arti, vertebre, etc.) e il luogo nel 10% formalina tamponata neutra a 4 ° C fino fissata correttamente. Fare particolare attenzione a mantenere la collocazione anatomica coerente prima della fissazione. Per esempio, fissare gli arti con giunti a flessione costante, rotazione interna e rotazione esterna angoli 11. In genere, correggere gli arti interi del mouse per 1 - 3 giorni.
Attenzione: formalina è tossico e deve essere manipolato in una cappa aspirante indossando opportuni dispositivi di protezione individuale.
Nota: I tempi di fissaggio dipende dalle dimensioni del campione. Se l'esperimento permette, tagliare aperta l'osso migliorerà fissaggio del vano osseo.Alcuni esemplari possono richiedere la perfusione di fissaggio 15 per minimizzare sfondo fluorescente (ad esempio i segnali fluorescenti deboli all'interno del midollo osseo). - Trasferire i campioni da formalina al 30% di saccarosio made in 1x PBS e incubare per 12 - 24 ore a 4 ° C.
Nota: una volta incubato per 12 - 24 ore, i campioni possono essere messi a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Questo metodo è consigliato di immagazzinaggio per esperimenti in cui i ricercatori intendono incorporare campioni multipli nello stesso blocco, ma non possono raccogliere tutti questi campioni allo stesso tempo (ad esempio, esperimenti con più punti di tempo). - Rimuovere i campioni dal saccarosio e sezionare via qualsiasi tessuto in eccesso.
- Riempire una cryomold (dimensione di muffe dipende dalla dimensione del campione) un pezzo di strada con crio mezzo di inclusione. Posizionare campione in stampo tale piano di taglio per la regione di interesse è parallelo al fondo dello stampo.
Nota: Un esempio di posizionamento tessuto specifico e l'orientamentopuò essere trovato in Figura 2A - B. - Posizionare il cryomold su un pezzo di ghiaccio secco fino a un sottile strato di crio embedding blocca medie e corregge successivamente il campione al suo posto. Riempire il volume rimanente del cryomold con crio mezzo di inclusione mantenendo la cryomold sul pellet di ghiaccio secco.
- Posizionare il cryomold in un recipiente contenente 2-metil-butano pre-raffreddata mediante ghiaccio secco. Una volta che i campioni sono completamente congelati, rimuovere cryomolds e scrollarsi di dosso l'eccesso 2-metil-butano. Avvolgere cryomolds in cellophane e posto in una -20 ° C o -80 ° C per una conservazione.
Nota: I campioni possono seccare nel tempo se conservato in crio mezzo di inclusione, soprattutto a -20 ° C. Si consiglia di conservazione dei campioni per più di 1 - 2 mesi di crio mezzo di inclusione a -80 ° C o nel 30% di saccarosio a -80 ° C (vedi punto 1.3).
2. tessuto sezionamento Tape-stabilizzato
- Rimuovere i blocchi di campioni dal congelatore e mettere in cryostat con la temperatura impostata fra -20 e -25 ° C.
- Rimuovere il blocco dal cryomold e tagliare l'eccesso di crio mezzo di inclusione con una lama di rasoio.
- Porre un crio mezzo di inclusione sul disco dei campioni e quindi allineare il blocco in modo che la superficie del disco di preparato è parallela alla superficie inferiore del blocco stabilendo così il piano di taglio corretta per la regione di interesse.
- Inserire il disco di preparato nel criostato e consentire la crio mezzo di inclusione di congelare.
- Posizionare il disco di preparato sulla testa del preparato e regolare la testa in modo che la lama taglia paralleli alla superficie del blocco campione.
- Tagliare il blocco fino ad un livello entro la regione di interesse e spazzolare i trucioli dalla superficie del blocco.
- Tagliare un pezzo di cryotape abbastanza grande da coprire la regione di interesse e pre-raffreddamento nel criostato.
Nota: pezzi multipli possono essere tagliati di misure coerenti e memorizzati all'interno del cryostin durante il sezionamento. - Rimuovere il sostegno non aderente dal cryotape afferrando il nastro dalle linguette non appiccicosa argento / oro con pinze quindi inserire il nastro sul blocco appiccicoso rivolto verso il basso.
- Applicare pressione al cryotape con il rullo (Figura 2C).
- Effettuare una sezione (5-8 micron) utilizzando il motore automatico o ruota di taglio manuale del criostato.
Nota: E 'buona norma tenere il bordo del cryotape come viene sul palco in modo tale che la sezione non cade dal palco durante il sezionamento (Figura 2D). - Posizionare il lato sezione di tessuto su un vetrino da microscopio di plastica all'interno del criostato.
- Rimuovere il vetrino plastica dal criostato e lasciare il mezzo crio incorporamento per fondere tale che la sezione aderisce alla superficie del vetrino.
- Ripetere l'operazione di sezionamento per le sezioni di serie o in altre regioni di interesse.
- Una volta terminato, memorizzare le sezioni in una scatola di presentazione di unt 4, -20 o -80 ° C a seconda della lunghezza di memoria richiesta e le misure di risposta a valle. Ad esempio, utilizzare le diapositive che stanno per essere macchiato per l'attività enzimatica (vedi 5,2-5,3) entro un mese se conservato a 4 ° C.
