Abstract
Malgré la capacité de régénération du muscle squelettique, des déficits fonctionnels et / ou cosmétiques permanents (par exemple, la perte musculaire volumétrique (VML) résultant d' un traumatisme, d'une maladie et diverses affections congénitales, génétiques et acquises sont assez communs. L' ingénierie tissulaire et les technologies de médecine régénératrice ont un énorme potentiel pour fournir une solution thérapeutique. Cependant, l'utilisation de modèles animaux biologiquement pertinents en combinaison avec des évaluations longitudinales des mesures fonctionnelles pertinentes sont essentielles pour le développement de l'amélioration des thérapies régénératrices pour le traitement des blessures VML semblables. à cet égard, un système de levier musculaire commercial peut être utilisé pour mesurer la longueur, la tension, la force et les paramètres de vitesse dans le muscle squelettique. Nous avons utilisé ce système, en conjonction avec une puissance élevée, bi-phase de stimulateur, pour mesurer in vivo la production de force en réponse à l' activation du compartiment crural de le hindlimb de rat. Nous avons PREVIdemment utilisé cet équipement pour évaluer l'impact fonctionnel de blessure VML sur le muscle tibial antérieur (TA), ainsi que l'ampleur de la récupération fonctionnelle après traitement du muscle TA blessé avec notre ingénierie tissulaire réparation musculaire (TEMR) technologie. Pour ces études, le pied gauche d'un rat anesthésié est solidement ancré à un footplate relié à un servomoteur, et le nerf fibulaire commun est stimulée par deux électrodes aiguilles percutanées pour provoquer la contraction musculaire et la flexion dorsale du pied. Le nerf sciatique poplité externe induite par la stimulation-contraction musculaire est mesurée sur une gamme de fréquences de stimulation (1-200 Hz), pour assurer un plateau à terme dans la production de force qui permet une détermination précise de la force tétanique pointe. En plus de l'évaluation de l'ampleur du préjudice VML ainsi que le degré de récupération fonctionnelle après un traitement, cette méthode peut être facilement appliquée à l'étude des divers aspects de la physiologie musculaire et la physiopathologie. Une telle approche shoULD aider au développement plus rationnel des traitements améliorés pour la réparation musculaire et la régénération.
Introduction
Le muscle squelettique a une capacité intrinsèque remarquable pour la réparation en réponse à une blessure ou d'une maladie 1,2. Expérimentalement, la robustesse de cette réaction de régénération a été bien documentée dans des modèles animaux en étudiant, par exemple, au cours du temps des dommages des muscles squelettiques, la réparation et la régénération après l' application de myotoxins (par exemple cardiotoxine) 3-7. Plus précisément, à la suite des dommages musculaires induits par cardiotoxine (38-67% des fibres musculaires 8), la régénération est médiée par les cellules satellites, les cellules souches résidentes qui mûrir pour devenir finalement des fibres musculaires fonctionnelles 4,9-13. Le résultat final est augmenté post-dommages régénération fonctionnelle de la santé, le tissu musculaire de force produisant 14-16. Bien que les détails sont bien au-delà de la portée de ce rapport, le mécanisme de base pour la régénération musculaire reflète les événements soigneusement orchestrées de nombreux types de cellules provenant de plusieurs lignées utilisant canonical signalisation des voies critiques à la fois le développement des tissus et de la morphogenèse 5,17-21. Surtout, la régénération induite myotoxine-est activée par le fait que la matrice extracellulaire, innervation neuronale et des vaisseaux sanguins perfusion restent structurellement intacte suivante induite cardiotoxine-lésion musculaire 3,8,22. À l'opposé, ces structures et composants des tissus clés sont, par définition, totalement absente dans le contexte de blessure VML; où la perte franche de tissu, en raison d'une variété de causes, se traduit par des déficits fonctionnels et esthétiques permanents 23-25.
