Introduction
Biologisk forskning krever ofte effektiv fenotyping, som er ofte forbundet med noen form for histologisk analyse 1-3. Dette behovet er enda mer tydelig med de ambisiøse prosjekter for å forstyrre hvert gen i musegenomet 4. Disse histologiske analyser kan være alt fra å vurdere celle morfologi og / eller anatomiske trekk til kartlegging uttrykket av spesifikke gener eller proteiner til individuelle celler. Faktisk er en av de grunnleggende bidragene fra histologi til feltet av genom evne til å knytte en spesifikk molekyl signal til en spesifikk region eller celletype.
Tradisjonelle metoder for histologi, spesielt for muskel vev, er ofte tidkrevende og arbeidskrevende, krever noen ganger uker for å fikse, avkalke, seksjon, beis, og bilde prøven deretter analysere bildene via menneskelig fortolkning. Analysere flere molekylære signaler, enten via immunhistokjemi, in situ hybridization, eller spesielle flekker, krever flere seksjoner og enda flere prøver å utføre riktig. I tillegg er disse flere svar kan ikke være co-lokalisert til samme celle, og noen ganger kan ikke være co-lokalisert til et bestemt område i et gitt mønster. Som genom og Epigenomics felt beveger seg inn i den digitale tidsalder, må den histologiske feltet også følge etter for å gi høy ytelse og høy gjennomstrømming, og automatisk analyse av en rekke forskjellige molekylære signaler i en enkelt histologisk seksjon.
Faktisk er det et behov for forbedrede histologiske teknikker som kan knytte flere molekylære signaler til spesifikke celler i en gitt prøve. Nylig har vi publisert en ny high-throughput cryohistological metode for å vurdere flere responstiltak innenfor en gitt seksjon fra mineralisert vev 5-14. Prosessen innebærer å stabilisere cryosection med frosne cryotape, man følger den teipet delen fast til et objektglass, oggjennomføre flere runder med flekker og bildebehandling på hver del. Disse rundene av bildene blir deretter justert manuelt eller via datamaskin automatisering før bildeanalyse (figur 1). Her presenterer vi detaljerte protokoller av denne prosessen, og gi eksempler hvor disse teknikkene har forbedret vår forståelse av ulike biologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The University of Connecticut Health Center institusjonelle dyr omsorg og bruk komité godkjente alle dyre prosedyrer.
1. Fiksering og Inkludering
- Avlive dyret via CO 2 kvelning eller andre godkjente metoder.
- Høste vev av interesse (f.eks lem, ryggvirvler, etc.) og plasser i 10% nøytral bufret formalin ved 4 ° C inntil skikkelig festet. Vær spesielt nøye med å opprettholde konsistent anatomisk plassering før fiksering. For eksempel, fikse lemmer med skjøter på konsistent fleksjon, intern rotasjon og ekstern rotasjon vinkler 11. Vanligvis fikse hele muse lemmer for 1 - 3 dager.
Forsiktig: Formalin er giftig og bør håndteres i en avtrekkshette mens iført egnet personlig verneutstyr.
Merk: tidsrammen for fiksering avhenger av størrelsen av prøven. Hvis forsøket tillater, vil klippe opp benet forbedre fikseringen av margrommet.Noen prøver kan kreve perfusjon fiksering 15 for å minimalisere fluorescerende bakgrunn (f.eks svake fluorescerende signaler i benmarg). - Overføring prøver fra formalin til 30% sukrose laget i 1 x PBS og inkuberes i 12-24 timer ved 4 ° C.
Merk: Når inkuberes i 12-24 timer, kan prøvene da bli plassert ved -80 ° C for langtidslagring. Denne lagringsmåte er anbefalt for eksperimenter hvor forskere har til hensikt å bygge inn flere prøver på samme blokk, men kan ikke høste alle disse prøvene samtidig (for eksempel forsøk med flere tidspunkter). - Ta prøver fra sukrose og dissekere bort overflødig vev.
- Fyll en cryomold (størrelse av mugg er avhengig av prøvestørrelse) en del av veien med cryo innstøpningsmediet. Plasser prøven i mold slik at å kutte plan for regionen av interesse er parallell med bunnen av formen.
Merk: Et eksempel på spesifikke vev plassering og orienteringkan finnes i figur 2A - B. - Plasser cryomold på et stykke tørris inntil et tynt lag av kryo innstøpningsmediet fryser og deretter løser prøven på plass. Fylle den gjenværende volumet av cryomold med cryo innstøpningsmediet under opprettholdelse av cryomold på tørris pellets.
- Plasser cryomold i en beholder inneholdende 2-metyl-butan pre-kjølt ved tørris. Når prøvene er helt frosset, fjerne cryomolds og rist av overflødig 2-metyl-butan. Pakk cryomolds i cellofan og plasser i en -20 ° C eller -80 ° C fryser for lagring.
Merk: Prøver kan tørke ut over tid ved oppbevaring i cryo innstøpningsmediet, særlig ved -20 ° C. Det anbefales lagring av prøver i mer enn 1 - 2 måneder i cryo innstøpningsmediet ved -80 ° C eller i 30% sukrose ved -80 ° C (se trinn 1.3).
2. Tape-stabilisert Tissue Seksjonering
- Fjern prøve blokker fra fryseren og plasser i cryostat med temperaturen ligger mellom -20 og -25 ° C.