3. Adesione delle sezioni di vetrini da microscopio
- Metodo di adesivi a polimerizzazione UV.
- Etichettare il vetrino da microscopio.
Nota: Per maggiore automazione, i campioni e le diapositive possono essere etichettati con codici a barre. - Applicare una goccia di adesivo ottico UV-attivato per due vetrini e usare il bordo di una slitta di plastica per diffondere un sottile strato di adesivo sulla superficie dei vetrini.
- Tagliare la scheda d'argento / oro e gettare il lato registrato sezione di tessuto sul collante della prima diapositiva. Applicare la sezione in un moto di rollio da un bordo all'altro per minimizzare la formazione di bolle intrappolate sotto il nastro.
NOTA: La prima diapositiva viene utilizzato per pre-bagnare la parte inferiore di tegli nastro prima della sua immissione sul secondo vetrino (permanente) (fase 3.1.4). - Rimuovere la sezione registrata dalla prima slitta e posizionarlo sullo strato adesivo della seconda slitta (Figura 3A). Anche in questo caso, fare attenzione ad evitare l'intrappolamento di bolle.
NOTA: Questo passaggio richiede pratica per padroneggiare. - Una volta che il numero appropriato di sezioni per il dato esperimento è posto su ogni diapositiva, pulire l'eccesso di adesivo dalle zone circostanti.
- Controllare ogni sezione attentamente per bolle o fibre sotto il nastro. Eseguire questa ispezione sotto una lente d'ingrandimento microscopio o. Se ci sono ostruzioni, rimuovere la sezione individuale, rimuovere le ostruzioni, e quindi nuovamente alla vetrino.
- Una volta che si è determinato che non ci siano ostacoli sotto le sezioni registrate, collocare i vetrini da microscopio sotto la luce nera UV per 5 - 10 minuti per reticolare l'adesivo.
- Etichettare il vetrino da microscopio.
- metodo adesivo chitosano.
- preparare °e 1% adesivo chitosano. Preparare la soluzione di acido acetico sciogliendo 0,25 ml di acido acetico concentrato in 100 ml di acqua deionizzata (0,25% v / v). Sciogliere 1 g di polvere di chitosano in 100 ml di soluzione di acido acetico e agitare la soluzione O / N o fino a che la polvere chitosano è disciolto.
NOTA: La soluzione è stabile a temperatura ambiente. - Depositare una goccia di soluzione di chitosano per ogni sezione che verranno messi sul vetrino.
- Tagliare la scheda d'argento / oro del nastro e posizionare ogni lato nastro tessuto sezione su sopra l'adesivo (Figura 3A). Usare la massima cura per evitare l'intrappolamento di bolle.
- Una volta che tutte le sezioni sono poste sul vetrino, inclinare il vetrino su uno dei suoi bordi lunghi e trascinare chitosano eccessiva al bordo inferiore con pinze.
- Posizionare i vetrini in questo orientamento sopra un tovagliolo di carta in una scatola diapositiva. La gravità sarà quindi causare l'eccesso di chitosano a cadere verso il basso sulla asciugamano, ottenendo uno strato piatto e uniforme di chitosano.
- PlaCe la casella di scorrimento con il coperchio appoggiato aperta in frigorifero O / N per consentire il chitosano si asciughi.
NOTA: Vedi Tabella 1 per un confronto tra i due metodi adesive.
- preparare °e 1% adesivo chitosano. Preparare la soluzione di acido acetico sciogliendo 0,25 ml di acido acetico concentrato in 100 ml di acqua deionizzata (0,25% v / v). Sciogliere 1 g di polvere di chitosano in 100 ml di soluzione di acido acetico e agitare la soluzione O / N o fino a che la polvere chitosano è disciolto.
4. Applicazione di riferimento marcatori di diapositive
- Preparare la soluzione di riferimento marcatore sciogliendo 50 ml di verde e 50 ml di microsfere rossi in 100 ml di acqua. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
- Posizionare un 10 ml o 20 ml punta della pipetta nella soluzione di microsfere. Aggiungere una piccola goccia della soluzione microsfere a ciascuna sezione adiacente alla regione di interesse (Figura 3C). Fare attenzione a non ottenere le microsfere all'interno della regione di interesse.
- Asciugare le diapositive a temperatura ambiente (al riparo dalla luce) per 30 minuti se l'elaborazione delle diapositive in quel giorno. In caso contrario, inserire le diapositive in una scatola di scorrimento a 4 ° C.
Nota: Finché la soluzione microsfere asciuga prima idratare i vetrini, la microspheres rimarranno aderito alle diapositive durante vari cicli di colorazione / imaging.
