Introduction
Biologisch onderzoek vereist vaak efficiënt fenotypering, die vaak is geassocieerd met een soort van histologische analyse 1-3. Deze behoefte is nog duidelijker bij de ambitieuze projecten voor elk gen in de muis genoom 4 verstoren. Deze histologische analyses kunnen variëren van het beoordelen celmorfologie en / of anatomische kenmerken te brengen expressie van specifieke genen of eiwitten aan individuele cellen. In feite is een van de fundamentele bijdragen van histologie op het gebied van genomica is de mogelijkheid om een specifieke moleculaire signaal koppelen aan een specifieke regio of celtype.
Traditionele methoden van histologie, vooral voor musculoskeletale weefsels, zijn vaak tijdrovend en moeizaam, die soms weken op te lossen, ontkalken, sectie, vlek, beeld en het monster vervolgens analyseren van de beelden via menselijke interpretatie. Het analyseren van meerdere moleculaire signalen, hetzij via immunohistochemie, in situ hybridization, of speciale vlekken, vereist meerdere secties en zelfs meerdere specimens adequaat presteren. Bovendien, deze meerdere reacties kunnen niet gelijktijdig worden gelokaliseerd aan dezelfde cel en soms niet gelijktijdig gelokaliseerd in een bepaald gebied in een gegeven monster. Als het veld genomics en epigenomics verplaatst naar het digitale tijdperk, moet de histologische veld ook volgen op efficiënte, hoge doorvoer en geautomatiseerde analyse van moleculaire signalen in een histologische sectie verschaffen.
Inderdaad is er een behoefte aan verbeterde histologische technieken die meerdere moleculaire signalen kunnen koppelen aan specifieke cellen in een gegeven monster. Onlangs hebben we een nieuwe high-throughput cryohistological methode voor het bepalen van een aantal bestrijdingsmaatregelen binnen een bepaalde sectie van gemineraliseerd weefsel 14/05 gepubliceerd. Het proces omvat het stabiliseren van de cryosectie met bevroren cryotape, hechten van de afgeplakte gedeelte vast aan een microscoop glijbaan, engeleidende verschillende rondes van kleuring en beeldvorming op elke sectie. Deze rondes van beelden worden vervolgens uitgelijnd met de hand of via de computer automatisering voorafgaand aan beeldanalyse (figuur 1). Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van dit proces en voorbeelden waarbij deze technieken ons begrip van verschillende biologische processen verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Universiteit van Connecticut Health Center institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissie keurt alle dierlijke procedures.
1. Fixatie and Embedding
- Euthanaseren het dier via de CO 2 stikken of andere goedgekeurde methoden.
- Oogst de weefsel van belang (bijvoorbeeld ledematen, wervels, etc.) en plaats in 10% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C tot de juiste manier bevestigd. Wees extra voorzichtig om een consistente anatomische plaatsing voorafgaand aan de fixatie te behouden. Bijvoorbeeld, fix ledematen met gewrichten op consistente buiging, interne rotatie en externe rotatie hoeken 11. Typisch, fix hele muis ledematen voor 1-3 dagen.
Let op: Formaline is giftig en mag in een zuurkast worden behandeld terwijl het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
Opmerking: Het tijdschema van de fixatie afhangt van de grootte van het monster. Indien het experiment toelaat, opensnijden van het bot fixatie van het merg compartiment verbeteren.Sommige exemplaren kunnen perfusiefixatie 15 vereisen fluorescerende achtergrond (bv zwakke fluorescentie signalen binnen het beenmerg) te minimaliseren. - Transfer specimens van formaline tot 30% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 12-24 uur bij 4 ° C.
Let op: Eenmaal gedurende 12-24 uur, monsters kunnen vervolgens worden bij -80 ° C voor langdurige opslag geplaatst. Deze opslagmethode wordt aanbevolen voor experimenten waarin onderzoekers gaan meerdere monsters te bedden in hetzelfde blok, maar kunnen niet al deze monsters oogsten tegelijkertijd (bijvoorbeeld experimenten met verschillende tijdstippen). - Verwijder exemplaren uit de sucrose en ontleden weg overtollige weefsel.
- Vul een cryomold (grootte van schimmel is afhankelijk van monster grootte) deel van de weg met cryo inbedding medium. Plaats monster matrijs zodat snijvlak van het interessegebied is parallel aan de bodem van de vorm.
Opmerking: Een voorbeeld van een specifiek weefsel plaatsing en richtingis te vinden in figuur 2A - B. - Plaats de cryomold op een stuk droog ijs tot een dunne laag van cryo inbeddingmedium bevriest en vervolgens fixeert het monster op zijn plaats. Vul het resterende volume van de cryomold met cryo inbeddingmedium met behoud van de cryomold op het droge ijsregen.
- Plaats de cryomold in een houder met 2-methyl-butaan vooraf gekoeld met droogijs. Zodra exemplaren volledig zijn bevroren, verwijder cryomolds en schud het overtollige 2-methyl-butaan. Wikkel cryomolds in cellofaan en in een -20 ° C of -80 ° C vriezer voor opslag.
Opmerking: Monsters kunnen uitdrogen tijd indien opgeslagen in cryo inbeddingmedium, vooral bij -20 ° C. We raden opslag van monsters langer dan 1-2 maanden cryo inbeddingmedium bij -80 ° C of 30% sucrose bij -80 ° C (zie stap 1,3).
2.-Tape gestabiliseerd Tissue-Sectie
- Verwijder specimen blokken van diepvries en plaats in cryostat de ingesteld tussen -20 en -25 ° C geroerd.