- Fjern blokken fra cryomold og trimme vekk overflødig cryo innstøpningsmediet med et barberblad.
- Plassere noen cryo innstøpningsmediet på prøveplaten, og deretter justere den blokken, slik at overflaten av prøveplaten er parallell med bunnflaten av blokken for derved å etablere den riktige kutteplanet for den regionen av interesse.
- Plasser prøveplaten i kryostaten og la for kryo innstøpningsmediet å fryse.
- Plasser prøveplaten på prøvehodet og juster hodet slik at bladet skjærer parallelt til overflaten av prøveblokken.
- Trimme blokken ned til et nivå innenfor området av interesse og børste av eventuelle spon fra overflaten av blokken.
- Klipp et stykke av cryotape stor nok til å dekke regionen av interesse og pre-chill i kryostaten.
Merk: Flere brikker kan bli kuttet av konsekvente størrelser og lagret i cryostpå under seksjonering. - Fjern ikke-klebende backing fra cryotape ved å ta tak i båndet av den ikke-klebrig sølv / gull faner med tang plasser teip på blokken klebrig siden ned.
- Legg press på cryotape hjelp av roller (figur 2C).
- Lag en seksjon (5-8 mm) ved hjelp av enten automatisk motor eller manuell skjæring hjul av kryostaten.
Merk: Det er god praksis å holde kanten av cryotape som det kommer inn på scenen slik at seksjonen ikke faller av scenen under snitting (figur 2D). - Plasser delen vev siden opp på en plastobjektglass i cryostat.
- Fjern plast lysbilde fra kryostaten og tillate cryo innstøpningsmediet å smelte slik at seksjonen fester seg til overflaten av objektglasset.
- Gjenta seksjonering for seriesnitt eller andre områder av interesse.
- Når du er ferdig, lagre delene i et lysbilde boks ent 4, -20 eller -80 ° C, avhengig av lengden av lagrings kreves og nedstrømsrespons tiltak. For eksempel bruke lysbilder som kommer til å bli farget for enzymaktivitet (se 05.02 til 05.03) innen en måned dersom den oppbevares ved 4 ° C.
3. Adhesjon av §§ til objektglass
- UV-herdet lim metoden.
- Merk objektglass.
Merk: For økt automatisering, prøver og skred kan merkes med strekkoder. - Påfør en dråpe av UV-aktivert optisk klebemiddel til to glassplater og bruk kanten av et plastglide å spre et tynt lag av klebemiddel over overflaten av glassplater.
- Klipp av sølv / gull-kategorien og legge tapet seksjonen vev siden opp på limet av det første lysbildet. Påfør seksjon i en rullende bevegelse fra den ene kant til den andre, for å minimalisere dannelsen av innfangede bobler under båndet.
MERK: Første lysbilde brukes til å forhånds våt undersiden av than tape før du setter det på den andre (permanent) lysbilde (trinn 3.1.4). - Fjern tapet delen fra det første lysbildet og plasser den på limet laget av andre lysbilde (figur 3A). Igjen, ta vare å unngå entrapment av bobler.
MERK: Dette trinnet krever øvelse å mestre. - Når riktig antall seksjoner for gitt eksperiment er plassert på hvert lysbilde, tørk av overflødig lim fra de omkringliggende områdene.
- Inspiser hver del nøye for bobler eller fibre under båndet. Utfør denne kontrollen under et mikroskop eller forstørrelsesglass. Hvis det er hindringer, fjerne den enkelte seksjon, fjerne hindringer, og deretter bruke den på nytt til glass-slide.
- Når det er fastslått at det ikke er noen hindring under tapede seksjoner, plassere objektglassene under UV-svart lys i 5 - 10 minutter for å tverrbinde limet.
- Merk objektglass.
- Chitosan lim metoden.
- Forbered the 1% kitosan klebemiddel. Fremstille eddiksyreoppløsning ved oppløsning av 0,25 ml konsentrert eddiksyre i 100 ml DI-vann (0,25% volum / volum). Oppløs 1 g av kitosan-pulver i 100 ml eddiksyreløsning og omrør løsningen O / N eller inntil alt pulveret er oppløst chitosan.
MERK: Løsningen er stabil ved romtemperatur. - Deponere en dråpe kitosan løsning for hver del som vil bli plassert på lysbildet.
- Klipp av kategorien sølv / gull av båndet og sted hver tapet seksjon vev side opp på limet (figur 3A). Bruk stor forsiktighet for å unngå entrapment av bobler.
- Når alle delene er plassert på lysbildet, vipp lysbildet opp på en av sine lange kantene og dra dreven kitosan til nedre kant ved hjelp av tang.
- Plasser lysbilder i denne orienteringen på toppen av et papirhåndkle i et lysbilde boks. Tyngdekraften vil føre til at det overskytende kitosan for å falle ned på håndkleet, hvilket ga et flatt og jevnt lag av kitosan.
- Place raset boks med lokk publisert åpen i kjøleskapet O / N slik at kitosan tørke.
MERK: Se tabell 1 for en sammenligning mellom de to klebe metoder.