5. vari cicli di colorazione
NOTA: Scegliendo una sequenza compatibile dell'imaging, colorazione, e gradini di re-imaging, è possibile rilevare e co-localizzare molti segnali biologici sulla stessa sezione di tessuto. Ogni round di immagini / colorazione / reimaging deve essere sviluppato per la particolare domanda istologico. La sequenza di immagini / colorazione / re-imaging in genere comporta l'acquisizione dei segnali fluorescenti endogeni (ad esempio, GFP cellulare, coloranti mineralizzazione, in vivo sonde di imaging) sul primo turno delle immagini a fluorescenza seguita da immunoistochimica multiplex e vari cicli di macchie di attività enzimatica. Infine, la sezione può essere colorato con coloranti cromogenici (ad esempio, H & E, blu di toluidina, safranina O, ecc) per evidenziare l'architettura dei tessuti. Presentati in questa sezione sono metodi personalizzati adattati daprotocolli disponibili commercialmente.
- Calceina colorazione blu per minerale accumulato
NOTA: Calceina blu colorazione produce una superficie minerale consistente che è suscettibile di analisi delle immagini automatizzata a differenza di contrasto campo scuro o interferenza differenziale (DIC) di imaging. Il problema con calceina colorazione blu è che lo spettro fluorescente sovrappone con tetraciclina ed etichettatura Demeclocycline. Pertanto, se il campione contiene queste etichette minerali, immagine delle etichette nel primo turno delle immagini prima della colorazione blu con calceina.- Se i segnali endogeni all'interno del tessuto vengono esposte prima di questa fase di colorazione, immergere le diapositive dalla precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1XPBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
- Preparare 30 mg / ml di soluzione di blu calceina in 2% NaHCO 3 (preparata sciogliendo 2 g NaHCO 3 in 100 ml di H 2 O e regolarezione a pH di 7,4 con HCl). Aliquotare e conservare la soluzione a -20 ° C.
- Immergere i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 1x PBS per 15 minuti per idratare le sezioni, se non è già idratato dal turno precedente.
- Rimuovere i vetrini e asciugare la parte posteriore ei bordi con un tovagliolo di carta.
- Applicare 100 - 500 ml di soluzione di blu calceina per vetrino e incubare per 10 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
- Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 10 minuti con 3 cambi.
- Applicare ~ 200 ml di 50% glicerolo in PBS 1x per ogni diapositiva e montare il vetrino.
- Rimuovere l'eccesso di glicerolo e asciugare il fondo delle diapositive.
- Tartrato-resistente all'acido fosfatasi (TRAP) enzimatica attività colorazione
NOTA: TRAP è espresso da più tipi di cellule del lignaggio ematopoietico compreso osteoclasti. La colorazione TRAP qui presentata utilizza un substrato fluorescente fosfatasi acida di colore giallo. Alcuni segnali fluorescenti saranno OvERLAP con il set filtro giallo personalizzati tra cui tetracicline / etichette demeclociclina mineralizzazione, calceina macchia blu, e DAPI di contrasto.- Immergere i vetrini dal precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1x PBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
- Preparare Buffer 1 sciogliendo 9.2 g di sodio acetato anidro e 11,4 g di tartrato sodico bibasico diidrato in acqua e portando il volume finale a 1000 ml. Regolare il pH a 4,2 con acido acetico glaciale concentrato (~ 1,5 - 2 ml). Conservare la soluzione a 4 ° C per un massimo di 12 mesi.
- Preparare Buffer 2 sciogliendo 40 mg di nitrito di sodio in acqua e portando il volume finale a 1 ml. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 settimana.
- Il giorno della colorazione, preparare il tampone di reazione miscelando 7,5 ml di tampone 1 e 150 ml di tampone 2.
- Applicare il tampone di reazione senza il substrato alla slittas per 10 - 15 minuti per equilibrare il tessuto al pH inferiore.
NOTA: Il volume tipico è ~ 200 microlitri, ma deve essere sufficientemente grande per coprire tutte le sezioni. - Diluire fluorescente substrato fosfatasi acida giallo tra 1:50 e 1: 100 in tampone di reazione.
NOTA: diluizione sarà dettata dalle attività TRAP all'interno del campione. - Versare il tampone di reazione off delle diapositive e applicare il tampone di reazione con il substrato giallo fluorescente alle diapositive.
- Porre i vetrini sotto la luce nera UV per ~ 5 minuti per attivare il substrato.
NOTA: il tempo di incubazione può variare in base all'attività TRAP all'interno del campione. - Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 10 minuti con 3 cambi.
- Applicare ~ 200 ml di 50% glicerolo in PBS 1x per ogni diapositiva e montare il vetrino.
- Rimuovere l'eccesso di glicerolo e asciugare il fondo delle diapositive.
NOTA: Il buffer TRAP acida sarà decalcificazione sezioni. Il vantaggio del decalcificazione è che alcuni colori saranno di nuovo disponibili per la colorazione a valle (ad esempio, etichette mineralizzazione). Per esempio, la colorazione blu calceina verrà rimosso durante la colorazione TRAP. Pertanto, DAPI di contrasto può essere ripreso in questo canale durante un round successivo.
- La fosfatasi alcalina (AP) attività enzimatica colorazione
NOTA: più tipi di cellule coinvolte con mineralizzazione compresi osteoblasti e condrociti mineralizzanti esprimere AP. Il substrato Red veloce utilizzato in questo protocollo suscita sia un segnale rosso rosso e cromogenico fluorescente. A causa di questo, il substrato cromogenico spegnerà segnali fluorescenti nelle regioni dove il substrato precipitati. Pertanto, è meglio farlo macchia dopo l'imaging i segnali fluorescenti che possono essere placata dal substrato AP.- Immergere i vetrini dal precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1x PBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Remove e asciugare i coprioggetto.