- Verwijder het blok van de cryomold en trim overtollige cryo weg inbedding medium met een scheermesje.
- Plaats wat cryo inbeddingmedium op het objectplaatje en lijn het blok zodanig dat het oppervlak van het monster schijf parallel aan het bodemoppervlak van het blok waarbij de juiste snijvlak vaststelling voor de regio van belang.
- Leg het monster disc in de cryostaat en zorgen voor de cryo inbedding medium te bevriezen.
- Het analysemonster schijf op de objectkop en pas de kop zodanig dat het blad evenwijdig met het oppervlak van het monster blok.
- Trim het blok naar beneden tot een niveau binnen de regio van belang en borstelen eventuele spaanders van het oppervlak van het blok.
- Knip een stuk van de cryotape groot genoeg is om het gebied van belang en pre-chill in de cryostaat te dekken.
Opmerking: Meerdere stukken kunnen worden gesneden van een consistente grootte en opgeslagen in de cryostop tijdens het snijden. - Verwijder niet-klevende steun van de cryotape door grijpen de tape door de niet-plakkerige zilver / goud tabs behulp van een tang en zet de tape op het blok sticky-kant naar beneden.
- Druk uitoefenen op de cryotape met de rol (figuur 2C).
- Maak een sectie (5-8 pm) met behulp van de automatische motor of handmatig snijden wiel van de cryostaat.
Opmerking: Het is een goede gewoonte om de rand van de cryotape vast te houden als het aankomt op het podium, zodat de sectie niet van het podium valt tijdens het snijden (figuur 2D). - Leg het gedeelte weefsel kant naar boven op een plastic microscoopglaasje binnen de cryostaat.
- Verwijder de plastic dia van de cryostaat en laat het cryo inbeddingsmedium smelten zodat het gedeelte aan het oppervlak van de schuif.
- Herhaal snijden voor seriële secties of andere regio's van belang.
- Eenmaal klaar, slaan de secties in een dia doos eent 4, -20 of -80 ° C afhankelijk van de lengte van de opslag nodig is en de stroomafwaartse responsmaatregelen. Gebruik bijvoorbeeld dia's die zullen worden gekleurd voor enzymatische activiteit (zie 5,2-5,3) binnen een maand als bewaard bij 4 ° C.
3. Hechting van de afdelingen te Microscope Slides
- UV kleefstof methode.
- Label de microscoop dia.
Opmerking: Voor meer automatisering, samples en dia's kunnen worden gelabeld met barcodes. - Breng een druppel-UV geactiveerde optische kleefmiddel twee glasplaatjes en gebruik de rand van een plastic dia een dunne laag hechtmiddel verspreid over het oppervlak van de glasplaatjes.
- Snijd de / tab zilver goud en leg de afgeplakte sectie weefsel zijde naar boven op de lijm van de eerste dia. Breng het gedeelte in een rollende beweging van de ene kant naar de andere om de vorming van ingesloten luchtbellen onder de band te minimaliseren.
OPMERKING: De eerste slede wordt gebruikt voor het vooraf bevochtigen van de onderzijde van tHij tape voorafgaand aan het plaatsen het op de tweede (permanent) slide (stap 3.1.4). - Verwijder de vastgebonden gedeelte van de eerste schuif en plaats het op de kleeflaag van de tweede schuif (figuur 3A). Nogmaals, zorg om insluiten van luchtbellen te vermijden.
LET OP: Deze stap duurt praktijk te beheersen. - Zodra het vereiste aantal secties voor het experiment gegeven wordt op elke dia Veeg overtollige lijm uit de omgeving.
- Inspecteer elke sectie nauw te bellen of vezels onder de tape. Voer deze inspectie onder een microscoop of vergrootglas. Als er obstakels, verwijder de afzonderlijke sectie, verwijder de obstructies, en vervolgens opnieuw toe te passen aan het glaasje.
- Zodra is vastgesteld dat er geen obstakels onder vastgebonden secties, plaats de objectglaasjes onder de UV black light voor 5-10 minuten om de lijm te verknopen.
- Label de microscoop dia.
- Chitosan lijm methode.
- Bereid the 1% chitosan lijm. Bereid azijnzuuroplossing door het oplossen van 0,25 ml geconcentreerd azijnzuur in 100 ml gedeïoniseerd water (0,25% v / v). Los 1 g chitosan poeder in 100 ml azijnzuuroplossing en roer de oplossing O / N of totdat al het chitosan poeder wordt opgelost.
NB: De oplossing is stabiel bij kamertemperatuur. - Deponeren een druppel chitosan oplossing voor elke sectie die op de slede worden geplaatst.
- Snijd de tab zilver / goud van de tape en plaats elke afgeplakt sectie weefsel zijde naar boven op de lijm (figuur 3A). Gebruik grote zorg om insluiten van luchtbellen te vermijden.
- Zodra alle gedeelten op de slede geplaatst, tilt de schuif op een van de lange zijden en sleep buitensporige chitosan aan de onderrand behulp van een tang.
- Plaats de glaasjes in deze oriëntatie bovenop een tissue een schuifkast. Zwaartekracht zal dan voor zorgen dat de overtollige chitosan neer te vallen op de handdoek, waardoor een vlakke, uniforme laag van chitosan.
- Place de dia doos met het deksel open opengehouden in de koelkast O / N om het chitosan om te drogen.
OPMERKING: Zie tabel 1 voor een vergelijking tussen de twee lijm methoden.