- Forbered the 1% kitosan klebemiddel. Fremstille eddiksyreoppløsning ved oppløsning av 0,25 ml konsentrert eddiksyre i 100 ml DI-vann (0,25% volum / volum). Oppløs 1 g av kitosan-pulver i 100 ml eddiksyreløsning og omrør løsningen O / N eller inntil alt pulveret er oppløst chitosan.
4. Bruk av referanse Markører til Slides
- Fremstille referansemerke oppløsning ved å oppløse 50 ul grønn og 50 ul av røde mikrokuler i 100 ul vann. Oppbevar løsningen i mørket ved 4 ° C.
- Plasser en 10 mL eller 20 mL pipette tips til mikro løsning. Legge til en liten dråpe av mikrosfæreløsning til hver seksjon som grenser til området av interesse (figur 3C). Vær nøye med å ikke få mikrokulene i regionen av interesse.
- Tørk lysbilder på RT (beskyttet mot lys) i 30 minutter hvis behandlingen av lysbilder på den dagen. Hvis ikke, plasserer lysbilder i en lysbilde boksen ved 4 ° C.
Merk: Så lenge mikro løsningen tørker før fuktighetsgivende lysbildene, MIcrospheres vil forbli levd opp til lysbildene under flere runder med farging / bildebehandling.
5. Flere Helg Farging
MERK: Ved å velge en kompatibel sekvens av bildebehandling, flekker, og reimaging trinn, er det mulig å oppdage og co-lokalisere mange biologiske signaler på samme vev delen. Hver runde med bildebehandling / farging / reimaging må utvikles for den spesielle histologiske spørsmålet. Bildebehandling / farging / reimaging sekvens vanligvis innebærer å anskaffe de endogene fluorescerende signaler (f.eks cellular GFP, mineralisefargestoffer, in vivo avbildning prober) på den første runden av bildebehandling etterfulgt av fluorescerende multiplex farging og flere runder med enzymatisk aktivitet flekker. Til slutt kan den delen farges ved hjelp av kromogene fargestoffer (for eksempel H & E, toluidinblått, safranin O, etc.) for å markere vevsarkitektur. Presenteres i denne delen er tilpassede metoder tilpasset frakommersielt tilgjengelige protokoller.
- Calcein blå flekker for akkumulert mineral
MERK: Calcein blåfarging gir en konsekvent mineral overflate som er mottagelig for automatisert bildeanalyse i motsetning mørkefelt eller differensial interferens kontrast (DIC) bildebehandling. Problemet med calcein blå flekker er at fluorescerende spektrum overlapper med tetracyklin og demeclocycline merking. Derfor, hvis prøven inneholder disse mineral etiketter, bilde etikettene i den første runden av bildebehandling før farging med calcein blå.- Hvis endogene signaler i vevet er avbildet før dette farging trinnet, senk lysbildene fra forrige bilde runde i en Coplin krukke fylt med 1 x PBS før dekkglass falle bort fra skinnene. Ta ut og tørk dekkglass.
- Fremstille 30 mg / ml av calcein blå oppløsning i 2% NaHCO3 (fremstilt ved å oppløse 2 g NaHCO3 i 100 ml H2O og justereing til pH på 7,4 med HCl). Alikvot og lagre oppløsningen ved -20 ° C.
- Fordype lysbildene i en Coplin krukke inneholder 1x PBS i 15 min til hydrat seksjonene, hvis det ikke allerede hydrert fra forrige runde.
- Fjern lysbilder og tørke ryggen og kanter med et papirhåndkle.
- Anvende 100 - 500 ul av calcein blå oppløsning pr lysbilde og inkuber i 10 min i et fuktighetskammer ved romtemperatur.
- Skyll lysbildene i 1x PBS i 10 min med 3 endringer.
- Påfør ~ 200 mL av 50% glycerol i 1x PBS til hvert lysbilde og monter dekkglass.
- Fjern overflødig glyserol og tørk bunnen av lysbildene.
- Tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) enzymatisk aktivitet flekker
MERK: TRAP er uttrykt av flere celletyper i blodkreft avstamning inkludert osteoklaster. Fellen flekker presenteres her bruker en gul fluoriserende syre fosfatase substrat. Enkelte fluorescerende signaler vil overlap med tilpassede gul filter sett inkludert tetracyklin / demeclocycline mineralise etiketter, Calcein blåved, og DAPI counterstain.- Senk lysbilder fra forrige bilde runde i en Coplin krukke fylt med 1x PBS før dekkglass falle bort fra skinnene. Ta ut og tørk dekkglass.
- Forbered buffer 1 ved oppløsning av 9,2 g natriumacetat, vannfri og 11,4 g natrium-tartrat dibasisk-dihydrat i vann og å bringe det endelige volum til 1000 ml. Juster pH til 4,2 med konsentrert iseddik (~ 1,5 - 2 ml). Oppbevar løsningen ved 4 ° C i inntil 12 måneder.
- Forbered Buffer 2 ved å oppløse 40 mg av natriumnitritt i vann og å bringe det endelige volum til 1 ml. Oppbevar løsningen ved 4 ° C i opptil en uke.
- På dagen for farging, fremstille reaksjonsbuffer ved å blande 7,5 ml buffer 1 og 150 ul buffer 2.
- Anvende reaksjonsbuffer uten substratet til sleidens i 10 - 15 minutter for å ekvilibrere vevet ved lavere pH.