- Preparare 1 M Tris sciogliendo 12,1 g di Tris in 100 ml di acqua. Regolare il pH a 9,5 con 1 M NaOH.
- Preparare 1 M MgCl 2 esaidrato sciogliendo 20,33 g di MgCl 2 in 100 ml di acqua deionizzata.
- Preparare 2 M NaCl sciogliendo 11,68 g di NaCl in 100 ml di acqua deionizzata.
- Preparare 100x (20 mg / ml) soluzione stock di Fast Red TR Salt sciogliendo 1 g di polvere in 50 ml di acqua deionizzata. Fai aliquote di 100 microlitri e conservare a -20 ° C.
- Preparare 100x (10 mg / ml) naftol AS-MX fosfato di soluzione sciogliendo 500 mg di polvere in 50 ml di N, N dimetilformamide. Fai aliquote di 100 microlitri e conservare a -20 ° C.
- Il giorno della colorazione, preparare il tampone AP aggiungendo 1 ml di 1 M Tris, 0,5 ml di 1 M MgCl 2, 0,5 ml di 2 M NaCl e portare il volume finale a 10 ml con acqua deionizzata (concentrazioni finali: 100 mM Tris, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl).
- Posizionare AP BUffer su ciascun vetrino e incubare in una camera umida per 10 minuti a RT.
- Preparare tampone substrato AP diluendo 100x scorte di Fast Red TR Sale e naftolo AS-MX a 1x nel buffer di AP.
- Versare tampone AP off di diapositive e sostituire con il tampone del substrato AP. Incubare i vetrini per 5 - 10 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
NOTA: Il tempo di incubazione sarà dettata dall'attività AP del campione. - Lavare i vetrini 3x in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
- Montare il coperchio scivola con la soluzione DAPI di contrasto (1: 1000 diluizione DAPI nel 50% glicerolo in PBS 1x).
- Blu di toluidina O (TB) colorazione cromogenico
NOTA: poiché tutti i passi precedenti vengono esposte sotto il montaggio acquosa temporanea in soluzione PBS 50% glicerolo /, il passo cromogenico viene anche ripreso in ambiente acquoso. Tuttavia, la soluzione colorante può tendere a percolare nel tempo. Pertanto, si consiglia di immagine blu toluidina appena possibile dopo la colorazione.- Immergere i vetrini dalla precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin riempita con acqua deionizzata fino a che le scivola copertura cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
- Dopo aver rimosso i vetrini, sostituire con acqua fresca e incubare i vetrini per almeno 10 minuti in modo che i sali da PBS sono sufficientemente rimossi dal tessuto.
- Preparare 0,025% soluzione TB in acqua deionizzata.
- Porre i vetrini nella soluzione TB per 1-5 min.
NOTA: il tempo di incubazione dipende dalle preferenze dell'utente, ma deve essere tenuto coerente in tutti i campioni. - Riporre i vetrini in vaschetta Coplin con acqua e lavare i vetrini deionizzata 3x per 5 minuti ciascuna.
- Monte vetrino con il 30% glicerolo disciolto in acqua deionizzata (NON PBS 1X come questo farà sì che la macchia di percolare dal tessuto). NOTA: glicerolo montante può essere sostituito con sciroppo di fruttosio, che aiuta a prevenire la diffusione della macchia dal tessuto. Apreparare lo sciroppo di fruttosio, sciogliere 30 g di fruttosio in 10 ml di acqua deionizzata e si riscalda a 60 ° C fino a dissoluzione.
6. Giri multipli di Imaging
- Caricare i vetrini in vassoi microscopio (Figura 3D).
Nota: I vassoi sono caricati a molla. - Inserire i vassoi nella pila cassetto del microscopio slide-scansione (Figura 3E).
- Visualizza l'elenco profilo per caricare un profilo per ogni diapositiva con adeguati tempi di esposizione per ogni fluoroforo. Clicca sul nome della diapositiva di nominare ogni diapositiva manualmente o avere il software legge il codice a barre sull'etichetta diapositiva. Fare clic sul pulsante di anteprima di scansione inizio per prendere un'immagine di anteprima della diapositiva.
- Impostare le regioni di interesse nella procedura guidata di rilevamento dei tessuti e salvarli per successive serie di immagini. Una volta che ogni diapositiva è l'installazione, avviare il processo di scansione facendo clic sul pulsante di scansione di avvio.
Nota: Il sistema può contenere fino a 100 SLIdes alla volta. - Una volta che l'imaging è finito, esportare le immagini da ogni singolo giro di canale e di imaging come .tif o file .jpg per il montaggio e l'analisi delle immagini.
7. Immagine Assembly
- Metodo manuale utilizzando Photoshop (o simili software di editing delle immagini in grado di produrre immagini a più livelli).
- Aprire ogni immagine singolo canale da ogni round di imaging.