Indépendamment des défis supplémentaires associés à la réparation musculaire et la régénération suite à une blessure VML en comparaison avec les dommages musculaires induits par myotoxine, une meilleure compréhension de la base mécanistique de régénération du muscle squelettique et la réparation, dans une variété de contextes, seraient bien servis par l'utilisation des biologiquement des modèles animaux pertinents en combinaison avec une direction longitudinalessessments de mesures fonctionnelles pertinentes. Comme décrit ici, les études de la patte arrière du rat constituent un excellent système modèle à cette fin. Plus précisément, les muscles de la loge crural (jambier antérieur, extensor digitorum longus (EDL) et hallicus longus (HL)), qui sont responsables de dorsiflexion du pied, sont facilement identifiés et manipulés. De plus, ils sont servis par les principaux vaisseaux sanguins (iliaques et branches), et sont innervés par les nerfs (sciatique et branches, y compris péronier) sur toute la longueur de la jambe 26-28. En tant que tel, on peut utiliser le modèle de hindlimb de rat pour évaluer directement le muscle squelettique fonction / pathologie in vivo, ou pour évaluer l'impact plus indirect des altérations liées à la pathologie dans les vaisseaux sanguins ou les nerfs sur la fonction musculaire squelettique correspondante. Dans les deux cas, la sévérité de la maladie, ainsi que l'efficacité du traitement peut être déterminée en fonction de la production de force musculaire (couple) et le pied correspondant mOUVEMENT 29-34.
Idéalement, les mesures de force sont accompagnées par des études histologiques et des analyses d'expression génique pour évaluer plus rigoureusement l'état structurel et moléculaire du muscle squelettique. histologie de base et immunohistochimie, par exemple, sont en mesure de répondre à des questions au sujet de la taille du muscle, l'alignement de la fibre musculaire, la composition de la matrice extracellulaire, l'emplacement des noyaux, le nombre de cellules, et la localisation des protéines. Analyse de l'expression génique, à son tour, est nécessaire pour identifier les mécanismes moléculaires qui peuvent influencer / moduler la maturité des fibres musculaires, des états pathologiques, et l'activité métabolique. Bien que ces méthodes fournissent des informations cruciales, ils représentent généralement extrémités terminales, et surtout, ils ne parviennent pas à traiter directement la capacité fonctionnelle du muscle squelettique, et donc, sont corrélatives plutôt que causal. Cependant, lorsque des études histologiques et des analyses d'expression génique sont évalués conjointement avec mesur fonctionnellees, alors, les mécanismes de production de la force et la régénération fonctionnelle peuvent être identifiés plus précisément.
À cet égard, la force de produire des capacités d'un muscle peut être mesurée in vitro, in situ ou in vivo. Les trois approches présentent des avantages et des limites. Dans une expérience in vitro, par exemple, le muscle est complètement isolé et retiré du corps de l'animal. En supprimant les influences des vaisseaux sanguins et les nerfs qui innervent le muscle, la capacité contractile du tissu peut être déterminée dans un environnement extérieur étroitement contrôlé 35. Dans l' essai de muscle in situ permet au muscle à isoler, comme des préparations in vitro, cependant , l'innervation et de l'approvisionnement en sang restent intacts. L'avantage du modèle expérimental in situ est qu'il permet un muscle individuel à étudier pendant l'innervation et de l' approvisionnement en sang est peu perturbé 36. À la foisin vitro et dans des expériences in situ, les traitements pharmacologiques peuvent être appliqués plus directement , sans avoir à tenir compte des effets de tous les tissus environnants ou l'impact du système circulatoire sur les réponses contractiles mesurées 37. Cependant, dans les tests de la fonction in vivo, tel que décrit ici, est la technique la moins invasive pour l' évaluation de la fonction musculaire dans son environnement natif 38, et peut être effectuée à plusieurs reprises au fil du temps ( par exemple, longitudinalement). En tant que tel, il sera le point focal de la discussion ci-dessous.
À cet égard, les électrodes percutanées insérées près du muscle d'intérêt, ou le nerf moteur qui sert, fournissent un signal électrique au muscle. Un capteur mesure alors la longueur ou la force des changements qui en résultent dans le muscle activé selon les instructions, un protocole de logiciel personnalisé prédéterminé. A partir de ces données, les propriétés physiques du muscle peuvent être déterminées. Ceux-ci comprennent,ce-fréquence, le tétanos maximale, force-vitesse, la raideur, la tension de la longueur, et la fatigue. la longueur du muscle ou de force peuvent également être maintenues constantes de sorte que les contrats musculaires isométrique ou isotonique. Fait important, ces protocoles expérimentaux peuvent être réalisés rapidement, facilement répétés et tous customized- alors que l'animal est anesthésié, et avec une période de récupération d'heures à quelques jours. Un seul animal peut subir en vigueur in vivo testant plusieurs fois, permettant ainsi des études longitudinales sur les modèles ou l' évaluation des thérapeutiques plates - formes / technologies maladie.