- Bereid the 1% chitosan lijm. Bereid azijnzuuroplossing door het oplossen van 0,25 ml geconcentreerd azijnzuur in 100 ml gedeïoniseerd water (0,25% v / v). Los 1 g chitosan poeder in 100 ml azijnzuuroplossing en roer de oplossing O / N of totdat al het chitosan poeder wordt opgelost.
4. Toepassing van de Reference Markers naar Slides
- Bereid referentiemarkering oplossing door het oplossen van 50 ui groene en 50 pl rode microbolletjes in 100 pl water. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.
- Plaats een 10 ul of 20 pi pipet tip in de microsfeer oplossing. Voeg een kleine druppel van de oplossing microsfeer elke sectie grenzend aan het gebied van belang (figuur 3C). Wees voorzichtig om de microsferen binnen de regio van belang niet te krijgen.
- Droog de objectglaasjes bij kamertemperatuur (beschermd tegen licht) gedurende 30 min indien verwerkt de glaasjes op die dag. Zo niet, plaats de objectglaasjes in een doos bij 4 ° C.
Opmerking: Zolang de microsfeer oplossing droogt vóór de dia hydrateren, de microspheres zal gehecht blijven aan de dia's tijdens meerdere rondes van vlekken / beeldvorming.
5. Meerdere Rondes van kleuring
OPMERKING: Door een compatibele reeks imaging, kleuring en reimaging stappen, is het mogelijk te detecteren en co-lokaliseren veel biologische signalen op dezelfde weefselsectie. Elke ronde van beeldvorming / vlekken / reimaging worden ontwikkeld voor de specifieke histologische vraag. De beeldvorming / kleuring / reimaging sequentie omvat gewoonlijk het verwerven van de endogene fluorescentiesignalen (bijvoorbeeld cellulair GFP, mineralisatie kleurstoffen, in vivo imaging probes) op de eerste ronde van beeldvorming gevolgd door fluorescente multiplex immunokleuring en meerdere ronden enzymactiviteit vlekken. Ten slotte kan het onderdeel worden gekleurd met behulp van chromogene kleurstoffen (bijvoorbeeld H & E, toluïdineblauw, safranine O, enz.) Aan de weefselarchitectuur markeren. Gepresenteerd in deze sectie zijn aangepaste methoden aangepast vancommercieel beschikbare protocollen.
- Calceïne blauw kleuring voor geaccumuleerde minerale
LET OP: calceïne blauwe vlekken levert een consistente mineraal oppervlak dat vatbaar is voor automatische beeldanalyse in tegenstelling tot donkerveld of differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming. Het probleem met calceïne blauwkleuring is dat het fluorescentiespectrum overlapt tetracycline en demeclocycline etikettering. Daarom, als de steekproef deze minerale labels, beeld de labels in de eerste ronde van beeldvorming vóór kleuring met calceïne blauwe bevat.- Als de endogene signalen in het weefsel voorafgaand worden afgebeeld op deze vlekken stap, dompel de dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1xPBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
- Bereid 30 mg / ml calceïne blauwe oplossing in 2% NaHCO3 (gemaakt door het oplossen van 2 g NaHCO3 in 100 ml H2O en pasgens pH van 7,4 met HCl). Aliquot en bewaar de oplossing bij -20 ° C.
- Dompel de dia's in een Coplin pot met 1x PBS gedurende 15 minuten op de afdelingen te hydrateren, indien deze niet reeds uit de vorige ronde gehydrateerd.
- Verwijder de glijbanen en droog de achterkant en de randen met een papieren handdoek.
- Solliciteer 100-500 ul van calceïne blauwe oplossing per dia en incubeer gedurende 10 min in een vochtige kamer bij RT.
- Spoel de objectglaasjes in 1x PBS gedurende 10 min met 3 veranderingen.
- Solliciteer ~ 200 ul van 50% glycerol in 1x PBS om elke dia en monteer het deksel slip.
- Overtollig glycerol en droog de onderkant van de glijbanen.
- Tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP) enzymatische activiteit kleuring
OPMERKING: TRAP wordt uitgedrukt door meerdere celtypes in de hematopoietische afkomst waaronder osteoclasten. De TRAP-kleuring hier gepresenteerde maakt gebruik van een geel fluorescerend zuur fosfatase substraat. Sommige fluorescerende signalen ovERLAP met de aangepaste gele filter set inclusief tetracycline / demeclocycline mineralisatie labels, calceïne blauwe vlek, en DAPI tegenkleuring.- Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1x PBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
- Bereid Buffer 1 door oplossen van 9,2 g watervrij natriumacetaat en 11,4 g natrium tartraat dibasisch dihydraat in water en het brengen van het uiteindelijke volume op 1000 ml. Breng de pH op 4,2 met geconcentreerd ijsazijn (~ 1,5-2 ml). Bewaar de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 12 maanden.
- Buffer 2 Bereid door oplossen van 40 mg natriumnitriet in water en het brengen van het uiteindelijke volume op 1 ml. Bewaar de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
- Op de dag van kleuring Bereid de reactiebuffer door het mengen van 7,5 ml van buffer 1 en 150 pl buffer 2.
- Breng de reactiebuffer zonder het substraat aan de dias 10 - 15 min aan het weefsel equilibreren bij de lagere pH.
Opmerking: Het typische volume ~ 200 ul maar moet groot genoeg zijn om alle secties te dekken. - Verdun de geel fluorescerende zuurfosfatase substraat tussen 1:50 en 1: 100 in de reactiebuffer.
LET OP: Moet verdund zal worden gedicteerd door TRAP activiteit in de steekproef. - Giet de reactiebuffer af van de glijbanen en breng de reactiebuffer de geel fluorescerende substraat dia.