- Assemblare le singole immagini come livelli all'interno di una immagine composita. Per fare ciò, fare clic sul livello nella palette dei livelli da un'immagine. Quindi trascinare lo strato su un'altra immagine. Questa operazione drag and drop creerà un nuovo livello nell'immagine. Fate questo per tutte le altre immagini. In alternativa, utilizzare uno script (File> Script> File di carico in Pila ...) per automatizzare questo processo caricando più file di immagine come strati in una serie di immagini.
- Una volta che ogni immagine è elencato come un singolo livello nell'immagine composita, fare doppio clic sul nome del livello per rinominare il layers come necessario per discernere i diversi canali.
- Per vedere attraverso ogni livello e creare un'immagine veramente composito, cambiare il metodo di fusione per ogni strato da "normale" a "schermo" all'interno della palette dei livelli.
Nota: Per accelerare questo passaggio, cambiare un singolo strato di schermo, quindi fare clic destro sul layer, selezionare "Copia stile livello", quindi evidenziare tutti gli altri livelli e selezionate "incolla stile di livello" per applicare lo stile schermo all'altro strati. - Se desiderato, diminuire l'opacità (valore di variazione a 10 - 40%) dello strato cromogenico (cioè, blu di toluidina) per visualizzare meglio i segnali fluorescenti attraverso lo strato cromogenico.
Nota: Il microscopio a scansione piastrelle utilizzato in questo protocollo contiene i vetrini su 3 bordi, minimizzando la quantità di rotazione che può verificarsi alla slitta durante ogni turno di imaging. Pertanto, è molto più facile per l'utente di allineare manualmente le immagini senza dover ruotare le immagini derivateda diversi giri di imaging.
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Representative Results
Un flusso di lavoro generale per l'High-Throughput, Multi-Image Cryohistology
Figura 1 rappresenta lo schema generale utilizzato per questa tecnica. Esso comprende diversi passi dalla fissazione attraverso vari cicli di imaging e, infine, l'allineamento immagine / analisi. Il processo può richiedere un minimo di una settimana per andare dalla fissazione del campione attraverso 4 giri di immagini, che è meno tempo di quello necessario per decalcificazione questo tipo di campioni. L'ordine di imaging inizia in genere con i segnali endogeni che sono già presenti nel campione (ad esempio, GFP, etichette mineralizzazione, ecc), quindi immunostaining fluorescente multiplex seguita da saggi di attività enzimatica fluorescenti (ad es., TRAP, AP, etc.) e saggi di analisi del ciclo cellulare (ad es, UDE) e, infine, si conclude con un macchia cromogenico (ad esempio, blu di toluidina O, orloatoxylin, safranina O, etc.).
Esempio rappresentante di una caviglia 6 giovanile
Lo scopo di questo studio particolare è stato quello di dimostrare la correlazione tra l'espressione di diversi tipi di collagene (cioè, COL1A1, COL2A1, e Col10a1) con mineralizzazione della fibrocartilagine del sito tendine di Achille-osso inserimento (cioè, enthesis). Pertanto, un topo giornalista tripla transgenico fluorescente compresa COL1A1-GFPTpz, COL2A1-CFP, e Col10a1-mCherry è stato utilizzato per identificare le cellule che esprimono ogni transgene. Il primo turno delle immagini era di espressione del transgene endogena da un mouse a due settimane di età, che corrisponde a quando i mineralizza enthesis del tendine di Achille (Figura 4B). Il secondo giro di formazione immagine è stata poi condotta sullamultiphoton microscopio per acquisire immagini dell'architettura collagene tramite due fotoni generazione di seconda armonica (SHG, Figura 4C). Questo passo è stato utilizzato per identificare le cellule alla base delle fibre collagene all'interno enthesis. Il terzo round di immagini è stato un passo immunocolorazione per riccio indiano (IHH), che è uno dei principali ligandi di segnalazione che promuove la mineralizzazione della enthesis (Figura 4D). Il quarto round delle immagini era AP colorazione blu utilizzando un kit di substrato fosfatasi alcalina, che suscita sia la fluorescenza Cy5 e segnali cromogenici blu, di visualizzare le aree di deposizione minerale attivo (figura 4E). Infine, il quinto round delle immagini era TB colorazione per visualizzare le caratteristiche anatomiche, tra cui il contenuto di proteoglicani all'interno della fibrocartilagine (Figura 4F). Tutte le immagini sono state allineate manualmente all'interno del software di editing delle immagini. I cinque giri di immagini sono state condotte su un periodo di 4 giorni, che ha fatto seguito 3giorni di campione di trasformazione e di sezionamento (7 giorni in totale).