Comme décrit ici, un système de levier musculaire commercial en association avec une puissance élevée, biphase stimulateur est utilisé pour effectuer des tests de la fonction musculaire in vivo pour évaluer la contribution du muscle tibial antérieur de la patte postérieure du rat à la flexion dorsale du pied par stimulation de le nerf sciatique poplité externe. Nous avons mis au point un protocole qui est spécifiquement conçu pour évaluer la médecine régénérative / titechnologies d'ingénierie SSUE pour la réparation musculaire après une lésion traumatique VML du rat TA musculaire. Ça devrait être noté; l'EDL et HL doivent être disséqués hors du compartiment crural afin d'évaluer précisément le muscle TA (ils représentent environ 15-20% du couple total tibial antérieur mesurée après stimulation du nerf sciatique poplité externe (Corona et al., 2013) ). Parce que cette approche fournit une analyse longitudinale globale du muscle physiologie / fonction, il peut jeter une approche mécanistique importante sur de nombreux autres types d'enquêtes physiologiques ainsi que d' une variété de maladies ou domaines thérapeutiques 39. Par exemple, dans les tests de la fonction musculaire in vivo est applicable à des études de physiologie de l' exercice, l' ischémie / la recherche de reperfusion, la myopathie, des lésions nerveuses / neuropathie et vasculopathie, sarcopénie et dystrophies musculaires 40.
Protocol
Tous les animaux ont été traités avec humanité et tous les protocoles ont été approuvés par l'Université de Virginie IACUC.
1. Équipement Préparation
- Veiller à ce que toutes les machines sont correctement connectés.
- Allumer l'ordinateur, puis le stimulateur de forte puissance à deux phases et un système de levier à double mode.
- A ce moment, placer l'animal dans la chambre d'anesthésie fourni avec 2% d'isoflurane, et tourner sur l'élément chauffant de telle sorte que la plate-forme est chauffée à 37 ° C.
- Placer les électrodes dans 70% d'éthanol afin que le polytétrafluoroéthylène (PTFE) revêtu des conseils sont submergés et seront désinfectés lors de la configuration de l'appareil et le logiciel.
- Localisez et ouvrez le logiciel de contrôle du système de levier sur le bureau.
NOTE: Ce sera le logiciel nécessaire pour effectuer des tests fonctionnels.
Setup 2. Software
- Une fois que le programme est ouvert (figure 1A), modifier le paramètres pour Instant Stim dans le menu de configuration pour les valeurs souhaitées.
NOTE: Dans ce protocole, tous les paramètres restent aux niveaux préréglés à l'exception de "Run Time (s)", qui est changé à 180 sec (figure 1B). - Créez un dossier Autosave dans le menu de configuration.
- Recherchez une fenêtre de type mesure étiqueté "Autosave Base". Entrez le nom de l'échantillon, par exemple "Rat1 jour-timepoint". Directement à la gauche de la fenêtre de type-mesure "Autosave Base", cliquez sur la case "Activer Autosave."
- En haut de l'écran de configuration, sélectionnez "Sequencer". Une nouvelle fenêtre s'ouvrira. Sur le fond de la nouvelle fenêtre, sélectionnez "Open Séquence". Une nouvelle fenêtre s'ouvrira. Sélectionnez la séquence premade et cliquez sur OK. Une liste de protocole avec des paramètres de séquence , y compris la fréquence, la durée des stimuli, et le temps de repos se développera dans la fenêtre nommée: Editeur de séquence (figure 1C). Cliquez sur "Charger séquence" -> & #34; Fermer la fenêtre ".
- Pour voir en cours en temps réel et de stimulation, sélectionnez "Fichier" -> "Data Monitor Live". Une nouvelle fenêtre s'ouvrira.
- Dans la nouvelle fenêtre de données en direct, écran de format pour les tests en utilisant la fonction de redimensionnement automatique, ou entrer manuellement l'y-valeurs maximales et minimales affichées sur l'écran.
