Introduction
Biyolojik araştırmalar genellikle sık histolojik analiz 1-3 çeşit ile ilişkili verimli fenotiplendirilmesini gerektirir. Bu ihtiyaç, fare genomuna 4 her genin bozmaya daha da belirgin iddialı projelerle olduğunu. Bu histolojik analizler tek tek hücrelere spesifik genlerin veya proteinlerin eşleme ifadesi hücre morfolojisi ve / veya anatomik özellikleri değerlendirmek arasında olabilir. Aslında, genomik alana histoloji temel katkılardan biri, belirli bir bölge ya da hücre tipine özel bir moleküler sinyali ilişkilendirmek yeteneğidir.
Özellikle kas-iskelet dokular için histoloji geleneksel yöntemler, genellikle zaman alıcı ve zahmetli, bazen düzeltmek için hafta gerektiren vardır, decalcify, bölüm, leke ve görüntü numune daha sonra insan yorumuna aracılığıyla görüntüleri analiz. In situ hybridizat edip, immünohistokimya ile, çoklu moleküler sinyallerin incelenmesiiyon ya da özel lekeleri, uygun gerçekleştirmek için birden çok bölüm ve hatta birden fazla örnekleri gerektirir. Ayrıca, bu çoklu tepkiler verilen bir örnekten içinde belirli bir bölgeye eş lokalize edilemez bazen aynı hücreye birlikte lokalize ve olamaz. genomik ve epigenomics alan dijital çağa hareket ettikçe, histolojik alanı da verimli, yüksek verim ve tek histolojik bölüm içinde moleküler sinyallerin çeşitli otomatik analizini sağlamak için davayı takip gerekir.
Gerçekten de, belirli bir numune içindeki belirli hücrelere birden fazla moleküler sinyalleri ilişkilendirmek geliştirilmiş histolojik teknikler için bir talep vardır. Son zamanlarda, mineralize dokusundan 5-14, belirli bir bölüm içinde birkaç yanıt tedbirleri değerlendirmek için yeni bir yüksek verimli cryohistological yöntemi yayınlamıştır. işlem, bir mikroskop lamı katı bantlanmış bölümüne yapışan, dondurulmuş cryotape ile cryosection stabilize içerir veHer bölümünde boyama ve görüntüleme birkaç tur yürütülmesi. Görüntülerin bu tur daha sonra elle veya görüntü analiziyle önce bilgisayar otomasyon (Şekil 1) ile hizalanır. Burada, bu sürecin ayrıntılı protokolleri sunmak ve bu tekniklerin değişik biyolojik süreçlerin anlayışımızı geliştirdik örnekler sunmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Connecticut Sağlık Merkezi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi Üniversitesi, tüm hayvan prosedürleri onayladı.
1. Sabitleme ve katıştırma
- CO 2 boğulma veya onaylanmış diğer yöntemlerle hayvan Euthanize.
- Düzgün bir şekilde monte kadar 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin ilgi doku (örneğin, bacak, omurga, vb) ve yer Hasat. önce fiksasyon tutarlı anatomik yerleşimi korumak için özel dikkat gösterin. Örneğin, tutarlı fleksiyon, iç rotasyonda eklemler ile bacaklarda düzeltmek ve dış rotasyon 11 açıları. 3 gün - Tipik olarak, 1 bütün fare uzuvların düzeltmek.
Dikkat: Formalin toksik ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek bir davlumbaz ele alınmalıdır.
Not: tespitin zaman dilimi numune büyüklüğüne bağlıdır. Deney izin veriyorsa, kemik açık kesme iliği bölmesinin tespit artıracaktır.Bazı örnekler (kemik iliği içinde, örneğin, soluk floresan sinyalleri) floresan arka plan en aza indirmek için perfüzyon fiksasyon 15 gerektirebilir. - 4 ° C'de 24 saat - Transfer 1x PBS içinde yapılan 12 boyunca inkübe,% 30 sakaroza formalin gelen örnekleri.
Not: Bir kere 12 inkübe - 24 saat, daha sonra numuneler, uzun süreli depolama için -80 ° C 'de yerleştirilebilir. Depolama Bu yöntem, araştırmacılar aynı blokta çok sayıda örnek gömmek niyetinde ama aynı zamanda, bu örneklerin her hasat olabilecek olan deneyler için tavsiye edilir (örneğin, çoklu zaman noktalarında olan deneyler). - sukroz gelen örnekleri çıkarın ve herhangi bir aşırı doku uzak teşrih.
- Bir cryomold doldurun cryo gömme orta ile yol parçası (kalıbın büyüklüğü numune boyutuna bağlıdır). ilgi bölgesi uçağı kesme kalıp zemine paralel olduğu şekilde kalıp içinde örnek yerleştirin.
Not: Belirli doku yerleştirme ve oryantasyon bir örnekŞekil 2A bulunabilir - B. - kriyo gömme ortamı donar ince bir tabaka kadar bir kuru buz parçası üzerine cryomold yerleştirin ve daha sonra yerine numune giderir. Kuru buz pelet üzerine cryomold korurken cryo gömme orta ile cryomold kalan hacmi doldurun.
- 2-metil-butan kuru buz ile önceden soğutulmuş ihtiva eden bir kap içinde cryomold yerleştirin. Numuneler tamamen donmuş sonra, cryomolds kaldırmak ve fazla 2-metil-bütan silkeleyin. -20 ° C olarak selofan ve yerine cryomolds Wrap veya -80 depolama ° C sıcaklıkta dondurucuya.
Not: Özellikle -20 ° C sıcaklıkta, kriyo gömme ortamı içinde depolandığında numuneler, zaman içinde kuruyabilir. (Adım 1.3) -80 ° C ya da -80 ° C'de% 30 sukroz içinde gömme orta kriyo 2 ay - daha uzun süreli 1 numunelerinin muhafaza önerilir.