- Zet de objectglaasjes onder de UV zwarte licht ~ 5 min aan het substraat te activeren.
LET OP: incubatietijd kan variëren afhankelijk van de TRAP activiteit in de steekproef. - Spoel de objectglaasjes in 1x PBS gedurende 10 min met 3 veranderingen.
- Solliciteer ~ 200 ul van 50% glycerol in 1x PBS om elke dia en monteer het deksel slip.
- Overtollig glycerol en droog de onderkant van de glijbanen.
NB: De zure TRAP buffer zal de secties ontkalken. Het extra voordeel van het decalcificatie is dat bepaalde kleuren weer beschikbaar voor downstream kleuring (bv mineralisatie labels) zal zijn. Zo zal de calceïne blauwkleuring gedurende de TRAP kleuring worden verwijderd. Daarom kan DAPI tegenkleuring in dit kanaal worden afgebeeld tijdens een volgende ronde.
- Alkalische fosfatase (AP) enzymatische activiteit kleuring
LET OP: Meerdere soorten cellen die betrokken zijn bij de mineralisatie waaronder osteoblasten en mineralisatie chondrocyten uiten AP. De Fast Red substraat gebruikt in dit protocol roept zowel een fluorescerend rood en chromogene rood sein. Hierdoor wordt het chromogene substraat fluorescentiesignalen in de gebieden waar het substraat neerslaat blussen. Daarom is het het beste om deze kleurstof doen na beeldvorming van de fluorescentiesignalen die kunnen worden gedoofd door het AP substraat.- Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1x PBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. remove en droog de dekglaasjes.
- Bereid 1 M Tris door het oplossen van 12,1 g Tris in 100 ml water. Breng de pH op 9,5 met 1 M NaOH.
- Bereid 1 M MgCl2 hexahydraat door het oplossen van 20,33 g MgCl2 in 100 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid 2 M NaCl door het oplossen van 11,68 g NaCl in 100 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid 100x (20 mg / ml) voorraadoplossing van Fast Red TR zout door het oplossen van 1 g poeder in 50 ml gedeïoniseerd water. Voeg 100 ul porties en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid 100x (10 mg / ml) naftol AS-MX fosfaat voorraadoplossing door het oplossen van 500 mg poeder in 50 ml N, N dimethylformamide. Voeg 100 ul porties en bewaar bij -20 ° C.
- Op de dag van kleuring bereiden AP buffer door het toevoegen van 1 ml van 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl2, 0,5 ml 2 M NaCl en breng het uiteindelijke volume op 10 ml met behulp gedeïoniseerd water (eindconcentraties: 100 mM Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
- Plaats AP bUffer elke dia en incubeer in een vochtige kamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid AP substraat buffer door verdunning 100x voorraden Fast Red TR Zout en Naftol AS-MX tot 1x in de AP-buffer.
- Giet AP buffer off van dia's en vervangen door AP substraat buffer. Incubeer glijbanen voor 5-10 min in een vochtige kamer bij RT.
OPMERKING: Incubatie tijd wordt bepaald door AP activiteit van het monster. - Was 3x glijdt in 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
- Mount dekglaasjes met DAPI tegenkleuring oplossing (1: 1000 verdunning van DAPI in 50% glycerol in 1 x PBS).
- Toluïdine blauw O (TB) chromogeen kleuring
OPMERKING: Omdat alle voorgaande stappen zijn afgebeeld onder tijdelijke waterige montage in 50% glycerol / PBS-oplossing, wordt de chromogene stap ook afgebeeld in aanwezigheid van water. Echter, de kleuroplossing vaak uitlogen tijd. Daarom wordt voorgesteld om het beeld toluidineblauw zo snel mogelijk na kleuring.- Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met gedemineraliseerd water totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
- Na het verwijderen van de dekglaasjes, te vervangen door vers water en incubeer de objectglaasjes gedurende ten minste 10 minuten zodat zouten van PBS voldoende uit het weefsel verwijderd.
- Bereid 0,025% TB-oplossing in gedemineraliseerd water.
- Plaats de objectglaasjes in de TB oplossing 1-5 min.
OPMERKING: incubatie tijd is afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker, maar consistent in alle monsters moeten worden bewaard. - Plaats dia's in Coplin pot met gedemineraliseerd water en wassen glijbanen 3x gedurende 5 minuten elk.
- Mount dekglas met 30% glycerol opgelost in gedemineraliseerd water (NIET 1x PBS, omdat dit zal leiden tot de vlek uit te lekken uit het weefsel). OPMERKING: Glycerol fixeermiddel kan zijn gesubstitueerd met fructosestroop, waardoor diffusie van de vlek uit het weefsel te voorkomen. naarbereiden fructosestroop, los 30 g fructose in 10 ml gedeioniseerd water en verhit tot 60 ° C totdat opgelost.
6. Meerdere Rondes van Imaging
- Plaats de dia's in de microscoop trays (Figuur 3D).
Opmerking: De trays zijn verende. - Plaats de laden in de lade stapel van de slide-scanning microscoop (figuur 3E).
- Klik op de lijst met profielen om een profiel te laden voor elke dia met de juiste belichting tijden voor elke fluorofoor. Klik op de naam dia om elke dia handmatig te noemen of de software leest de barcode die op de dia label. Klik op de start preview-scan knop om een voorbeeld beeld van de dia te nemen.
- Stel de regio's van belang in het weefsel detectie wizard en bewaar ze voor latere rondes van beeldvorming. Zodra elke dia is ingesteld, start het scanproces door te klikken op de start scan-knop.