3. Animal Set-up
NOTE: Toutes les mesures de force sont celles d'un enfant de 11 semaines vieux rat Lewis. Il existe une corrélation linéaire entre la masse musculaire et la production de force (en Newtons). Par conséquent, comme l'âge des rats augmente, les valeurs de la force produite par la jambe devraient augmenter.
- Faire en sorte que l'animal se trouve dans le plan de l'anesthésie appropriée avant de le retirer de la chambre d'anesthésie. Enlever complètement tous les cheveux sur le côté latéral entre la cheville et le bassin de la jambe expérimentale utilisant une tondeuse à cheveux électrique.
NOTE: Le bon plan de l'anesthésie est obtenue lorsque la i animales non sensible à un pincement de l'orteil. Il est nécessaire de suivre les directives mises de l'avant par le Comité de soins et de l'utilisation des animaux de chaque institution. - Placez l'animal dans la position couchée, assurant le nez de l'animal est solidement dans le cône de nez anesthésie de sorte qu'il reste à la profondeur suffisante de l'anesthésie.
- Régler la position de l'appareil de la pédale par trois boutons indépendants (figure 2). En utilisant les boutons (A et B) pour régler la pédale de commande, placer le dispositif de pédale dans sa position extrême gauche et le plus bas, respectivement. Cela va permettre le positionnement correct du pied de l'animal tout en laissant de la place pour les manipulations ultérieures. A cette position, utilisez le bouton sur la gauche de la piste pour déplacer l'appareil soit vers ou plus loin de l'expérimentateur de telle sorte que la jambe de l'animal se trouve dans un plan rectiligne.
- Nettoyer la jambe avec trois changements de l'iode et l'alcool. L'iode doit rester sur la jambe pendant 30 secondes.
- Ajustez l'animal ou la plate-forme(Figure 2A, D) de sorte que la jambe étendue assure un contact complet entre la plante du pied et la pédale.
- En utilisant du ruban adhésif médical, fixer le pied de l'animal contre la plaque de pied (figure 2D). Il est crucial que le talon est à fleur contre le fond de la pédale et l'ensemble du pied est à plat et ne sera pas déloger de la plaque pendant l'essai.
- Localiser le mécanisme de serrage pour stabiliser la jambe. Pousser la goupille de stabilisation assez loin pour réduire le mouvement de la jambe et le verrouiller en place en tournant la clé Allen.
- A cette position, utilisez le bouton C pour déplacer l'appareil soit vers ou loin de l'expérimentateur de telle sorte que la cheville, du tibia et du fémur se trouvent dans une ligne droite (figure 2C). Faire en sorte que la jambe est parallèle à la pédale. Faire des ajustements sur le parcours et les boutons fines trouvés sur le dos de l'appareil, de se déplacer lentement la cheville de sorte que le pied et le tibia sont à une position de 90 °.
- continue pour déplacer la jambe de sorte que le fémur et le tibia sont à un angle de 90 degrés perpendiculaire (figure 2B). A ce stade, l'animal est prêt à recevoir les électrodes.
4. Placement des électrodes
- Activer "instantanée Stim" en cliquant sur le bouton orange marqué "instantanée Stim".
- Placez les deux électrodes en surface sur l'extrémité proximale du jambier antérieur et déplacer les pointes des électrodes autour jusqu'à ce que les pointes sont visibles sur l'écran en direct. Idéalement, les pointes doivent être environ 0,4 N.
Remarque: les électrodes doivent être placées à côté et perpendiculaire au plan du nerf péronier, ce qui, à son tour, dirige latéralement par rapport au genou et perpendiculairement au tibia. - Insérez une aiguille assez loin pour derme percer, et à peine dans la couche musculaire. Déplacez l'autre électrode autour jusqu'à ce que les pointes sont visibles sur le moniteur en direct autour de 0,6 aiguilles N. Insérer et serrer les en place à l'aide d'une pince de passe-temps ou du ruban adhésif médical.
- UNEÉGLEZ ajustements grossiers et fins pour trouver la sortie de force maximale.
- Sur la haute puissance biphase stimulateur, il y aura deux boutons dans le centre. On est étiqueté "RANGE" et l'autre "ADJUST". Tournez la "RANGE" bouton pour ampérage maximal souhaité.