2. Bant stabilize Doku Kesit
- dondurucudan örnek blokları kaldırmak ve cryosta yerleştirmek-20 Ve -25 ° arasında bulunan sıcaklık T.
- cryomold blok çıkarın ve bir jilet ile gömme orta aşırı kriyo uzak trim.
- numune diske bazı cryo gömme ortamı yerleştirin ve sonra numune disk yüzeyi ve böylece ilgi bölge için uygun kesme düzlemini kuran bloğun alt yüzeyine paralel olacak şekilde blok hizalayın.
- kriyostat Numune disk yerleştirin ve dondurmak için gömme orta cryo için izin verir.
- numune kafasına üzerine numune disk yerleştirin ve bıçak keser numune bloğunun yüzeyine paralel şekilde kafasını ayarlayın.
- ilgi bölge içinde bir seviyeye blok aşağı trim ve blok yüzeyinden herhangi bir talaşı savmak.
- kriyostat ilgi ve pre-soğuk bölgesini kaplayacak kadar büyük cryotape bir parça kesin.
Not: Birden adet cryost içinde tutarlı boyutlarda kesilmiş ve saklanabilirKesit sırasında. - sonra aşağı blok yapışkan tarafı üzerine bant yerleştirmek forseps kullanılarak yapışkan olmayan gümüş / altın tırnaklarından bandı tutarak cryotape gelen yapışmayan desteğini çıkarın.
- Makarayı (Şekil 2C) kullanarak cryotape basınç uygulayın.
- Otomatik motor veya kriyostat elle kesme tekerleği kullanarak - (8 mikron 5) bir bölüm yapın.
Not: O bölüm (Şekil 2D) kesit sırasında sahneden düşmez şekilde sahneye geldiği gibi cryotape kenarına tutmak için iyi bir uygulamadır. - Kriyostat içinde plastik bir mikroskop lamı üzerine bölüm doku tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
- kriyostat plastik slayt çıkarın ve kriyo gömme ortamı bölümü sürgünün yüzeyine yapışan şekilde eritmek için izin verir.
- seri bölümleri veya ilgili diğer bölgeler için kesit tekrarlayın.
- bitmiş kez, bir slayt kutusu a bölümleri saklamakt 4, -20 veya -80 ° C gerekli depolama uzunluğu ve alt tepki önlemleri bağlı. 4 ° C'de depolandığında bir ay içinde - örneğin, enzimatik aktivite için lekeli olacak slaytlar kullanın (5.3 5.2).
Mikroskop Slaytlar Bölüm 3. yapışması
- UV vulkanize edilebilir bir yapışkan yöntemi.
- mikroskop lamı etiketleyin.
Not: artan otomasyon, örnekler ve slaytlar barkod ile etiketlenmiş olabilir için. - İki cam slaytlar UV aktif optik yapıştırıcı bir damla uygulanır ve cam slaytlar yüzeyi boyunca daha ince bir yapışkan tabakası yayıldı için plastik bir slayt kenar kullanımı.
- gümüş / altın sekmesini kesti ve ilk slayt yapıştırıcı bantlanmış bölüm doku tarafı yukarı yatıyordu. bant altında tutulmuş kabarcık oluşumunu en aza indirmek için diğer bir kenarından bir yuvarlanma hareketi bölümü uygulanır.
Not: ilk kayar t önceden ıslatılması alt için kullanılırönce ikinci (kalıcı) slayt (adım 3.1.4) üzerine yerleştirerek o kaset. - İlk slayt bantlanmış kısmını çıkarın ve ikinci slayt (Şekil 3A) yapışkan tabaka üzerine yerleştirin. Yine, kabarcıkların sıkışmasını önlemek için özen gösterin.
Not: Bu adım usta pratik gerektirir. - Verilen deney için bölümlerin uygun sayıda, her slaytta yerleştirildikten sonra, çevresinde aşırı yapışkan siliniz.
- bant altında kabarcıkların veya liflerin yakından her bölüm kontrol edin. Bir mikroskop ya da büyüteç altında inceleme yapın. engel varsa, bireysel bölümünü kaldırmak engelleri kaldırın ve sonra cam slayt yeniden uygulayın.
- yapışkan çapraz bağlanması için 10 dakika - bantlanmış bölümleri altında herhangi bir engel olmadığı belirlendikten sonra, 5 UV siyah ışık altında mikroskop slaytlar yerleştirin.
- mikroskop lamı etiketleyin.
- Kitosan yapıştırma yöntemi.
- th hazırlayıne% 1 kitosan yapışkan. 100 ml Dİ su içinde konsantre asetik asit, 0.25 ml eritilmesi asetik asit solüsyonu hazırlamak (% 0.25 hac / hac). asetik asit çözeltisi, 100 ml çitosan tozu, 1 g çözülür ve çözelti O karışmaya / N ya da kitosan tozu eriyene kadar.
NOT: Çözelti oda sıcaklığında stabildir. - slayt üzerine yerleştirilmiş olan her bir bölüm için çitosan solüsyonu damla bırakın.
- Bant gümüş / altın sekmesini kes ve yapıştırıcı (Şekil 3A) üzerine kadar her bantlanmış bölüm doku tarafını yerleştirin. kabarcıkların sıkışmasını önlemek için büyük özen kullanın.
- Bir kez tüm bölümleri slayt yerleştirilir, uzun kenarlarından birinde slayt yukarı eğin ve forseps kullanılarak alt kenarına aşırı kitosan sürükleyin.
- Bir slayt kutusunda bir kağıt havlu üstüne bu yönde slaytlar yerleştirin. Yerçekimi sonra kitosan düz ve düzgün bir tabaka verimli, aşırı kitosan havlu üzerine aşağı düşmesine yol açacaktır.
- Plabuzdolabı O açık sütyen, kapağı slayt kutusu ce / N kitosan kuruması için.
NOT: İki yapışkan yöntemler arasında bir karşılaştırma için Tablo 1'e bakınız.