MERK: Den typiske volum er ~ 200 mL men må være stor nok til å dekke alle seksjoner. - Fortynne den gule fluorescerende sur fosfatase substrat mellom 1:50 og 1: 100 i reaksjonsbufferen.
MERK: fortynning vil bli diktert av TRAP aktivitet i prøven. - Hell reaksjonsbuffer off av lysbildene og gjelder reaksjonen buffer med den gule fluorescerende underlaget til skinnene.
- Plasser glir under UV-svart lys til ~ 5 min for å aktivere substratet.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av TRAP-aktivitet i prøven. - Skyll lysbildene i 1x PBS i 10 min med 3 endringer.
- Påfør ~ 200 mL av 50% glycerol i 1x PBS til hvert lysbilde og monter dekkglass.
- Fjern overflødig glyserol og tørk bunnen av lysbildene.
MERK: Det sure FELLE buffer vil avkalke seksjonene. Den ekstra fordelen av decalcificasjon er at visse farger vil være tilgjengelig igjen for nedstrøms farging (f.eks mineralise etiketter). For eksempel vil den calcein blåfarging bli fjernet i løpet av TRAP-farging. Derfor kan DAPI counterstain avbildes i denne kanal under et etterfølgende runde.
- Alkalisk fosfatase (AP) enzymatisk aktivitet flekker
MERK: Flere celletyper som er involvert med minera inkludert osteoblaster og mineralizing chondrocytes uttrykke AP. Fast Red substratet anvendt i denne protokollen frembringer både et fluoriserende rød og kromogen rødt signal. På grunn av dette, vil det kromogene substrat slukke fluorescente signalene i regionene hvor substratet utfelles. Derfor er det best å gjøre dette flekk etter å avbilde de fluorescente signalene som kan bli undertrykket ved AP substrat.- Senk lysbilder fra forrige bilde runde i en Coplin krukke fylt med 1x PBS før dekkglass falle bort fra skinnene. Remove og tørk dekkglass.
- Fremstille en M Tris ved å oppløse 12,1 g Tris i 100 ml vann. Juster pH til 9,5 med 1 M NaOH.
- Fremstille en M MgCl2 heksahydrat ved å oppløse 20,33 g av MgCl2 i 100 ml deionisert vann.
- Fremstille 2 M NaCl ved oppløsning av 11,68 g NaCl i 100 ml deionisert vann.
- Forbered 100x (20 mg / ml) stamløsning av Fast Red TR salt ved oppløsning av 1 g pulver i 50 ml avionisert vann. Gjør 100 ul porsjoner og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered 100x (10 mg / ml) Naphthol AS-MX-fosfat stamløsningen ved å oppløse 500 mg pulver i 50 ml N, N-dimetylformamid. Gjør 100 ul porsjoner og oppbevares ved -20 ° C.
- På dagen for farging, fremstille AP buffer ved tilsetning av 1 ml av 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl2, 0,5 ml av 2 M NaCl og bringe det endelige volum til 10 ml ved bruk av deionisert vann (sluttkonsentrasjoner: 100 mM Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
- Plasser AP bUffer på hvert lysbilde og inkuberes i et fuktighetskammer i 10 minutter ved RT.
- Forbered AP substrat buffer ved å fortynne 100x bestander av Fast Red TR Salt og Naphthol AS-MX til 1x i AP buffer.
- Hell AP buffer av lysbilder og erstatte med AP substrat buffer. Inkuber objektglass i 5 - 10 min i et fuktighetskammer ved romtemperatur.
MERK: Inkubasjonstid vil bli diktert ved AP aktivitet av prøven. - Vask glir 3 x i 1 x PBS i 5 min hver.
- Montere dekkglassene med DAPI kontra-løsning (1: 1000 fortynning av DAPI i 50% glycerol i 1 x PBS).
- Toluidinblått O (TB) kromogen farging
MERK: Siden alle tidligere trinn er avbildet i henhold til midlertidig vandig montering i 50% glyserol / PBS-løsning, blir den kromogene trinnet også avbildes under vandige betingelser. Imidlertid kan fargeløsning som har en tendens til å lekke ut over tid. Derfor er det foreslått å avbilde toluidinblått så snart som mulig etter farging.- Senk lysbilder fra forrige bilde runde i en Coplin krukke fylt med avionisert vann inntil dekkglass falle bort fra skinnene. Ta ut og tørk dekkglass.
- Etter fjerning av dekkglass, erstatte med ferskvann og inkuber lysbildene i minst 10 minutter, slik at salter fra PBS er tilstrekkelig fjernet fra vevet.
- Fremstille 0,025% TB oppløsning i deionisert vann.
- Plasser lysbildene i TB løsning for 1-5 min.
MERK: Inkubasjonstid er avhengig av brukerens preferanser, men bør holdes konsistente på tvers av alle prøvene. - Plasser glir inn Coplin krukke med avionisert vann og vaske lysbilder 3x i 5 min hver.
- Mount dekkglass med 30% glyserol oppløst i avionisert vann (IKKE 1x PBS da dette vil føre til at flekken å lekke ut fra vevet). MERK: Glycerol monteringsmedium kan være substituert med fruktosesirup, noe som bidrar til å hindre diffusjon av flekken fra vevet. Tilfremstille fruktosesirup, oppløse 30 g fruktose i 10 ml avionisert vann og oppvarm til 60 ° C inntil oppløsning.