Esempio rappresentativo da un ginocchio per adulti congiunta 11
Lo scopo di questo esperimento era di determinare i cambiamenti di mineralizzazione che si verificano nel enthesis del legamento collaterale mediale (MCL) del ginocchio seguente destabilizzazione congiunta con transezione del legamento crociato anteriore (LCA). modifiche mineralizzazione possono essere visti nella MCL enthesis già due settimane dopo l'intervento chirurgico in questi 3 mesi di età topi. Per monitorare apposizione minerale della fibrocartilagine all'interno del enthesis, un'etichetta minerale è stato dato ai topi il giorno della chirurgia (demeclociclina) e il giorno prima del sacrificio (calceina) a 2 settimane dopo l'intervento chirurgico. I topi inclusi anche COL1A1-CFP e Col10a1-mCherry reporter fluorescenti per monitorare l'espressione del collagene di fibrochondrocyt unmineralized e mineralizzataes rispettivamente. La prima serie di immagini sia dei segnali endogeni, che in questo caso corrispondevano alle proteine fluorescenti e etichette fluorescenti mineralizzazione (Figura 5A). Il secondo turno incluso TRAP colorazione per dimostrare l'espressione di questo enzima in fibrocondrociti mineralizzanti nel enthesis così come osteoclasti nel midollo osseo sottostante (Figura 5B). Il terzo round era AP colorazione dimostrare regioni di mineralizzazione attivo di fibrocondrociti nonché osteoblasti dell'osso sottostante (Figura 5C). Infine, la tubercolosi colorazione è stata condotta per il quarto turno (Figura 5D). Tutte le immagini sono state allineate manualmente all'interno del software di editing delle immagini. Ancora una volta il tempo totale impiegato dalla vendemmia tessuto allineamento dell'immagine era di 7 giorni.
Esempio rappresentativo di trabecolare da distale del femore
(Figura 3B). Questo processo è stato condotto su 8 femmine e 8 topi maschi a 3 livelli differenti all'interno del midollo osseo, ottenendo un totale di 12 vetrini. I marcatori di riferimento (microsfere) sono stati applicati ai epifisi e la metà diafisi sulle sezioni secco (Figura 3C). Tutti i 12 vetrini sono stati colorati FOR calceina blu e ripreso per minerale accumulato (calceina blu) e le etichette di mineralizzazione (calceina e alizarin complexone) durante il primo turno delle immagini (figura 6A). I vetrini sono stati poi ripreso per l'attività TRAP (Figura 6B) nel secondo turno e l'attività di AP (figura 6C) nel terzo turno di imaging. Infine, le diapositive sono state colorate con blu di toluidina al quarto turno (Figura 6D). I marcatori di riferimento sono stati ripresi durante ogni turno di imaging, tra cui il giro cromogenico, e sono stati allineati con il software personalizzato. Per dare un'idea della portata di questa procedura, 32 ossa (16 femori e 16 vertebre) sono stati incorporati in 8 blocchi, 3 sezioni sono state prese da ogni blocco, le sezioni sono state distribuite in 12 diapositive, e le 12 vetrini sono stati ripresi 4 volte producendo 96 pile di immagini composite. Il tempo totale per eseguire questo esperimento era di 8 giorni.
Figura 1. tipico flusso di lavoro per il protocollo. Passi generali comprendono 1) tessuto di fissaggio, 2) criosezionamento nastro stabilizzato, 3) l'aderenza delle sezioni registrate di vetrini, 4) l'applicazione di indicatori di riferimento, 5) vari cicli di colorazione e 6) l'imaging, e 7) il montaggio delle immagini, allineamento, e l'analisi. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Embedding ad alta resa e Tape-stabilizzato criosezionamento. A causa della stabilità cryotape fornisce, più ossa possono essere incorporati, adiacenti (AB) e sezionato contemporaneamente (CD). Un pezzo di ghiaccio secco viene utilizzata durante ilprocesso di inclusione di fissare rigidamente le ossa a posto prima del congelamento dell'intero crio-blocco (B). Il cryotape è rotolato sul blocco (C) e la sezione resta attaccato al nastro durante sezionamento (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'adesione delle sezioni attaccata al vetro Slides, Applicazione di riferimento marcatori, e caricamento di diapositive nel vassoio di Slide-microscopio a scansione. Sezioni nastrate sono incollati alla superficie di vetrini sia con UV-indurimento o adesivo a base di chitosano (A ). Dopo indurimento o essiccazione, solo un sottile strato di adesivo piatta rimane tra la superficie cryotape e vetro (B). Riferimento markers vengono applicati alle diapositive secco (C, freccia goccia di soluzione microsfere). I vetrini sono poi montati in vassoi microscopio (D) e caricati nel microscopio (E). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. cinque round del Imaging del tendine di Achille di un mouse a due settimane di età. L'immagine pila composito (A) è stato creato da cinque round di imaging. Round 1 (B): endogena COL1A1-GFPTpz, COL2A1-CFP, e l'espressione del transgene Col10a1-mCherry. Round 2 (C): collagene generazione di seconda armonica (SHG) sul microscopio a due fotoni. Round 3 (D): immunocolorazione per IHH. Round 4(E): AP attività enzimatica. Round 5: toluidina O blu (F). Questa cifra è stata modificata da Dyment et al., 2015 6. Barra di scala = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. quattro turni di Imaging di MCL entesi seguito destabilizzazione comune. Ginocchia erano destabilizzati in tre mesi di età i topi, che porta ad un aumento della mineralizzazione della enthesis MCL. Un'etichetta minerale demeclociclina è stato dato il giorno dell'intervento e un'etichetta minerale calceina è stato dato il giorno prima del sacrificio. Round 1 (A): endogena COL1A1-CFP, espressione del transgene Col10a1-mCherry con demeclociclina e calceina etichette minerali. Round 2 (B) </ Strong>: attività enzimatica TRAP. Round 3 (C): AP attività enzimatica. Round 4 (D): blu di toluidina O. la trappola e il segnale AP è stato sovrapposti sulla parte superiore del segnale TB in pannelli aC. Il canale gialla può essere riutilizzato per TRAP perché il buffer TRAP decalcifica il tessuto, rimuovere l'etichetta demeclociclina. Questa cifra è stata modificata da Dyment et al. 2015 11. Barra di scala = 200 micron. Dem: Demeclocycline, TRAP: tartrato resistente fosfatasi acida, PA: fosfatasi alcalina, MCL: legamento collaterale mediale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. quattro turni di Imaging all'interno del femore distale contenenti microsfere di riferimento Marcatori. Tre mesi mice sono stati dati calceina e alizarin complexone etichette minerali Round 1 (AA '):. endogene calceina e alizarain complexone etichette, oltre a calceina colorazione blu del minerale accumulato Round 2 (BB.'): TRAP attività enzimatica Round 3 (CC '). :. AP attività enzimatica Round 4 (DD '): blu di toluidina O. le microsfere verdi sono stati ripreso durante ogni round (A'-D', la freccia indica la stessa microsfera in tutte le immagini). Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| adesivo chitosano | UV-polimerizzazione adesivo | |
| meccanismo di adesivo | Evaporazione | UVLa polimerizzazione |
| tempo di maturazione | > 24 ore | <20 min |
| Le sezioni possono essere rimossi dopo cure adesivo? | sì | No |
| È guarito solubile adesivo? | Sì, in soluzioni acide con basso pH | No |
| Ha adesivo resistere al calore di recupero dell'antigene? | No | sì |
| È adesivo auto-fluorescente? | No | Minimal nella gamma UV |
Tabella 1. Confronto tra chitosano adesivo e adesivo a polimerizzazione UV
| Cryotape | Tape-Transfer System | |
| Possibilità di sezione ossea mineralizzata con questo sistema? | sì | Sì, ma pezzi di osso mineralizzatonon può trasferire completamente alla slitta |
| Possibilità di sezione giunti mineralizzati che utilizzano questo sistema? | sì | sì |
| Possibilità di sezione del cervello con questo sistema? | Sì, ma il tessuto potrebbe cadere del nastro dopo vari cicli di immagini | sì |
| Possibilità di tagliare campioni multipli incorporati nello stesso blocco? | sì | sì |
| Possibile condurre vari cicli di immagini sulla stessa sezione? | sì | sì |
Tabella 2. Confronto tra Cryotape del sistema e del nastro di trasferimento del sistema
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Discussion
Qui abbiamo presentato una dettagliata protocollo cryohistology di co-localizzare e quantificare diverse misure biologiche allineando le immagini provenienti da vari cicli di colorazione / immagini su una singola sezione. Il metodo descritto usando l'cryotape è particolarmente utile in quanto mantiene la morfologia di difficile tessuti sezione (ad esempio, osso mineralizzato e della cartilagine). Inoltre, il tessuto sezionato viene fatto aderire saldamente al vetrino, consentendo più cicli di colorazione / immagini della stessa sezione; a differenza dei metodi tradizionali in cui sezioni seriali sono ciascuna macchiati con un protocollo diverso. Utilizzando sezioni seriali possono rappresentare un problema quando si cerca di co-localizzare i segnali tra le sezioni, qualcosa che non è un problema con singole sezioni che sono stati macchiati e ripreso con più turni.
Il primo tessuto prodotto sezionamento nastro stabilizzato sul mercato era un sistema di trasferimento a nastro 16, 17. Esso utilizza nastro di plastica rivestitacon un adesivo freddo che è posto sulla superficie della cryoblock tessuti. Quando la lama taglia criostato sotto il nastro, la sezione viene rimosso intatto e aderente al nastro. Successivamente il nastro viene posizionato lato campione giù su vetrini che sono rivestite con colla UV-curing tale che il tessuto viene fissato rigidamente alla diapositiva. Una volta che il nastro è sbucciata lontano dalla sezione, la slitta può essere lavorato sia per fluorescenza o istologia cromogenico. La fluorescenza di fondo degli adesivi è bassa, e vari cicli di colorazione e di imaging funziona bene con la maggior parte dei tessuti molli. Tuttavia, con sezioni mineralizzate, ci può essere la perdita di frammenti minerali durante il trasferimento del tessuto dal nastro adesivo ai vetrini. Inoltre, è un sistema relativamente costosi da installare nel criostato (> 8000 $) e costi di consumo sono alte (> $ 2 / vetrino).
Un'altra strategia di stabilizzazione del nastro sviluppato dal Dr. Tadafumi Kawamoto utilizza unadesivo rivestito pellicola di cloruro di polivinile per catturare la sezione di tessuto. Nel loro protocollo, un tessuto fresco congelato è sezionato sul nastro e subito fissato in PFA o etanolo 18. Successivamente, il nastro viene macchiata e poi montato su un vetrino con il lato campione a per l'esame microscopico. Così ogni protocollo di colorazione viene effettuata su una sezione diversa registrato.