Opmerking: Het systeem kan maximaal 100 slides tegelijk. - Zodra de beeldvorming is voltooid, exporteert u de beelden van elk kanaal en imaging round individueel als .tif of .jpg-bestanden voor het monteren en analyse.
7. Afbeelding Assembly
- Handmatige methode met behulp van Photoshop (of vergelijkbare software voor beeldbewerking kunnen produceren gelaagde beelden).
- Open elke afbeelding afzonderlijk kanaal uit elk imaging round.
- Monteer de afzonderlijke beelden als lagen binnen een samengestelde afbeelding. Om dit te doen, klikt u op de laag in het palet lagen van het ene beeld. Vervolgens sleept u de laag naar een andere afbeelding. Dit drag and drop operatie zal een nieuwe laag in de afbeelding te maken. Doe dit voor alle andere afbeeldingen. U kunt ook gebruik maken van een script (Bestand> Scripts> Bestanden laden naar stapel ...) om dit proces te automatiseren door het laden van meerdere beeldbestanden als lagen in een afbeelding stapel.
- Zodra elk beeld wordt genoemd als een individuele laag in het samengestelde beeld, dubbelklik op de naam van de laag naar de la hernoemenyers als nodig is om de verschillende kanalen onderscheiden.
- Om te zien door middel van elke laag en het creëren van een echt samengesteld beeld, verander de blend modus voor elke laag van "Normal" naar "Screen" in het palet lagen.
Opmerking: Om het tempo van deze stap, het wijzigen van een enkele laag op het scherm, klik met de rechtermuisknop op de laag, selecteer "copy layer style", wijs dan alle andere lagen en kies "plakken layer style" om het scherm stijl toe te passen op de andere lagen. - Indien gewenst, verminderen de opaciteit (veranderingswaarde tot 10-40%) van het chromogene laag (dwz toluidine blauw) aan de fluorescentiesignalen beter zichtbaar door de chromogene laag.
Opmerking: De betegelde scanning microscoop gebruikt in dit protocol houdt de glaasjes op 3 randen, waardoor de hoeveelheid draaiing die kunnen ontstaan aan de slede tijdens elke ronde van beeldvorming minimaliseren. Derhalve is het veel gemakkelijker voor de gebruiker om de afbeeldingen handmatig uitlijnen zonder beelden verkregen roterenuit verschillende rondes van beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een algemene Workflow voor de High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology
Figuur 1 het algemene werkschema voor deze techniek. Het omvat verschillende stappen van fixatie door verschillende rondes van beeldvorming en uiteindelijk beelduitlijning / analyse. De werkwijze kan vaak minder dan een week te gaan van monster fixatie tot 4 rondes van beeldvorming, die minder tijd dan nodig is om dit soort monsters ontkalken. De volgorde van de weergave begint typisch met de endogene signalen die al in het monster zijn (bijvoorbeeld GFP, mineralisatie labels, etc.), vervolgens gemultiplext fluorescent immunokleuring gevolgd door fluorescentie enzymatische activiteit assays (bijv., TRAP, AP, etc.) en celcyclus analyse assays (bijv edu) en tenslotte eindigt met een chromogeen vlek (bijvoorbeeld toluïdine blauw O, zoomatoxylin, safranine O, etc.).
Representatief voorbeeld van een Juvenile enkelgewricht 6
Het doel van dit onderzoek was de correlatie tussen expressie van verschillende soorten collageen (dwz COL1A1, COL2A1 en Col10a1) met mineralisatie van het vezelig kraakbeen van de achillespees naar bot insertieplaats (dwz enthese) tonen. Daarom is een triple transgene fluorescerende reporter muis waaronder COL1A1-GFPTpz, COL2A1-GVB, en Col10a1-mCherry werd gebruikt om cellen die elke transgene identificeren. De eerste ronde van beeldvorming was de endogene transgenexpressie van een twee weken oude muis, dat overeenkomt met bij de enthese mineraliseert in de achillespees (figuur 4B). De tweede ronde van beeldvorming werd vervolgens uitgevoerd op demultiphoton microscoop om beelden van het collageen architectuur te verwerven via twee foton tweede harmonische generatie (SHG, Figuur 4C). Deze stap werd gebruikt om cellen te identificeren aan de basis van de collageenvezels in de enthese. De derde ronde van beeldvorming is een immunokleuring stap Indian hedgehog (IHH), die een van de voornaamste liganden signaleren dat mineralisatie van de enthese (figuur 4D) bevordert. De vierde ronde van beeldvorming werd AP kleuring met een blauwe alkalisch fosfatase substraat kit, die zowel Cy5 fluorescentie en blauwe chromogene signalen opwekt, gebieden actieve mineraalafzetting (Figuur 4E) te visualiseren. Ten slotte is de vijfde ronde van de beeldvorming was TB kleuring om de anatomische kenmerken, zoals de proteoglycan inhoud binnen de fibrocartilage (Figuur 4F) te visualiseren. Alle beelden werden met de hand afgestemd binnen beeldbewerkingssoftware. De vijf ronden van beeldvorming werd uitgevoerd over een periode van 4 dagen, 3 die volgdedagen van het monster verwerking en snijden (7 dagen in totaal).