6. Flere Helg Imaging
- Last lysbildene i mikroskop brett (Figur 3D).
Merk: Magasinene er fjærbelastet. - Sett brettene i skuffen bunke med slide-skanning mikroskop (figur 3E).
- Klikk på profillisten for å laste inn en profil for hvert bilde med passende eksponeringstider for hver fluorophore. Klikk på bildet navn å nevne hvert lysbilde manuelt eller har programvaren lese strekkoden gitt på lysbildet etiketten. Klikk på forhåndsvisningsskanneknappen start å ta en forhåndsvisning av lysbildet.
- Sett regioner av interesse i vevet deteksjon veiviseren og lagre dem for senere runder av bildebehandling. Når hvert bilde er ferdig, starter skanningen ved å klikke på knappen start skanningen.
Merk: Systemet kan holde opp til 100 SLIdes på en gang. - Når bilde er ferdig, eksportere bildene fra hver enkelt kanal og bilde runde som TIF eller JPG-filer for bilde montering og analyse.
7. Bilde Assembly
- Manuell metode ved hjelp av Photoshop (eller lignende bilderedigeringsprogramvaren stand til å produsere lagdelte bilder).
- Åpne hver enkelt kanal bilde fra hver bildebehandling runde.
- Monter de enkelte bildene som lag i en sammensatt bilde. For å gjøre dette, klikk på lag i lag paletten fra ett bilde. Deretter drar laget på et annet bilde. Dette dra og slipp-operasjon vil skape et nytt lag i bildet. Gjør dette for alle andre bilder. Alternativt kan du bruke et skript (Fil> Skript> Last inn filer til Stack ...) for å automatisere denne prosessen ved å laste flere bildefiler som lag i en bildestakk.
- Når hvert bilde er oppført som et individ lag i det sammensatte bildet, dobbeltklikk på lagnavnet endre navn på laYers som nødvendig for å skjelne de forskjellige kanalene.
- For å se gjennom hvert lag og skape en virkelig sammensatt bilde, endre Blend Mode for hvert lag fra "Normal" til "Screen" i lag paletten.
Merk: For å øke hastigheten på dette trinnet, endre et enkelt lag å screene, høyreklikk på laget, velg "kopier lag stil", deretter markere alle andre lag og velg "lim lag stil" for å bruke skjermen stil til den andre lag. - Dersom det er ønskelig, redusere tettheten (endre verdi i en 10 - 40%) av det kromogene lag (dvs. toluidinblått) for bedre å visualisere de fluorescerende signaler gjennom den kromogene lag.
Merk: flislagt scanning mikroskop brukes i denne protokollen holder skinnene på 3 kanter, og dermed minimere mengden rotasjon som kan oppstå til lysbildet i hver runde med bildebehandling. Derfor er det mye enklere for brukeren å justere bildene manuelt uten å rotere bilder avledetfra forskjellige runder med bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generell Arbeidsflyt for høy gjennomstrømming, Multi-Image Cryohistology
Figur 1 viser den generelle arbeidsflyten som brukes for denne teknikken. Det inkluderer flere trinn fra fiksering gjennom flere runder med bildebehandling og endelig bildejusteringen / analyse. Prosessen kan ta så lite som en uke å gå fra prøve fiksering gjennom 4 runder med bildebehandling, som er kortere tid enn det tar å avkalke disse type prøver. Rekkefølgen på bilde begynner vanligvis med de endogene signaler som allerede er i prøven (f.eks GFPs, mineralise etiketter, etc.), så multiplekset fluorescerende farging, etterfulgt av fluorescerende enzymatisk aktivitetsanalyser (f.eks., Felle, AP, etc.) og cellesyklusanalyse analyser (f.eks edu) og til slutt slo en kromogen flekk (f.eks toluidinblått O, hematoxylin, safranin O, etc.).
Representant Eksempel fra en Juvenile Ankel Joint 6
Hensikten med denne studien var å demonstrere korrelasjonen mellom ekspresjonen av forskjellige typer av kollagen (dvs. Col1a1, Col2a1, og Col10a1) med mineralisering av fibrocartilage av akillessenen-til-ben innføringsstedet (dvs. enthesis). Derfor ble en trippel transgen fluorescerende reporter mus inkludert Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP, og Col10a1-mcherry brukes til å identifisere celler som uttrykker hver transgenet. Den første runden av avbildning var av den endogene transgene ekspresjon fra en to-ukers-gamle mus, som tilsvarer når enthesis mineralizes i akillessenen (figur 4B). Den andre runden med bildebehandling ble deretter gjennomført påmultiphoton mikroskop for å hente bilder av kollagen arkitektur via to foton andre harmoniske generasjon (SHG, figur 4C). Dette trinn ble anvendt for å identifisere celler på bunnen av kollagenfibre innenfor enthesis. Den tredje runden av avbildnings ble en farging skritt for Indian hedgehog (IHH), som er en av hovedsignaleringsligandene som fremmer mineralisering av enthesis (figur 4D). Den fjerde runden av bilde var AP flekker ved hjelp av en blå alkalisk fosfatase substrat kit, som utløser både Cy5 fluorescens og blå kromogene signaler, for å visualisere områder med aktiv mineral nedfall (figur 4E). Til slutt, den femte runden av bilde var TB flekker å visualisere de anatomiske trekk inkludert proteoglykan innholdet i fibrocartilage (Figur 4F). Alle bildene ble manuelt justert i bilderedigeringsprogrammet. De fem runder med bildebehandling ble gjennomført over en fire-dagers periode, som fulgte 3dager med prøve behandling og snitte (7 dager totalt).