- th hazırlayıne% 1 kitosan yapışkan. 100 ml Dİ su içinde konsantre asetik asit, 0.25 ml eritilmesi asetik asit solüsyonu hazırlamak (% 0.25 hac / hac). asetik asit çözeltisi, 100 ml çitosan tozu, 1 g çözülür ve çözelti O karışmaya / N ya da kitosan tozu eriyene kadar.
Slaytlar Referans belirteçlerinin 4. Uygulama
- Yeşil 50 ul su ve 100 ul Kırmızı mikrosferler 50 ul çözülmesiyle bir referans işareti çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de karanlıkta çözelti saklayın.
- Microsphere solüsyon içine 10 ul veya 20 ul pipet ucu yerleştirin. Ilgi bölgesi (Şekil 3C) bitişik her bölüm için mikro küre çözeltisi küçük bir damla ekleyin. ilgi bölge içinde mikro kürecikler alamadım için dikkatli olun.
- O gün slaytlar işleme durumunda, 30 dakika boyunca (ışıktan korunmuş olarak) oda sıcaklığında slaytlar kurutun. Değilse, 4 ° C de bir slayt kutusuna slaytlar yerleştirin.
Not: Microsphere çözüm slaytları sulandırılması önce kurur Sürece, microspheres boyama / görüntüleme birden turda slaytlar yapıştırılır kalacaktır.
Boyama 5. Çoklu turlar
NOT: görüntüleme, boyama ve Yeniden görüntüleme başlıyor adımları uyumlu dizisi seçerek, tespit ve aynı doku bölümünde pek çok biyolojik sinyaller ko-lokalize etmek mümkündür. görüntüleme / boyama / Yeniden görüntüleme başlıyor Her yuvarlak, özellikle histolojik soru için geliştirilmelidir. Görüntüleme / boyama / Yeniden görüntüleme başlıyor dizisi, tipik olarak, floresan çoklamalı immün ve enzimatik aktivite lekelerin çok turlu ardından görüntüleme ilk turunda endojen floresan sinyalleri (örneğin, hücresel, GFP, mineralizasyon boyalar, in vivo görüntüleme sondaları) elde içerir. Son olarak, bölüm mimari dokusu vurgulamak için kromojenik boyalar (O safranin örneğin, H & E, mavi toluidin, vb) kullanılarak boyandı. uyarlanan bu bölümde bulunmaktadır sunulan özel yöntemleriticari olarak temin edilebilir protokolleri.
- Birikmiş mineral için Calcein mavi boyama
NOT: Calcein mavi boyama karanlık alan ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme aksine otomatik görüntü analizi için uygun olan tutarlı bir mineral yüzeyini verir. Kalsein mavi boyama ile sorun örneği bu mineral etiketleri, görüntü kalsein mavi ile boyanmadan önce görüntüleme ilk turda etiketler içeriyorsa floresan spektrum nedenle. Tetrasiklin ve demeklosiklin etiketleme ile örtüşür olmasıdır.- doku içinde endojen sinyalleri bu boyama aşamasından önce görüntülü Eğer kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar, 1xPBS dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları daldırın. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
- NaHCO 3% 2 kalsein mavi çözelti 30 mg / ml hazırlama (100 mi, H 2 g NaHCO 3 çözülmesiyle yapılan 2 O ve ayarlamak) HCI ile 7.4 pH'a ing. Kısım ve -20 ° C'da, çözelti saklayın.
- Zaten önceki turdan hidrate değilse, bölümleri hidrat için 15 dakika boyunca 1x PBS içeren bir coplin kavanoza slaytlar daldırın.
- slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile arka ve kenarları kurur.
- Slayt başına kalsein mavi çözeltisi 500 ul ve oda sıcaklığında bir nem odası içinde 10 dakika süreyle inkübe - 100 uygulanır.
- 3 değişikliklerle, 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde slaytlar durulayın.
- Her bir slayt için 1x PBS içinde% 50 gliserol ~ 200 ul uygulayın ve kapak kayma monte edin.
- Fazla gliserol çıkarın ve slaytlar alt kurutun.
- Tartarat-dirençli asit fosfat (TRAP) enzimatik aktivitesi boyama
Not: TRAP osteoklastlar dahil olmak üzere hematopoetik soy çok hücre tipinde ifade edilmektedir. Burada yer alan TRAP boyama sarı floresan asit fosfataz substratı kullanılır. Bazı flüoresan sinyalleri ov olacaktetrasiklin / demeklosiklin mineralizasyon etiketleri, mavi leke Calcein ve DAPI counterstain dahil olmak üzere özel sarı filtre seti ile erlap.- kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar 1x PBS ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
- sodyum asetat susuz 9.2 g, su içinde sodyum tartrat dibazik dihidrat 11.4 g çözülmesi ve 1.000 ml nihai hacim getirerek Tamponu 1 hazırlayın. Konsantre buzlu asetik asit (- 2 mi ~ 1.5) ile 4.2 pH ayarlayın. 4 ° C'de çözüm Mağaza 12 aya kadar için ° C.
- su içinde sodyum nitrit, 40 mg eritilmesi ve 1 ml nihai hacim getirerek Tamponu 2 hazırlayın. 1 hafta kadar 4 ° C'da, çözelti saklayın.
- boyama gününde, tampon 1 7.5 ml ve tamponun 2 150 ul karıştırılarak reaksiyon tamponu hazırlayın.
- slayt substrat olmadan reaksiyon tamponu uygulamak10 s - 15 dakika daha düşük pH değerlerinde doku dengelenmesi.
NOT: Tipik hacim ~ 200 ul ama tüm bölümleri kapsayacak kadar geniş olması gerekir. - 100 reaksiyon tamponu: 1:50 ve 1 arasında sarı floresan asit fosfataz substratı sulandırmak.