Abbiamo modificato e aggiunto al protocollo Kawamoto in vari modi tra cui fissa il campione in formalina prima incorporamento. Questo passaggio è fondamentale per fissare la GFP citoplasmatica solubile di animali transgenici nei limiti della cella. Abbiamo utilizzato il cryotape per una vasta gamma di tipi di tessuto 5-13. Il personale di laboratorio con esperienza istologico limitata in grado di produrre sezioni di alta qualità, con questo metodo. I vantaggi principali di questo protocollo sono il relativo basso costo (senza strumenti speciali, <$ 1.00 per vetrino), nessuna perdita di frammenti di minerali,e la possibilità di eseguire più cicli di colorazione e di imaging nella stessa sezione.
Poiché l'imaging delle stesse regioni di uno scivolo più volte nella ripetizione sarebbe irragionevole per un gran numero di diapositive anche utilizzando una fase motorizzato, un altro aspetto critico di questo protocollo è l'utilizzo di un microscopio a scansione per aumentare la consistenza e la velocità. Il microscopio è uno scanner diapositiva digitale che opera sotto sia epifluorescenza e trasmessa. Esso è dotato di una torretta motorizzata 10 posizioni ed entrambi B & telecamere N ea colori. La vera novità del sistema, nelle nostre mani, è che regioni specifiche di interesse possono essere rapidamente e facilmente definiti dall'utente o rilevate automaticamente dal software di imaging. Queste regioni di interesse possono essere salvati dal primo turno di imaging e poi ricaricati rapidamente durante i turni successivi. Pertanto, le stesse regioni di interesse vengono esposte durante ogni turno di imaging. Sulla base dall'utentei parametri definiti nel software, il microscopio si autofocus e scansione di immagini affiancate che vengono cuciti durante l'acquisizione all'interno delle regioni di interesse.
L'ordine con cui l'utente esegue i vari cicli di colorazione è importante. L'ordine generale illustrato in Figura 1. Il numero di fluorofori che possono essere sufficientemente separati tramite microscopia a fluorescenza è il fattore limitante primario al numero di misure di risposta che possono essere acquisiti su una data sezione. Tuttavia, i canali fluorescenti possono essere riutilizzati in alcuni casi. Per esempio, calceina blu e demeclociclina entrambi emettono un segnale forte nel canale di colore giallo utilizzato per misurare l'attività TRAP. Questo spurgo-through viene evitata se perché il buffer TRAP decalcifica sezione, eliminando così il minerale prima di imaging dell'attività TRAP. Inoltre, colorante di contrasto DAPI emetterà nel canale gialla pure. Tuttavia, l'utente può sostituire DAPI con un altro di contrasto in the gamma di colore rosso o far-rosso. Inoltre, gli anticorpi possono essere rimossi e ri-colorati con diversi anticorpi utilizzando gli stessi canali fluorescenti. Pertanto, questo metodo è molto adattabile ad aumentare il numero di misure di risposta che possono essere registrati su una data sezione.
Ci sono alcune limitazioni con protocollo presentato. 1) Il cryotape non può aderire sufficientemente a determinati tessuti. Per esempio, le sezioni di cervello fissati in formalina tendono a cadere il nastro dopo vari cicli di colorazione. Per i tessuti come questa, il sistema di trasferimento del nastro può essere più appropriato come il tessuto viene fatto aderire alla superficie di vetro con adesivo UV-attivata (vedi Tabella 2 per il confronto tra questi due metodi). 2) L'adesivo chitosano, fornendo trasparenti proprietà ottiche, non sopravviverà fasi di lavorazione dure che comprendono alte temperature o acidi forti. Pertanto, l'adesivo UV-attivata è più adatto per queste applicazioni (vedi Tabella 1 fo confronto tra questi due adesivi).
I protocolli cryohistological qui presentati si prestano anche a un throughput più elevato e l'automazione. Per esempio, la stabilizzazione del nastro fornito dal cryotape permette agli utenti relativamente inesperti di taglio multiplo ossa o articolazioni contemporaneamente nello stesso blocco, aumentando notevolmente la velocità. Utilizzando uno scanner automatico riduce significativamente il tempo tecnico e dei costi relativi a immagini, che è in genere stato il fattore limitante nella nostra esperienza. Poter coerente e affidabile immagine stessa regione di interesse più volte in un breve periodo di tempo fornisce una piattaforma per automatizzata, analisi oggettiva dei tessuti. In realtà, il nostro gruppo ha sviluppato una piattaforma per l'allineamento del computer automatizzato e Istomorfometria di osso. In primo luogo, il software allinea i vari cicli di immagini basate sui marcatori di riferimento fluorescenti. Poi, le immagini allineate sono alimentati in una conduttura istomorfometria dove il computer software definisce la regione di interesse e misura oggettivamente diverse misurazioni statiche e dinamiche (vedere di più al www.bonebase.org) 13. Questa piattaforma è stato reso possibile a causa della maggiore produttività e coerenza fornita dal sezionamento cryotape, digital microscopio a scansione e software di analisi personalizzati. Questo protocollo rappresenta un avanzamento significativo in alta cryohistology throughput e dovrebbe essere utile a coloro dell'imaging difficile tessuti sezione come il midollo così come quelli inesperti con sezionamento tessuto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
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