NOTE: Les pics augmenteront lentement dans l'ampleur et l'intensité maximale est déterminée comme le niveau auquel trois stimulations consécutives entraînent des réponses contractiles identiques. Résistez tourner l'ampérage plus élevé que nécessaire; l'intensité maximale stimulera l'ensemble du muscle à se contracter, mais aucun courant plus élevé se traduira par le recrutement des muscles voisins et antagonistes potentiellement aussi bien. - Tournez le bouton "ADJUST" pour régler le pourcentage de la "RANGE" qui sera utilisé pour stimuler le muscle. À ce stade, la force devrait lire environ 1,0 N. Cela peut nécessiter une augmentation ou une diminution du courant.
- Vérifier les électrodes pour vous assurer qu'ils sont en sécurité. ArrêtezImmédiat Stim.
- Dans la fenêtre "Live Data", cliquez sur "Démarrer la séquence."
- Continuer à surveiller les courbes en retournant à l'écran de contrôle, et en cliquant sur le bouton "Analyse" situé au-dessus du bouton orange "instantanée Stim". La courbe tétanique devrait commencer à prendre forme autour de la stimulation de 60 Hz.
5. Finition Stimulation et Clean Up
- Après la séquence est terminée, retirez les électrodes et essuyez avec 70% d'alcool. Placer les électrodes dans les couvercles.
- Détachez la pince du genou et de désactiver l'anesthésie. Retirer l'animal à partir du gaz d'anesthésie et de placer l'animal dans la position couchée, toujours sur le coussin chauffant. Maintenir le rat sur 100% O 2 pendant quelques minutes après que le gaz isoflurane a été éteinte pour garder le rat oxygéné. L'animal peut se déplacer d'abord, mais ne pas retourner le dos de l'animal à la cage avant que l'animal ne reprenne conscience. Si la douleur musculaire est remarquélors de la récupération, une dose d'AINS doit être donnée comme spécifié par votre comité de protection des animaux.
- Éteignez tous les équipements énumérés à l'étape 1.2, fermez le logiciel, et de continuer à l'analyse des données.
- Essuyez la pédale de plate-forme et le pied.
Analyse 6. Données
NOTE: L'analyse des données est effectuée en fonction d'une séquence conçue par ce laboratoire et selon les protocoles de laboratoire. Les valeurs d'analyse, points de données d'importance, et d'autres aspects de la procédure change en fonction de l'intention de l'utilisateur.
- Ouvrir le logiciel d'analyse des données.
- Cliquez sur le menu à haut débit pour permettre une analyse de plusieurs fichiers de données (échantillons) à la fois. Sélectionnez "Force Fréquence" Analyse.
- Cliquez sur le bouton "Pick Files" et ouvrir autant de fichiers de données enregistré en tant désiré.
- Sélectionnez "Manuel" dans la boîte de curseur Méthode de placement.
NOTE: Cela permettra à l'utilisateur d'analyser tous les datun dans un horodatage souhaité, par opposition au programme sélectionne automatiquement l'emplacement d'analyse. - Modifiez la valeur d'horodatage Fin Curseur à 2. Cliquez sur le bouton "Analyser" (figure 1D).
- Pour enregistrer la table et d'analyser les données en utilisant une feuille de calcul, cliquez sur "Enregistrer la table bouton pour ACSII. Cela permettra d'économiser le fichier, et il peut être ouvert avec une feuille de calcul à une date ultérieure.
- Ouvrez le fichier de données enregistré dans une feuille de calcul.
- Créer une colonne supplémentaire intitulée «maximum absolu», et déterminer la différence entre la ligne de base et les valeurs maximales pour chaque échantillon. Cela fournira la force maximale totale produite à chaque fréquence.
- Pour déterminer le couple, il faut multiplier chaque valeur de la force par la longueur du bras de levier.
REMARQUE: Dans ce cas, ce serait représentée par la longueur du pied de l'animal. Ce protocole utilise la valeur moyenne déterminée expérimentalement de 30 mm. L'utilisateur a maintenant déterminé les valeurs de la macouple ximum produit à chaque fréquence. - Représenter graphiquement ces valeurs en tant que courbe de fréquence de couple, ou le couple maximal produit par l'animal pour toutes les fréquences de stimulation.
NOTE: Cela peut être identifié et utilisé comme point de comparaison entre les échantillons unique.