Not: seyreltme örnek içinde TRAP aktivitesi ile belirlenecektir. - slaytlar kapalı reaksiyon tamponu dökün ve slaytlar sarı floresan substrat ile reaksiyon tamponu uygulanır.
- substrat etkinleştirmek için UV siyah ışık altında 5 ~ için min slaytlar yerleştirin.
Not: İnkübasyon süresi örnek içinde TRAP aktivitesi ile ilgili olarak değişebilir. - 3 değişikliklerle, 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde slaytlar durulayın.
- Her bir slayt için 1x PBS içinde% 50 gliserol ~ 200 ul uygulayın ve kapak kayma monte edin.
- Fazla gliserol çıkarın ve slaytlar alt kurutun.
NOT: Asidik TRAP tampon bölümleri kirecini olacaktır. decalcifica yararıyon bazı renkler aşağı boyama (örneğin, mineralizasyon etiketleri) için yeniden kullanılabilir olmasıdır. Örneğin, Calcein mavi boyama TRAP boyama esnasında silinecektir. Bu nedenle, DAPI counterstain bir sonraki turda bu kanalda görüntülü olabilir.
- Alkalin fosfataz (AP) enzimatik aktivitesi boyama
NOT: mineralizasyon osteoblast dahil ve demineralize kondrositler AP ifade ile ilgili birden çok hücre tipleri. Bu protokolde kullanılan Hızlı Kırmızı substrat hem floresan kırmızı ve kromojenik kırmızı sinyal ortaya çıkarır. Bu nedenle, alt-tabaka alt-tabaka kromojenik çökelir bölgelerde floresan sinyalleri gidermek olacak. Bu nedenle, AP substrat tarafından söndürüldü edilebilir floresan sinyalleri görüntüleme sonra bu lekeyi yapmak en iyisidir.- kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar 1x PBS ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. RemoA.Ş. ve kapak fişleri kurutun.
- 100 ml su Tris 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris hazırlayın. 1 M NaOH ile 9.5'e pH ayarlayın.
- Iyonu giderilmiş su, 100 ml MgCl2 20.33 g çözülmesiyle 1 M MgCI2 heksahidrat hazırlayın.
- iyonu giderilmiş su, 100 ml 11.68 g NaCl çözülmesiyle 2 M NaCl hazırlayın.
- iyonu giderilmiş 50 ml su içinde 1 g toz çözülmesiyle Fast Red TR Tuz 100x hazırlanması (20 mg / ml) stok çözeltisi. -20 ° C'de 100 ul alikotları ve mağaza sağlayın.
- N, N-dimetilformamid içinde 50 ml 500 mg tozunun çözülmesiyle 100x (10 mg / ml) Naftol AS-MX fosfat stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 100 ul alikotları ve mağaza sağlayın.
- 100 mm: boyama gününde, 2 M NaCl MgCl2, 0.5 ml 1 M Tris, 1 ml, 1 M, 0.5 mi ekleyerek AP tamponu hazırlamak ve (deiyonize su ile 10 ml nihai konsantrasyonlar son hacim getirmek Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI).
- AP b yerleştirinHer bir slayt Uffer ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle bir nem odasında inkübe edilir.
- AP tamponunda 1x Fast Red TR Tuz ve Naphthol AS-MX 100x stokları seyreltilmesi ile AP substrat tamponu hazırlayın.
- slaytlar kapalı AP tampon dökün ve AP substrat tamponu ile değiştirin. Oda sıcaklığında bir nem odası içinde 10 dakika - 5 için slaytlar inkübe edin.
Not: Kuluçka süresi örnek AP aktivitesi tarafından dikte edilir. - Yıkama 5 dakika her biri için 1x PBS 3x slaytlar.
- (: 1x PBS içinde% 50 gliserol DAPI 1000 seyreltme 1) Dağı kapak DAPI counterstaining çözümü ile sığar.
- Toluidin mavisi O (TB) kromojenik boyama
NOT: Önceki tüm adımları% 50 gliserol / PBS çözüm geçici sulu montaj altında görüntülenmiş Çünkü, kromojenik adım, aynı zamanda sulu koşullar altında görüntülü. Ancak, boyama çözüm zamanla dışarı sızma eğiliminde olabilir. Bu nedenle, mümkün olan en kısa şekilde boyama sonrası görüntü toluidin mavisi önerilmektedir.- Kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar deiyonize su ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
- Kapak fişleri çıkardıktan sonra, tatlı su ile değiştirin ve PBS tuzlar yeterince dokudan uzaklaştırılır, böylece en az 10 dakika süreyle slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
- deiyonize su içinde% 0.025 TB çözeltisi hazırlayın.
- 5 dakika - 1 TB çözeltisi slaytlar yerleştirin.
NOT: İnkübasyon süresi kullanıcı tercihine bağlıdır ancak tüm örneklerin tutarlı tutulmalıdır. - deiyonize su ve yıkama kaydıraklı coplin kavanozun içine yerleştirin slaytlar 5 dakika her biri için 3x.
- Deiyonize su içinde çözülmüş% 30 gliserol Mount kapak kayma (bu leke dokusundan süzülmeye neden olacağından PBS 1x DEĞİL). Not: Gliserol montaj orta dokusundan leke difüzyonunu engeller fruktoz şurubu, ile sübstitüe edilmiş olabilir. için, Fruktoz şurubu hazırlanması çözülene kadar 60 ° C'de deiyonize su ve ısı 10 ml fruktoz 30 g çözülür.
Görüntüleme 6. Çoklu turlar
- Mikroskop tepsiler (Şekil 3D) içine slaytlar yükleyin.
Not: tepsiler yaylı bulunmaktadır. - Sürgülü tarama mikroskobu (Şekil 3E) ve tepsisi içine tepsileri yerleştirin.