Representatief voorbeeld van een volwassene kniegewricht 11
Het doel van dit experiment was om de mineralisatie veranderingen die optreden in de enthese van de mediale collaterale ligament (MCL) van de knie volgende gemeenschappelijke destabilisatie via doorsnijding van de voorste kruisband (VKB) te bepalen. Mineralisatie veranderingen te zien in de MCL enthese al twee weken na de ingreep in deze 3-maanden oude muizen. Minerale aanbrenging van fibrocartilage binnen de enthese controleren, werd een mineraal label gegeven aan de muizen op de dag van de operatie (demeclocycline) en de dag voor het offer (calceïne) na 2 weken na de operatie. De muizen omvatte ook COL1A1-GVB en Col10a1-mCherry fluorescerende reporters aan collageen expressie van unmineralized en gemineraliseerde fibrochondrocyt bewakenes, respectievelijk. De eerste ronde van beeldvorming was de endogene signalen, die in dit geval overeen met de fluorescerende eiwitten en fluorescerende labels mineralisatie (Figuur 5A). De tweede ronde opgenomen TRAP kleuring expressie van dit enzym in mineralisatie fibrochondrocieten in de enthese en osteoclasten tonen in het onderliggende beenmerg (Figuur 5B). De derde ronde was AP kleuring regio's van actieve mineralisatie van fibrochondrocieten en osteoblasten van het onderliggende bot (Figuur 5C) tonen. Tenslotte werd TB kleuring uitgevoerd voor de vierde ronde (figuur 5D). Alle beelden werden met de hand afgestemd binnen beeldbewerkingssoftware. Eens te meer de totale tijd die uit weefsel oogst tot beelduitlijning was 7 dagen.
Representatief voorbeeld van trabeculair bot uit distale dijbeen
(Figuur 3B). Deze werkwijze werd uitgevoerd op 8 mannelijke en 8 mannelijke muizen op 3 verschillende niveaus binnen het beenmerg, wat in totaal 12 slides. De referentie-markers (microsferen) werden binnen de epifyse en het midden-diafyse op de droge delen (figuur 3C) toegepast. Alle 12 slides werden gekleurd for calceïne blauw en afgebeeld voor geaccumuleerde mineralen (calceïne blauw) en mineralisatie labels (calceïne en alizarine complexone) tijdens de eerste ronde van de beeldvorming (figuur 6A). De objectglaasjes werden vervolgens afgebeeld voor TRAP activiteit (figuur 6B) in de tweede ronde en AP-activiteit (Figuur 6C) in de derde ronde van beeldvorming. Tenslotte werden de glaasjes gekleurd met toluidine blauw in de vierde ronde (figuur 6D). De referentie-merkers werden afgebeeld tijdens elke beeldvorming rond, met inbegrip van de chromogene rond, en waren in lijn met de aangepaste software. Om een idee van de verwerkingscapaciteit voor deze procedure, 32 botten (16 dijbenen en 16 wervels) werden ingebed in 8 blokken, 3 secties werden van elk blok voorzien, werden de coupes verdeeld over 12 dia en de 12 objectglaasjes werden 4 keer afgebeeld het produceren van 96 samengestelde afbeelding stacks. De totale tijd om dit experiment uit te voeren was 8 dagen.
Figuur 1. Typische workflow voor het protocol. Algemeen stappen omvatten 1) weefsel fixatie, 2)-tape gestabiliseerd cryosectioning, 3) hechting van afgeplakte delen aan glas dia's, 4) de toepassing van referentiemarkeringen, 5) meerdere ronden van kleuring en 6) beeldvorming, en 7) image assemblage, aanpassing, en analyse. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. High-throughput Embedding en Tape gestabiliseerde cryosectioning. Vanwege de stabiliteit cryotape bepaalt meerdere botten worden naast elkaar (AB) ingebed en coupes tegelijkertijd (CD). Een stuk droog ijs wordt gebruikt tijdens deinbedding proces om de botten in plaats stevig vast te stellen voorafgaand aan het bevriezen van de gehele cryo-blok (B). De cryotape wordt op het blok (C), opgerold en de sectie blijft vast aan de tape tijdens het snijden (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De naleving van Vastgebonden afdelingen Glass Slides, Toepassing van Reference Markers, en Laden van Dia's in Lade van Slide-scanning microscoop. Getapete secties worden vastgelijmd aan het oppervlak van het glas dia's met ofwel UV-uithardende of chitosan lijm op basis van (A ). Na uitharden of drogen, maar een dunne, vlakke laag hechtmiddel blijft tussen de cryotape en glasoppervlakken (B). Referentie markers worden toegepast op droge dia's (C, pijl wijst naar dalen van microsferen oplossing). Dia's worden vervolgens gemonteerd in microscoop trays (D) en in de microscoop (E) geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vijf Rondes van beeldvorming van de achillespees van een twee weken oude muis. De samengestelde afbeelding stapel (A) is ontstaan uit vijf rondes van de beeldvorming. Ronde 1 (B): endogene COL1A1-GFPTpz, COL2A1-GVB, en Col10a1-mCherry transgenexpressie. Ronde 2 (C): collageen tweede harmonische generatie (SHG) op de twee foton microscoop. Round 3 (D): immunokleuring voor IHH. Round 4(E): AP enzymatische activiteit. Ronde 5: toluïdine blauw O (F). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Dyment et al., 2015 6. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Vier Rondes van Imaging van MCL enthese volgende gezamenlijke destabilisatie. Knieën werden gedestabiliseerd in drie maanden oude muizen, wat leidt tot een verhoogde mineralisatie van het MCL enthese. Een demeclocycline minerale label werd de dag van de operatie en een calceïne minerale label gegeven was de dag voor het offer gegeven. Ronde 1 (A): endogene COL1A1-GVB, Col10a1-mCherry transgenexpressie met demeclocycline en calceïne minerale labels. Ronde 2 (B) </ Strong>: TRAP-enzymatische activiteit. Round 3 (C): AP enzymatische activiteit. Round 4 (D): toluïdineblauw O. De TRAP en AP signaal werd gelegd op de top van de tbc-signaal in panelen voor Christus. De gele kanaal kan opnieuw worden gebruikt voor TRAP omdat de TRAP buffer ontkalkt het weefsel, het verwijderen demeclocycline label. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Dyment et al., 2015 11. Schaal bar = 200 micrometer. Dem: demeclocycline, TRAP: tartraat resistent zuur fosfatase, AP: alkalische fosfatase, MCL: mediale collaterale ligament. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vier Rondes van Imaging binnen distale dijbeen bevattende Microsphere Reference Markers. Drie maanden oude mice kregen calceïne en alizarine complexone minerale labels Ronde 1 (AA '). endogene calceïne en alizarain complexone labels in aanvulling op de blauwe kleuring van geaccumuleerde minerale calceïne Ronde 2 (BB.'): TRAP enzymatische activiteit Round 3 (CC '). :. AP enzymatische activiteit Round 4 (DD): toluïdineblauw O. de groene microsferen werden afgebeeld tijdens elke ronde (A'-D ', pijl geeft dezelfde microsferen in alle afbeeldingen). Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| chitosan lijm | UV-uithardende lijm | |
| lijm mechanisme | Verdamping | UVpolymerisatie |
| uithardingstijd | > 24 hr | <20 min |
| Kan secties worden verwijderd nadat lijm hardt? | Ja | Nee |
| Is genezen lijm oplosbaar? | Ja, in zure oplossingen met een lage pH | Nee |
| Heeft lijm bestand tegen hitte antigen retrieval? | Nee | Ja |
| Klevend automatische fluorescente? | Nee | Minimal in UV-gebied |
Tabel 1. Vergelijking tussen chitosan Lijm en UV-uithardende lijm
| Cryotape | Tape-Transfer System | |
| Mogelijk om deel gemineraliseerd bot met behulp van dit systeem? | Ja | Ja, maar stukken van gemineraliseerd botniet volledig overdragen aan de dia |
| Mogelijk om deel gemineraliseerde voegen met behulp van dit systeem? | Ja | Ja |
| Mogelijk om deel hersenen met behulp van dit systeem? | Ja, maar het weefsel kan vallen off van tape na meerdere rondes van imaging | Ja |
| Mogelijk om meerdere monsters ingebed in hetzelfde blok te snijden? | Ja | Ja |
| Mogelijk om meerdere rondes van beeldvorming uit te voeren op dezelfde afdeling? | Ja | Ja |
Tabel 2. Vergelijking tussen Cryotape System en Tape-transfersysteem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we presenteerde een gedetailleerd cryohistology protocol om samen te lokaliseren en te kwantificeren diverse biologische maatregelen door het gelijktrekken van beelden van meerdere rondes van vlekken / beeldvorming op een enkele sectie. De werkwijze beschreven met behulp van de cryotape is vooral handig als het de morfologie van moeilijk te vinden in hoofdstuk weefsel (bijv gemineraliseerd bot en kraakbeen) onderhoudt. Bovendien wordt het doorgesneden weefsel stevig gehecht op het glaasje, waardoor meerdere ronden van kleuring / beeldvorming van dezelfde sectie; in tegenstelling tot traditionele werkwijzen waarbij seriële secties elk zijn gekleurd met een ander protocol. Middels seriële secties kan een probleem vormen bij een poging om samen lokaliseren signalen tussen de secties, iets dat geen probleem met enkele secties die zijn gekleurd en afgebeeld met meerdere ronden.
De eerste-tape gestabiliseerd weefsel snijden product op de markt was een tape transfersysteem 16, 17. Het maakt gebruik van plastic tape gecoatmet een lage temperatuur lijm die wordt aangebracht op het oppervlak van het weefsel cryoblock. Wanneer de cryostaat mes snijdt onder de tape, wordt het gedeelte intact en aanhanger van de tape verwijderd. Vervolgens wordt de tape wordt geplaatst monster naar beneden op dia's die zijn gecoat met UV-uithardende lijm, zodanig dat het weefsel stevig wordt bevestigd aan de dia. Zodra de tape uit de buurt van de sectie wordt gepeld, kan de dia worden verwerkt voor ofwel fluorescentie of chromogene histologie. De achtergrondfluorescentie van de lijm is, en meerdere rondes van kleuring en beeldvorming werkt goed met de meeste zachte weefsels. Maar met gemineraliseerd secties, kan verlies van minerale fragmenten het overgieten van het weefsel van de plakband op de glasplaatjes. Bovendien is een relatief duur systeem te installeren in de cryostaat (> $ 8000) en verbruiksartikelen kosten hoog (> 2 $ / slide).
Een andere strategie tape stabilisatie ontwikkeld door Dr. Tadafumi Kawamoto maakt gebruik van eenkleefstof beklede polyvinylideenchloride film de weefselsectie vangen. In hun protocol, wordt een vers ingevroren weefsel coupes op de band en in PFA of ethanol 18 direct gerepareerd. Vervolgens wordt de band bevlekt en vervolgens aangebracht op een glasplaatje met het monster naar beneden voor microscopisch onderzoek. Dus elk kleuringsprotocol wordt uitgevoerd op een ander gedeelte geplakt.