Representative Results
La courbe tétanique peut être utilisée pour distinguer des résultats optimaux à partir des résultats sous-optimaux. Cette courbe commence généralement à se former à une fréquence de 60 Hz. Le facteur clé pour obtenir de bons résultats est la capacité à stimuler le muscle afin qu'il produise sa force maximale et maintient cette force pendant le tétanos. La courbe idéale devrait avoir une forte, reprise ininterrompue, vertical au moment de la stimulation, suivie d'une phase de plateau plat avec des oscillations minimes, et une forte période ininterrompue, vertical de diminution à la fin de la stimulation (figure 4). Déviations de la courbe idéale des indications que le muscle est fatigué (Figure 5D) ou que le muscle est pas correctement stimulé pour produire une force maximale (figure 5B - C). Celle-ci résulte généralement de positionnement des électrodes incorrect conduisant à une défaillance du recrutement maximale des fibres musculaires pendant stimulation. Une caractéristique qui permet au chercheur de déterminer si une courbe non-idéal est le résultat de placement des électrodes incorrect ou des changements pathologiques au muscle est si oui ou non la courbe tétanique est complète (fondue) ou incomplète (unfused). Une courbe tétanique unfused, incomplète indique que les électrodes sont déplacées, ce qui entraîne dans le muscle ne connaît une contraction maximale. Un exemple d'un changement pathologique dans le muscle peut être observé qu'une diminution de la contraction maximale par rapport à la commande ou la réponse contractile qui fatigue plus rapide.
Les trois types de pics obtenus au cours de cette procédure différentes représentent différentes positions d'électrodes et de la jambe et peut être vu dans la figure 3. Les premiers sommets seront de l' ordre 0,4N et se produire lorsque le placement correct des électrodes est déterminée superficiellement sur la peau (Figure 3A). La deuxième série de pics a hENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR amplitude, généralement autour 0.5-0.6N (figure 3B) et se produisent lorsque les électrodes percent à travers le derme. Après ceux - ci sont obtenus, la jambe et le pied sont ajustées pour maximiser la production de la force, qui est atteint lorsque l'amplitude crête augmente à environ 1N ou plus (figure 3C). À ce stade, instantanée Stim peut être désactivée et la séquence peut commencer. Ces lignes directrices assurent des résultats précis et reproductibles et sont des points de contrôle clés à travers le protocole.
Les résultats finaux peuvent être représentés de différentes manières en fonction des informations que l'utilisateur extrait du test de la force et la conception expérimentale. Dans ce protocole, la force maximale est mesurée sur l'ensemble des fréquences de stimulation, mais d'autres points de données peuvent être importantes pour un chercheur ou à une application particulière. Un exemple est la fréquence de stimulation à laquelle la courbe tétanique commence à prendre forme. Til les données peuvent être comparées à d'autres résultats obtenus à partir d'une expérience précédente ou ultérieure sur le même animal, ou des comparaisons entre les différents groupes de traitement. la production de la force peut être normalisée par la masse corporelle pour calculer la force isométrique et fournir une évaluation plus objective de l'impact de l'âge sur la contraction maximale observée. Bien que les animaux de différents poids corporel et de l'âge vont produire différentes forces maximales, la forme de la courbe tétanique doit être cohérente entre tous les groupes lorsque la procédure est effectuée correctement.