- Her fluorofor için uygun pozlama süreleri ile her slayt için bir profil yüklemek için profil listesinde tıklayın. her slaydı el adlandırmak veya yazılım slayt etiketi üzerinde sağlanan barkod okuma için slayt adını tıklayın. slayt bir önizleme görüntüsü çekmek için başlangıç önizleme tarama düğmesine tıklayın.
- Doku algılama sihirbazında ilgi alanları ayarlayın ve görüntüleme sonraki tur için saklayın. Her slayt ayarlandıktan sonra, başlangıç tarama düğmesine tıklayarak tarama işlemini başlatmak.
Not: Sistem 100 sli tutabilirAynı anda des. - Görüntüleme bittikten sonra, görüntü montaj ve analizi için her .tif gibi bireysel kanal ve görüntüleme yuvarlak veya .jpg dosyaları görüntüleri ihracat.
7. Görüntü Meclisi
- Photoshop kullanarak Manuel yöntemi (veya katmanlı görüntü üretme yeteneğine sahip benzer bir resim düzenleme yazılımı).
- Her bir görüntüleme turda her tek kanal görüntüyü açın.
- bir kompozit görüntü içinde katmanlar olarak bireysel görüntüleri birleştirin. Bunu yapmak için, bir görüntüden katman paletinin içinde katman üzerinde tıklayın. Sonra başka bir görüntü üzerine tabaka sürükleyin. Bu sürükle ve bırak işlemi görüntüde yeni bir katman oluşturur. Diğer tüm görüntüler için bunu yapın. Alternatif olarak, bir görüntü yığını katmanların gibi birden fazla görüntü dosyalarını yükleyerek bu işlemi otomatik hale getirmek için (Stack ... içine Dosya> Komut> Load Files) bir komut dosyası kullanabilirsiniz.
- Her resim kompozit görüntüde tek bir katman olarak listelenir sonra, katman adının üzerine çift tıklayın la yeniden adlandırmakyers olarak farklı kanalları ayırt etmek gerekiyordu.
- Her bir katmanın aracılığıyla görmek ve gerçekten kompozit görüntü oluşturmak için katman paletinin içinde "Screen" için "Normal" her katman için karışım modunu değiştirmek için.
Not: Bu adımı hızlandırmak için ekrana tek bir katman değiştirmek sonra katman üzerinde sağ tıklayın, ardından diğer tüm katmanları vurgulamak, "kopya katman stili" seçmek ve diğer ekran stilini uygulamak için "hamur katman stili" seçeneğini katmanlar. - Daha iyi kromojenik katmanı sayesinde floresan sinyalleri görselleştirmek için kromojenik katmanın (yani, toluidin mavi) - İstenirse, donukluk (% 40 10 değişiklik değeri) azalır.
Not: Bu protokolde kullanılan kiremitli tarama mikroskobu ve böylece görüntüleme her turda slayt oluşabilir dönme miktarını en aza indirerek, 3 kenarlarında slaytlar tutar. Nedenle, elde edilen görüntüleri döndürmek zorunda kalmadan kullanıcı görüntüleri elle hizalamak için çok daha kolaydırgörüntüleme farklı mermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek Verim, Çok Görüntü Cryohistology için Genel İş Akışı
Şekil 1, bu teknik için kullanılan genel akışını gösterir. Bu görüntüleme ve nihayet görüntü hizalama / analiz birkaç tur aracılığıyla tespit edildiği yerden birkaç adım içerir. Haftada o örneklerin bu tür kirecini için gereken daha az zaman görüntüleme 4 mermi yoluyla numune sabitleme gitmek için süreç biraz alabilir. Görüntüleme düzeni tipik haliyle numune zaten (örn, GFPs, mineralizasyon etiketler,), daha sonra, floresan enzimatik aktivite deneyleri ile ve ardından birden fazla mesaj göndermiş floresan immün (örn., TRAP, AP, vb), endojen sinyal ile başlar ve nihayet hücre döngüsü analizi tahlilleri (örneğin, edu) ve kromojenik leke bitirir (örneğin, toluidin mavisi O, hem), O safranin vb atoxylin.
Bir Çocuk Bilek Ortak 6'dan Temsilcisi Örnek
Bu özel çalışmada, Aşil tendonu kemiğe giriş yeri (örneğin, entezis) arasında fibröz kıkırdak mineralizasyonu olan kollajen farklı (yani, COL1A1, Col2a1 ve Col10a1) ekspresyonu arasındaki ilişki göstermekti. Bu nedenle, COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP ve Col10a1 mCherry içeren üçlü transgenik flüoresan raportör fare her bir transgen ifade eden hücreleri belirlemek için kullanılmıştır. Görüntüleme ilk turu karşılık gelen bir iki haftalık fare, endojen transgen ifadesinin iken Aşil tendonu (Şekil 4B) entezis mineralleşir. görüntüleme ikinci tur sonra üzerinde yapıldımultiphoton mikroskop iki foton ikinci harmonik üretimi (SHG, Şekil 4C) üzerinden kollajen mimarisinin görüntüler elde etmek için. Bu adım, entesis içindeki kolajen liflerinin tabanında hücreleri tanımlamak için kullanıldı. Görüntüleme üçüncü tur entezisin (Şekil 4D) ve mineralizasyon teşvik ana sinyal ligandların biri olan Hint kirpi (İHH), bir immün adımdı. Görüntüleme dördüncü turda aktif mineral birikimi (Şekil 4E) alanlarını görselleştirmek için, Cy5 floresan ve mavi kromojenik sinyallerini ortaya çıkarır mavi alkalin fosfataz substrat kiti kullanılarak AP boyama oldu. Son olarak, görüntüleme beşinci tur fibrokartilaj (Şekil 4F) içinde proteoglikan içerik dahil olmak üzere anatomik özelliklerini görselleştirmek için TB boyanma oldu. Tüm görüntüler elle resim düzenleme yazılımı içinde uyumlu hale getirilmiştir. görüntüleme beş mermi 3 ardından 4 günlük bir süre üzerinde yapılmıştırörnek işleme ve kesit (7 gün toplam) gün.