Wij hebben gewijzigd en toegevoegd aan de Kawamoto protocol in een aantal manieren, waaronder voorafgaande vaststelling van het monster in formaline voor het inbedden. Deze stap is essentieel voor de oplosbare cytoplasmatische GFP transgene dieren binnen de grenzen van de cel vast. We hebben de cryotape voor een breed scala aan soorten weefsel 5-13 benut. Laboratorium personeel met een beperkte histologische ervaring kan een hoge-kwaliteit onderdelen te produceren met deze methode. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn de relatief lage kosten (geen speciale instrumenten, <$ 1,00 per slide), geen verlies van minerale fragmenten,en de mogelijkheid om meerdere rondes van kleuring en beeldvorming uitgevoerd op dezelfde sectie.
Omdat afbeelden dezelfde gebieden van een dia meerdere keren herhalen onredelijk dat een groot aantal dia zelfs met een gemotoriseerde fase zou zijn, een cruciale stap van dit protocol is het gebruik van een slide-scanning microscoop consistentie en doorvoer te verhogen. De microscoop is een digitale dia scanner die opereert onder zowel epifluorescentie en uitgezonden licht. Het is uitgerust met een 10-positie gemotoriseerde turret en zowel B & W en kleurencamera's. De echte nieuwheid van het systeem, in onze handen, dat specifieke gebieden van belang snel en eenvoudig kan worden gedefinieerd door de gebruiker of automatisch door de beeldverwerkingssoftware. Deze regio's van belang kunnen vervolgens worden opgeslagen vanaf de eerste ronde van beeldvorming en vervolgens snel geladen tijdens de volgende ronden. Daarom tot dezelfde gebieden van belang worden afgebeeld gedurende elke ronde van beeldvorming. Op basis van de door de gebruikergedefinieerde parameters in de software, zal de microscoop autofocus en scannen betegelde beelden die zijn gestikt tijdens acquisitie binnen de regio's van belang.
De volgorde waarmee de gebruiker de meerdere ronden van kleuring uitvoert belangrijk. De algemene volgorde is weergegeven in figuur 1. Het aantal fluoroforen die voldoende via fluorescentiemicroscopie te scheiden is de belangrijkste beperkende factor voor het aantal tegenmaatregelen die op een bepaald punt kan worden verkregen. Echter kunnen fluorescerende kanalen worden hergebruikt in bepaalde gevallen. Bijvoorbeeld, calceïne blauw en demeclocycline beide geven een sterk signaal in de gele kanaal gebruikt om de TRAP activiteit te meten. Dit doorbloeding wordt vermeden al omdat de TRAP-buffer ontkalkt de sectie, waardoor het mineraal voorafgaand aan de TRAP activiteit beeldvorming verwijderen. Daarnaast zal DAPI tegenkleuring emitteren in het gele kanaal ook. Toch kan de gebruiker DAPI vervangen door een ander tegenkleuring in the rood of ver-rode gebied. Bovendien kunnen antilichamen worden gestript en opnieuw gekleurd met verschillende antilichamen met dezelfde fluorescerende kanalen. Derhalve is deze werkwijze zeer aanpasbaar aan verhoging van het aantal tegenmaatregelen die kunnen worden opgenomen op een bepaald gedeelte.
Er zijn bepaalde beperkingen de gepresenteerde protocol. 1) De cryotape mogelijk onvoldoende aan bepaalde weefsels. Bijvoorbeeld, met formaline gefixeerde hersenen secties hebben de neiging de tape af te vallen na meerdere rondes van vlekken. Voor weefsels zoals deze, kan de band overdrachtsysteem geschikter als het weefsel is gehecht aan het glasoppervlak via UV geactiveerde lijm (zie Tabel 2 voor vergelijking van beide methoden). 2) De chitosan lijm, terwijl het verstrekken van transparante optische eigenschappen, zal niet overleven harde processtappen die hoge temperaturen of sterke zuren bevatten. Daarom is de UV-activeerbare kleefstof is geschikt voor deze toepassingen (zie Tabel 1 fen vergelijking van deze twee hechtmiddelen).
De cryohistological protocollen hier gepresenteerde lenen zich ook tot een hogere doorvoersnelheid en automatisering. Bijvoorbeeld, de band stabilisatie door de cryotape maakt relatief onervaren gebruikers meerdere botten en gewrichten tegelijkertijd snijden in hetzelfde blok aanzienlijk volume op te voeren. Toepassing van een geautomatiseerde scanner vermindert technicus tijd en kosten in verband met beeldvorming, die typisch de snelheidsbeperkende stap in onze ervaring is. In staat om consistent en betrouwbaar beeld hetzelfde gebied van belang meerdere keren in een korte tijd een platform voor geautomatiseerde, objectieve analyse van weefsels. In feite is de groep een platform-computer automatische uitlijning en histomorfometrie been ontwikkeld. Ten eerste, de software brengt de meerdere ronden van afbeeldingen op basis van de fluorescerende referentiemarkeringen. Vervolgens worden de uitgelijnde beelden toegevoerd aan een histomorfometrie pijpleiding waar de computer software definieert het gebied van belang en objectief meet diverse statische en dynamische metingen (zie meer op www.bonebase.org) 13. Dit platform werd mogelijk gemaakt door de verhoogde doorvoersnelheid en consistentie door de cryotape snijden, digitale slide-scanning microscoop en aangepaste analyse software. Dit protocol is een belangrijke vooruitgang in high throughput cryohistology en gebruik deze beeldvorming moeilijk punt weefsels moet zoals bot evenals die onervaren met weefsel snijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
| 2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
| Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
| Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
| InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
| Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
| Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
| ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
| TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
| Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
| sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
| Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
| Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
| N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
| Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
| DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
| CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |
References
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
- Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
- Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
- Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
- Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
- Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
- Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
- Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
- Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
- Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
- Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