Representant Eksempel fra en voksen Kneleddet 11
Hensikten med dette forsøket var å bestemme mineralise endringene som skjer i enthesis av mediale leddbånd (MCL) av kneet følgende felles destabilisering via tran av fremre korsbånd (ACL). Mineralise endringer kan sees i MCL enthesis så tidlig som to uker etter operasjonen i disse tre måneder gamle mus. For å overvåke mineral apposition fibrocartilage i enthesis, ble en mineral etikett gitt til musene på dagen for kirurgi (demeclocycline) og dagen før avlivning (calcein) ved 2 uker etter operasjonen. Musene også inkludert Col1a1-CFP og Col10a1-mcherry fluorescerende reportere å overvåke kollagen uttrykk for mineralisert og mineralisert fibrochondrocytes, henholdsvis. Den første runden av avbildning var av de endogene signaler, som i dette tilfellet samsvarer med fluorescerende proteiner og fluorescerende mineraliseringsmerker (figur 5A). Den andre runden inkludert TRAP-farging for å påvise ekspresjon av dette enzym i mineralise fibrochondrocytes i enthesis samt osteoklaster i den underliggende benmarg (figur 5B). Den tredje runden var AP flekker å demonstrere regioner med aktiv mineralisering av fibrochondrocytes samt osteoblasts av den underliggende bein (figur 5C). Til slutt ble TB farging utført i den fjerde runden (figur 5D). Alle bildene ble manuelt justert i bilderedigeringsprogrammet. Nok en gang den totale tiden det tar fra vev avling til bildejusteringen var 7 dager.
Representant Eksempel på trabekulært ben fra Distal Femur
(figur 3B). Denne prosessen ble gjennomført på åtte hunn og 8 hannmus på 3 forskjellige nivåer i benmargen, hvilket ga et totalt antall på 12 objektglass. Referanse markører (mikrosfærer) ble påført innenfor epifysen og midt diaphysis på de tørre delene (figur 3C). Alle 12 lysbilder var farget for Calcein blå og avbildes for akkumulert mineral (calcein blå) og mineralise etiketter (calcein og alizarin komplekson) i løpet av den første runden av imaging (Figur 6A). Glassene ble deretter fotografert for TRAP-aktivitet (figur 6B) i den andre runden og AP-aktivitet (figur 6C) i tredje runde av bildebehandling. Til slutt ble platene farget med toluidinblått i den fjerde runden (figur 6D). Referanse markører ble fotografert under hvert bilde rundt, inkludert den kromogen runde, og ble justert ved hjelp av tilpasset programvare. For å gi et inntrykk av gjennomstrømning for denne prosedyren, 32 bein (16 lårben og 16 ryggvirvler) ble innebygd i 8 blokker, 3 seksjoner ble tatt fra hver blokk, ble seksjonene fordelt på 12 sider, og de 12 slides ble fotografert 4 ganger produsere 96 sammensatt bilde stabler. Den totale tid for å utføre dette forsøket var 8 dager.
Figur 1. Typisk Arbeidsflyt for protokollen. Generelle trinn inkluderer 1) vev fiksering, 2) tape-stabilisert cryosectioning, 3) etterlevelse av tapede seksjoner til glassplater, 4) bruk av referanse markører, 5) flere runder med flekker og 6) bildebehandling, og 7) image montering, justering og analyse. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Høy-throughput Inkludering og båndstabilisert Cryosectioning. På grunn av stabiliteten til cryotape tilveiebringer, kan flere ben bygges ved siden av hverandre (AB) og i snitt samtidig (CD). Et stykke tørris brukes underembedding prosessen til fast løse bein på plass før frysing hele cryo-blokken (B). Den cryotape er rullet på blokken (C) og delen som kleber seg til båndet under snitting (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Overholdelse av tapede §§ til glassplater, Påføring av Reference Markers, og lasting av lysbilder i magasin av Slide-scanning mikroskop. Teipede delene er limt til overflaten av glassplater med enten UV-herding eller kitosan-basert lim (A ). Etter herding eller tørking, bare et tynt, flatt lag av klebemiddel holder seg mellom den cryotape og glassflaten (B). Referanse markers brukes på tørre lysbilder (C, Pilen peker for å slippe av mikrosfære løsning). Slides er så montert i mikroskop skuffer (D) og lastet inn i mikroskop (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. fem runder med Imaging av akillessenen fra en to-ukers gamle mus. Den sammensatte bildestakk (A) ble opprettet fra fem runder med bildebehandling. Runde 1 (B): endogen Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP, og Col10a1-mcherry transgene uttrykk. Runde 2 (C): kollagen andre harmonisk generering (SHG) på de to foton mikroskop. Runde 3 (D): farging for IHH. runde 4(E): AP enzymatisk aktivitet. Runde 5: toluidinblått O (F). Dette tallet har blitt forandret fra Dyment et al., 2015 6. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. fire runder Imaging av MCL Enthesis følgende felles destabilisering. Knees ble destabilisert i tre måneder gamle mus, som fører til økt mineralisering av MCL enthesis. En demeclocycline mineral etikett ble gitt operasjonsdagen og en calcein mineral etikett ble gitt dagen før offer. Runde 1 (A): endogen Col1a1-CFP, Col10a1-mcherry transgene uttrykk med demeclocycline og Calcein mineral etiketter. Runde 2 (B) </ Strong>: TRAP enzymatisk aktivitet. Runde 3 (C): AP enzymatisk aktivitet. Runde 4 (D): toluidinblått O. fellen og AP signalet ble kledde på toppen av TB signal i paneler BC. Den gule kanalen kan brukes igjen for TRAP fordi FELLE buffer decalcifies vev, fjerne demeclocycline etiketten. Dette tallet har blitt forandret fra Dyment et al., 2015 11. Scale bar = 200 mikrometer. Dem: demeclocycline, TRAP: tartrate bestandig syre fosfatase, AP: alkalisk fosfatase, MCL: mediale leddbånd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. fire runder Imaging innenfor Distal Femur Inneholder Mikroreferanse Markers. Tre måneder gamle mice fikk Calcein og alizarin komplekson mineral etiketter Runde 1 (AA '). endogene Calcein og alizarain komplekson etiketter i tillegg til Calcein blåfarging av akkumulert mineral Runde 2 (BB.): TRAP enzymatisk aktivitet Runde 3 (CC). .: AP enzymatisk aktivitet round 4 (DD '): toluidinblått O. de grønne sfærer ble fotografert i hver runde (A'-D', pilen betegner den samme mikrosfære i alle bilder). Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| chitosan lim | UV-herdende lim | |
| selvklebende mekanisme | fordampning | UVpolymerisering |
| Herdetid | > 24 timer | <20 min |
| Kan seksjonene bli fjernet etter at limet herder? | Ja | Nei |
| Er herdet lim oppløselig? | Ja, i sure løsninger med lav pH | Nei |
| Har limet tåle varme antigen gjenfinning? | Nei | Ja |
| Er limet auto-fluorescerende? | Nei | Minimal i UV-området |
Tabell 1. Sammenligning mellom Chitosan lim og UV-herdende lim
| Cryotape | Tape-Transfer System | |
| Mulig § mineralisert bein ved hjelp av dette systemet? | Ja | Ja, men biter av mineralisert beinkan ikke overføre helt til raset |
| Mulig å seksjons mineralisert leddene ved hjelp av dette systemet? | Ja | Ja |
| Mulig § hjernen ved hjelp av dette systemet? | Ja, men vev kan falle ut av tape etter flere runder med bildebehandling | Ja |
| Mulig å kutte flere prøver innebygd i samme blokk? | Ja | Ja |
| Mulig å gjennomføre flere runder med bildebehandling på samme delen? | Ja | Ja |
Tabell 2. Sammenligning mellom Cryotape System og Tape-overføring System
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi presentert en detaljert cryohistology protokoll til co-lokalisere og kvantifisere flere biologiske tiltak ved å samkjøre bilder fra flere runder med farging / bildebehandling på en enkelt seksjon. Fremgangsmåten som er beskrevet ved hjelp av cryotape er spesielt nyttig som det opprettholder morfologi vanskelig å seksjon vev (f.eks mineralisert ben og brusk). I tillegg er seksjonert vev klebet fast til glass-slide, slik at for multiple runder med farging / avbildning av den samme delen; i motsetning til tradisjonelle metoder hvor seriesnitt hver er farget med en annen protokoll. Ved hjelp av seriesnitt kan utgjøre et problem ved forsøk på å co-lokalisere signalene mellom seksjonene, noe som ikke er et problem med enkle deler som har blitt farget og fotografert med flere runder.
Den første tape-stabilisert vev seksjonering produkt på markedet var en tape overføringssystem 16, 17. Den bruker plast tape belagtmed en kald temperatur klebemiddel som er plassert på overflaten av vevet cryoblock. Når kryostat bladet skjærer under båndet, blir delen fjernet intakte og vedheftende til båndet. Deretter ble båndet anbringes prøvesiden ned på objektglass som er belagt med UV-herdende lim slik at vevet blir stivt festet til sleiden. Når tapen er pealed bort fra avsnittet, kan lysbildet bli behandlet for enten fluorescens eller kromogen histologi. Bakgrunnsfluorescens av de klebemidler er lav, og flere runder med farging og avbildning fungerer godt sammen med de fleste myke vev. Men med mineralisert seksjoner, kan det være tap av mineral fragmenter ved overføring av vev fra teip til glassplater. I tillegg er det et forholdsvis kostbart system for å installere i kryostaten (> $ 8000) og forbruksprisen blir høy (> $ 2 / lysbilde).
En annen tape stabilisering strategi utviklet av Dr. Tadafumi Kawamoto bruker enklebemiddelbelagte polyvinylidenkloridfilm å fange vev delen. I deres protokollen, er en frisk frosset vev seksjoneres opp på bånd og umiddelbart fast i PFA eller etanol 18. Deretter blir båndet farget og deretter montert på et objektglass med prøvesiden ned for mikroskopisk undersøkelse. Således hvert farging protokoll er utført på en annen tapet seksjon.