Ortak bir Yetişkin Diz 11 temsilci Örnek
Bu deneyin amacı ön çapraz bağ (ACL) kesilerinden yoluyla ortak istikrarsızlaştırma aşağıdaki diz medial kollateral ligaman (MCL) entezisin meydana gelen mineralizasyon değişiklikleri belirlemektir. Mineralizasyon değişiklikleri bu 3 aylık farelerde MCL entezis kadar erken iki hafta sonrası cerrahi görülebilir. entezisin içinde fibrokartilaj mineral temasını izlemek için bir mineral etiketi 2 hafta sonrası ameliyat sırasında cerrahi (demeklosiklin) gününde fareler ve kurban (kalsein) bir gün önce verildi. Fareler de unmineralized ve mineralli fibrochondrocyt kolajen ifadesini izlemek için COL1A1-CFP ve Col10a1 mCherry floresan gazetecilere dahiles, sırasıyla. Görüntüleme birinci tur bu durumda floresan protein ve floresan etiketler mineralizasyonu (Şekil 5A) karşılık endojen sinyal, oldu. İkinci tur altta yatan kemik iliği (Şekil 5B) de entezisin içinde hidrotermal fibrokondrositler bu enzimin ifadesini yanı sıra osteoklastlar göstermek için TRAP boyama dahil. Üçüncü tur AP aktif fibrokondrositler mineralizasyonu yanı sıra altta yatan kemik (Şekil 5C) ve osteoblast bölgelerini göstermek için boyama oldu. Son olarak, TB boyama dördüncü turda (Şekil 5D) için yapılmıştır. Tüm görüntüler elle resim düzenleme yazılımı içinde uyumlu hale getirilmiştir. Bir kez daha görüntü uyum doku hasat alınan toplam süresi 7 gün oldu.
Distal Femur gelen Trabeküler Bone Temsilcisi Örneği
(Şekil 3B) uygulanmıştır. Bu süreç 12 slaytların toplam sayısını veren, 8 kadın ve kemik iliği içinde 3 farklı düzeylerde 8 erkek fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Referans belirteçleri (mikroküreler) epifiz ve kuru bölümler (Şekil 3C) ortalarında diyafizine içinde uygulanmıştır. 12 slaytlar fo boyandır mavi ve görüntüleme (Şekil 6A) ilk turda biriken mineral (kalsein mavi) ve mineralizasyon etiketleri (Calcein ve alizarin komplekson) için görüntülü kalsein. Slaytlar sonra görüntüleme üçüncü turda ikinci turda ve AP faaliyeti (Şekil 6C) 'de TRAP aktivitesi (Şekil 6B) için görüntülenmiştir. Son olarak, lamlar dördüncü turda (Şekil 6D) toluidin mavisi ile boyandı. referans marker kromojenik turda dahil olmak üzere her görüntüleme turunda görüntülendi ve özel yazılımı kullanılarak hizalanmış edildi. 3 kesitler her bloğun alındı 8 blokta gömüldü bu prosedür, 32 kemik (16 femur ve 16 vertebra) için verim bir fikir vermek için, bölümler 12 slaytlar arasında dağıtıldı ve 12 slaytlar 4 kez görüntülendi 96 kompozit görüntü yığınlarını üreten. Bu deneyi gerçekleştirmek için toplam süresi 8 gün oldu.
Protokolü için Şekil 1. Tipik İş Akışı. Genel adımlar 1) doku fiksasyonu, 2) bant-stabilize Cryosectioning, cam slaytlar bantlanmış bölümlerin 3) bağlılık, referans belirteçlerinin 4) uygulaması, 6 5) Birden fazla boyama mermi ve) dahil görüntüleme ve 7) görüntü montaj, hizalama ve analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yüksek verim gömülmesi ve bant stabilize aynı cryotape içerir stabilite, birden fazla kemik (AB), birbirlerine bitişik olarak yerleştirilmiş olabilir çünkü. Cryosectioning ve kesit (CD). Kuru buz parçası sırasında kullanılansüreci gömme katı öncesinde tüm cryo-blok (B) donma yerinde kemikleri düzeltmek için. Cryotape bloğu (C) üzerine atılırsa ve bölüm (D) Kesit sırasında teybe takılıp kalır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Cam Slaytlar, Slayt-tarama Mikroskop Tepsi içine Referans İşaretlerinin Uygulama ve Slaytlar Yükleniyor Taped Bölüm Şekil 3. bağlılık. Taped bölümler UV kür veya kitosan bazlı yapıştırıcı ile ya cam slaytlar yüzeyine (A yapıştırılmış ). Iyileştirme veya kurutma sonrasında, yapıştırıcı madde sadece ince, düz bir tabaka cryotape ve cam yüzeyi (B) arasında kalır. referans markers kuru slaytlar (C okla Microsphere çözeltisi damla) uygulanır. Slaytlar sonra mikroskop tepsiler (D) monte edilir ve mikroskop (E) yüklenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Bir İki haftalık Mouse Aşil Tendon ve Görüntüleme Beş yuvarlar. Kompozit görüntü yığını (A) görüntüleme beş tur oluşturuldu. 1. Tur (B): endojen COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP ve Col10a1 mCherry transgen ifadesi. İki foton mikroskop kollajen ikinci harmonik üretimi (SHG): Yuvarlak 2 (C). Yuvarlak 3 (D): İHH için immün. Round 4(E): AP enzimatik aktivitesi. Yuvarlak 5: toluidin mavi O (F). Bu rakam Dyment ark gelen modifiye edilmiştir. 2015 6. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Ortak istikrarsızlaştırma ardından MCL entezisin Görüntüleme Dört yuvarlar. Dizler MCL entezisin artan mineralizasyon yol açan, üç aylık farelerde destabilize bulundu. Kurban önceki gün verildi Bir demeklosiklin mineral etiket cerrahisi ve bir kalsein mineral etiketin gün verildi. Yuvarlak 1 (A): endojen COL1A1-CFP demeklosiklin ve kalsein mineral etiketleri Col10a1 mCherry transgen sentezleme. Yuvarlak 2 (B) </ Strong>: TRAP enzimatik aktivitesi. Yuvarlak 3 (c): AP enzimatik aktivitesi. Round 4 (D): toluidin mavisi O. TRAP ve AP sinyal panelleri M.Ö. TB sinyalinin üst yapı üzerine kurulmuştur. TRAP tampon demeklosiklin etiketi kaldırarak, doku decalcifies çünkü sarı kanal TRAP için yeniden kullanılabilir. Bu rakam Dyment ark gelen modifiye edilmiştir. 2015 11. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Dem: demeklosiklin, TRAP: tartarat-dirençli asit fosfataz, AP: alkalin fosfataz, MCL: medial kollateral ligaman. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Microsphere Referans İşaretleyiciler İçeren Distal Femur içinde Görüntüleme Dört yuvarlar. Üç aylık mikrofone kalsein ve alizarin komplekson mineral etiketleri verildi 1. Tur (AA '). Ayrıca endojen Calcein ve alizarain komplekson etiketleri birikmiş mineral mavi boyama Calcein Yuvarlak 2 (BB.'): TRAP enzimatik aktivitesi 3. Tur (CC '). :. AP enzimatik aktivitesi Round 4 (GG '): (ok tüm görüntüler aynı mikroküre gösterir, toluidin mavisi O. yeşil mikroküreler A'-D) her turda görüntülenmiştir.' Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Chitosan yapıştırıcı | UV ile sertleşen yapıştırıcı | |
| yapıştırıcı mekanizma | buharlaşma | UVpolimerizasyon |
| İyileşme süresi | > 24 saat | <20 dakika |
| bölümler yapışkan kürler sonra çıkarılabilir? | Evet | Yok hayır |
| Yapışkan erir kürünü? | Evet, düşük pH değeri asidik çözeltilerde | Yok hayır |
| Yapışkan ısı antijen alımı dayanabilir mi? | Yok hayır | Evet |
| Yapışkan otomatik floresan mı? | Yok hayır | UV aralığında minimal |
Kitosan Yapıştırıcı ve UV ile sertleşen Yapıştırıcı Arasında Tablo 1. Karşılaştırma
| Cryotape | Bant-Transfer Sistemi | |
| Bu sistemi kullanarak bölümü mineralize kemik mümkün? | Evet | mineralize kemiğin Evet ama parçalarslayt tamamen devredemez |
| Bu sistemi kullanarak bölümü mineralize eklemlere mümkün? | Evet | Evet |
| Bu sistemi kullanarak bölümü beyne mümkün? | Evet, ama doku görüntüleme birden turlarından sonra bant düşebilir | Evet |
| Olası aynı blokta gömülü çoklu örnekleri kesmek için? | Evet | Evet |
| Olası aynı bölümünde görüntüleme birden mermi yapmak için? | Evet | Evet |
Cryotape Sistemi ve Bant-devret sistemi Arasında Tablo 2. Karşılaştırma
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada birlikte lokalize ve tek bir bölüm üzerinde lekelenme / görüntüleme birden mermi görüntüleri hizalayarak çeşitli biyolojik önlemlerin ölçmek için detaylı bir cryohistology protokolü sundu. Bu bölüm, dokuya güç morfolojisi (örneğin, mineralize edilmiş kemik ve kıkırdak) muhafaza etmesi cryotape kullanılarak belirtilen yöntem özellikle faydalıdır. Buna ek olarak, kesit doku, aynı bölümün boyama / görüntüleme sanmı için izin cam slayt sıkıca yapıştırılır; seri bölümlerde her bir farklı bir protokol ile boyanmış geleneksel yöntemlerin aksine. , Bölümler arasında işbirliği lokalize sinyalleri lekeli ve birden mermi ile görüntülü olan tek bölümleri ile ilgili bir sorun değil bir şey çalışırken bir sorun teşkil edebilir seri bölümleri kullanma.
Piyasadaki ilk bant-stabilize doku kesit ürün bir teyp transfer sistemi 16, 17 oldu. Bu kaplı plastik bandı kullanırDoku cryoblock yüzeyine yerleştirilen bir sıcaklıkta iyi bir yapıştırıcı ile. bant altında Kriyostat bıçak keser, bölüm banda bozulmamış ve yapışık kaldırıldığında. Daha sonra bant, doku katı slayt bağlanmış hale şekilde UV-muameleli yapıştırıcı ile kaplanır slaytlar üzerine aşağı Örnek yan yerleştirilir. Bant uzaklıkta bölümünden pealed sonra, slayt floresan veya kromojenik histolojide için işlenebilir. yapıştırıcılar eşiğe düşüktür ve boyama birden mermi ve görüntüleme en yumuşak dokular ile çalışır. cam slaytlar yapışkan bant doku aktarırken Ancak mineralize bölümleri ile mineral parçalarının kaybı olabilir. Buna ek olarak, bu kriyostat (> 8000 $) ve sarf maliyetleri yüklemek için nispeten pahalı bir sistem (> 2 $ / slayt) yüksek olmasıdır.
Dr. Tadafumi Kawamoto tarafından geliştirilen bir başka kaset istikrar stratejisi kullanıryapışkan kaplı polivinil klorid filmi doku bölümünü yakalamak için. Onların protokolde, taze dondurulmuş doku kaset üzerine kesitli ve hemen PFA veya etanol 18 sabit. Daha sonra, teyp lekeli ve daha sonra aşağı mikroskopik inceleme için örnek tarafı ile bir cam slayt üzerine monte edilmiş. Bu nedenle, her boyama protokolü bir farklı bantlanmış bölüm üzerinde gerçekleştirilir.
Biz değiştirilmiş ve gömme önce formalin örnek sabitleme de dahil olmak üzere bir dizi yolla içinde Kawamoto protokole ekledik. Bu aşama, hücre sınırları içinde transgenik hayvanların çözünür sitoplazmik GFP düzeltmek için kritik öneme sahiptir. Bu doku tipleri 5-13 geniş bir aralığı için cryotape kullanmışlardır. Sınırlı histolojik deneyime sahip laboratuvar personeli bu yöntemle yüksek kaliteli bölümleri üretebilir. Bu protokolün başlıca avantajları göreceli düşük maliyetli (özel enstrümantasyon, <slayt başına 1,00 $) olan, mineral parçalarının kaybı,ve yetenek aynı bölüm üzerinde boyama ve görüntüleme birden mermi gerçekleştirmek için.
tekrarı bir slayt birden çok kez aynı bölgeleri görüntüleme hatta motorlu sahne kullanarak slaytlar çok sayıda mantıksız olurdu, çünkü bu protokolün diğer kritik adım tutarlılığı ve verimi artırmak için bir slayt-tarama mikroskobu kullanılmasıdır. mikroskop Epifloresans ve iletilen ışık hem altında faaliyet gösteren bir dijital slayt tarayıcı. Bu 10 pozisyon motorlu taret ve her ikisi de B & W ve renkli kameralar ile donatılmıştır. Sistemin gerçek yenilik, bizim ellerimizde, belirli ilgi bölgeleri hızlı ve kolay bir kullanıcı tarafından tanımlanan veya görüntüleme yazılımı tarafından otomatik olarak tespit edilebilir olmasıdır. ilgi Bu bölgeler daha sonra görüntüleme ilk turunda kurtulacak ve daha sonraki turda hızla yeniden olabilir. Bu nedenle, ilgi aynı bölgeleri görüntüleme her turda görüntülenmiş. Kullanıcı tarafından göreyazılımda tanımlanan parametreler, mikroskop otofokus ve ilgi bölgeleri içinde satın alma sırasında dikişli kiremitli görüntüleri tarar.
Kullanıcı boyama birden mermi gerçekleştiren hangi sırası önemlidir. Genel düzeni Şekil 1'de özetlenmiştir. Yeterince floresan mikroskobu ile ayrılabilen fluorophores sayısı belirli bir bölümünde elde edilebilir tepki önlemlerin sayısının birincil sınırlayıcı faktördür. Bununla birlikte, flüoresan kanallar bazı durumlarda yeniden kullanılabilir. Örneğin, mavi kalsein ve demeklosiklin hem san bir kanal güçlü bir sinyal TRAP aktivitesini ölçmek için kullanılan yayar. Bu boşaltma yoluyla TRAP tampon böylece TRAP aktivitesini görüntüleme öncesinde mineral çıkarma bölümüne decalcifies çünkü olsa önlenir. Buna ek olarak, DAPI counterstain yanı sıra sarı kanalda yayacaktır. Ancak, kullanıcı th başka counterstain ile DAPI değiştirebilirsinize kırmızı veya uzak-kırmızı aralığı. Buna ek olarak, antikorlar, şeritli ve aynı flüoresan kanalları kullanarak farklı antikorlarla tekrar boyandı. Bu nedenle, bu yöntem belirli bir bölümünde kaydedilebilir tepki önlemlerinin sayısını artırarak oldukça uyarlanabilir.
sunulan protokol ile bazı sınırlamalar vardır. 1) cryotape belirli dokular için yeteri kadar uygun olabilir. Örneğin, formalin ile fikse beyin bölümleri boyama birden turlarından sonra bandı düşmek eğilimindedir. Doku UV aktif yapışkan (bu iki yöntem arasındaki karşılaştırma için bakınız Tablo 2) ile cam yüzeyine yapışık olarak bu gibi dokular için, şerit transfer sistemi daha uygun olabilir. şeffaf optik özellikleri sunarken 2) kitosan yapışkan, yüksek sıcaklıklara veya güçlü asitler içeren sert işleme adımlarını hayatta olmaz. Bu nedenle, UV harekete geçen yapışkan, bu uygulamalar için uygundur (Tablo 1 FBu iki yapıştırıcılar arasında ya da karşılaştırılması).
Burada sunulan cryohistological protokoller de daha yüksek verim ve otomasyon kendilerini katmaktadır. Nispeten acemi kullanıcılar anlamlı artırıp, aynı blokta aynı anda birden fazla kemikler ya da eklemler kesmek için, örneğin, cryotape tarafından sağlanan bant stabilizasyonu sağlar. otomatik tarayıcı kullanarak önemli ölçüde tipik deneyimlerimiz hız kısıtlayıcı adım olmuştur görüntüleme, ilgili teknisyen zaman ve maliyeti azaltır. Dokuların otomatik, objektif analiz için bir platform sağlar kısa bir süre içinde tutarlı ve güvenilir görüntü faiz birkaç kez aynı bölgede güçlü olmak. Aslında, bizim grup bilgisayar otomatik hizalama ve kemik histomorfometrisi için bir platform geliştirdi. İlk olarak, yazılım floresan referans belirteçleri dayalı görüntülerin birden mermi hizalar. Ardından, hizalanmış görüntüleri histomorfometri boru hattı nerede Comput beslenirer yazılım ilgi bölgesini tanımlayan ve objektif birkaç statik ve dinamik ölçümler (en fazla görmek ölçer www.bonebase.org) 13. Bu platform, çünkü cryotape kesit, dijital slayt-tarama mikroskobu ve özel analiz yazılımı tarafından sağlanan artış verim ve tutarlılık mümkün olmuştur. Bu protokol, yüksek kapasiteli cryohistology önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir ve doku kesit deneyimsiz olanlar gibi kemik gibi dokular bölümü zor olan görüntüleme için faydalı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