Vi har endret og tilsatt til Kawamoto protokollen i en rekke måter, inkludert fiksering av prøven i formalin før innebygging. Dette trinnet er kritisk for å feste den løselige cytoplasmiske GFP av transgene dyr innenfor rammene av cellen. Vi har benyttet cryotape for et bredt spekter av vevstyper 5-13. Laboratoriepersonell med begrenset histologisk erfaring kan produsere høykvalitets seksjoner med denne metoden. De viktigste fordelene med denne protokollen er den relative lave kostnader (ingen spesielle instrumenter, <$ 1,00 per lysbilde), uten tap av mineral fragmenter,og evnen til å utføre flere runder med flekker og avbildning på den samme delen.
Fordi bildebehandling de samme regionene i et lysbilde flere ganger i repetisjon vil være urimelig for et stort antall lysbilder selv ved hjelp av en motorisert stadium, en annen kritisk trinn i denne protokollen er utnyttelse av en slide-scanning mikroskop for å øke konsistens og gjennomstrømming. Mikroskopet er et digitalt lysbilde skanner som opererer under både epifluorescens og overført lys. Den er utstyrt med en 10-stilling motorisert turret og både B & W og fargekameraer. Den sanne nyheten av systemet, i våre hender, er at bestemte områder av interesse kan raskt og enkelt definert av brukeren eller oppdages automatisk av bildebehandlingsprogrammer. Disse områdene av interesse kan da bli frelst fra den første runden av bildebehandling og deretter lastes raskt i løpet av de påfølgende rundene. Derfor er de samme områder av interesse avbildes i hver runde av bildebehandling. Basert på bruker-definerte parametere i programvaren, vil mikroskop autofokus og skanne flislagt bilder som er sydd under oppkjøpet innenfor regionene av interesse.
Rekkefølgen av hvor brukeren utfører flere runder med farging er viktig. Den generelle rekkefølge er skissert i figur 1. Antallet fluoroforer som i tilstrekkelig grad kan separeres via fluorescens mikroskopi er den viktigste begrensende faktor for antall respons tiltak som kan erverves ved en gitt seksjon. Imidlertid kan fluorescerende kanaler gjenbrukes i visse tilfeller. For eksempel, Calcein blå og demeclocycline begge avgir et sterkt signal i den gule kanal brukes for å måle TRAP-aktivitet. Dette blø gjennom unngås om fordi FELLE buffer decalcifies seksjonen, og dermed fjerne mineral før bildebehandling FELLE aktivitet. I tillegg vil DAPI counterstain avgi i det gule kanal i tillegg. Imidlertid kan brukeren erstatte DAPI med en annen counterstain i the rød eller langt-røde området. I tillegg kan antistoffer bli strippet og re-farget med forskjellige antistoffer ved hjelp av de samme fluorescerende kanaler. Derfor er denne metoden ganske tilpasningsdyktig til å øke antall respons tiltak som kan tas opp på en gitt seksjon.
Det er visse begrensninger med presenteres protokollen. 1) Den cryotape kan ikke holder seg i tilstrekkelig grad til visse vev. For eksempel formalinfiksert hjerne seksjoner tendens til å falle av båndet etter flere runder med farging. For vev slik som dette, kan båndet overføringssystemet være mer passende som vevet er klebet til glassoverflaten via UV-aktiverte klebemiddel (se tabell 2 for sammenligning mellom disse to metodene). 2) Den kitosan lim, samtidig som det gir gjennomsiktig optiske egenskaper, vil ikke overleve tøffe behandlingstrinn som omfatter høye temperaturer eller sterke syrer. Derfor er den UV-aktiverte klebemiddel er bedre egnet for disse anvendelser (se tabell 1 feller sammenligning mellom disse to klebemidler).
De cryohistological protokollene som presenteres her også egner seg til høyere gjennomstrømning og automatisering. For eksempel kan båndet stabilisering levert av cryotape gjør det mulig for relativt uerfarne brukere til å skjære flere bein eller ledd på en gang i den samme blokk, i betydelig grad øke gjennomstrømningen. Ved hjelp av en automatisert skanner reduserer tekniker tid og kostnader knyttet til bildebehandling, som typisk har vært den hastighetsbegrensende trinn i vår erfaring betraktelig. Å være i stand til konsekvent og pålitelig bilde i samme region av interesse flere ganger i løpet av kort tid gir en plattform for automatisert, objektiv analyse av vev. Faktisk har vår gruppe utviklet en plattform for PC-automatisert justering og histomorfometri av bein. Først justerer programvaren flere runder med bilder basert på fluorescerende referansemarkører. Deretter blir de fluktende bildene matet inn i en rørledning histomorfometri hvor automatiser programvaren definerer regionen av interesse og objektivt måler flere statiske og dynamiske målinger (se mer på www.bonebase.org) 13. Denne plattformen ble gjort mulig på grunn av økt gjennomstrømning og konsistens levert av cryotape seksjonering, digital slide-scanning mikroskop, og tilpasset analyse programvare. Denne protokollen representerer et betydelig fremskritt i høy gjennomstrømning cryohistology og bør være til nytte for dem som bilde vanskelig å seksjons vev slik som ben, så vel som de som er uerfarne med vev snitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