Figure 1: Vue d'ensemble du contrôle du système de levier et logiciel d' analyse de données pour l' analyse (A) Vue d'ensemble du logiciel de contrôle lors de l' ouverture du programme.. (B) Paramètres pour "Stim instantanée." (C) séquence Exemple pour la stimulation de force fréquence. (D S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Aspects critiques pour le positionnement du Rat et le placement du pied dans l'appareil (A) Le rat est en position couchée avec le pied gauche solidement fixé à la semelle.. Les bons angles faits par le pied, la jambe et la cuisse sont encerclés. (B) L'angle droit créé par la cheville est mise en évidence. (C) La jambe doit être aligné dans un plan rectiligne du pied au corps. (D) Le placement des électrodes est parallèle et perpendiculaire au plan du nerf sciatique poplité externe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Peaks représentatifs Démontrer l'importance de la correcte Placement des électrodes à la production maximale de travail (A) pointe des réponses tétaniques de base observés avec des électrodes placées trop superficiellement.. (B) plus grands pics avec des électrodes insérées dans le bon endroit. (C) la transition des plus grands pics de signalisation placement correct des électrodes à optimale pré-séquence pic d' amplitude que les positions des jambes et des pieds sont ajustée de façon optimale./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Curve Tetanic optimale à 100 Hz Cette courbe augmente et diminue fortement et a une phase de plateau plat. Cet exemple indique le placement correct des électrodes et la stimulation de la force maximale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Exemples représentatifs de courbes tétaniques sous-optimaux obtenus à 100 Hz (A) Après la détente, cette courbe plonge en dessous de la ligne de base. Ceci indique une stimulationdes antagonistes. (B - D) Ces graphiques sont le résultat de placement des électrodes inappropriée et inégale recrutement des fibres musculaires. Les phases de plateau montrent de grandes oscillations (B), une pente ascendante (C), ou une pente descendante (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Ce protocole démontre une méthode relativement simple pour effectuer des tests de la fonction musculaire in vivo sur le compartiment crural antérieur de la patte arrière de rat. D' autres formes de tests de la fonction musculaire, y compris ex vivo et dans les protocoles in situ, peuvent également fournir des informations importantes sur la physiologie musculaire. Cependant, l'importance de l' essai in vivo de la fonction réside dans son caractère non invasif, et le fait qu'il récapitule plus précisément les mécanismes endogènes de stimulation musculaire. Pour les deux ex vivo et des essais in situ, le tendon et / ou musculaires en sont exposés, et par conséquent, doit être maintenu humide ou immergé 41,42. Des tests in vivo supprime les variables confondantes de traumatismes et de l' inflammation qui peuvent être causés par les interventions chirurgicales nécessaires dans les tests de la fonction musculaire in situ; ceci est particulièrement important si l'objectif de l'expérience est d'étudier les processus inflammatoires et cellulaires
Il y a plusieurs étapes essentielles qui doivent être effectuées avec soin afin de garantir des résultats expérimentaux optimaux et reproductibles, qui est, la production de force maximale cohérente par le muscle à une variété de paramètres de stimulation. Plusieurs des principales caractéristiques sont décrites dans la figure 2. Toutefois, le placement et la stabilité de l'électrode de stimulation appropriée est une condition sine qua non pour une stimulation maximale reproductible du nerf sciatique poplité externe. A cet égard, les électrodes doivent être placées superficiellement. Autrement dit, si le placement des électrodes est trop profond, on risque une stimulation électrique directe des muscles antagonistes, ce qui diminue l'amplitude de la réponse contractile observée du compartiment crural. En outre, ladeux électrodes doivent être placées dans le plus proche de l'autre que possible pour réduire la résistance électrique de la peau et du tissu conjonctif environnant. D'une manière générale, le positionnement de l'électrode à proximité du genou et médial de la jambe traçant directement le bord du jambier antérieur à l'endroit où elle rencontre le gastrocnémien donne souvent la production d'une force adéquate. Cela garantit également que les électrodes sont placées adjacentes et perpendiculaire au plan du nerf sciatique poplité externe, ce qui, à son tour, est perpendiculaire au tibia et latéralement vers le bas de la jambe au niveau du genou. Cependant, la variabilité naturelle de l'anatomie entre les animaux exige une vigilance constante pour veiller à ce que le placement des électrodes est optimisée sur la base de cas par cas. En tant que tel, il y a un certain niveau d'essai et d'erreur associée à la pose des électrodes qui est significativement diminuée par l'expérience de l'utilisateur. Le nombre de fois les électrodes percent la peau doit être minimisée pour réduire l'enflure et l'inflammation, ce qui me diminuela production de force asured. Cela dépend de l'endroit où les aiguilles sont tout d'abord placées, mais il est recommandé de déplacer les aiguilles de deux fois ou moins en particulier dans la zone autour de la rotule. Enfin, lorsque les électrodes sont placées dans la jambe de l'animal, des modifications mineures peuvent être apportées à la mise en place de la jambe et du courant délivré par les électrodes. Cela devrait être fait tout en surveillant simultanément la force produite à partir d'une seule secousse. En plus de la mise en place des électrodes, des ajustements peuvent être apportés à la tension délivrée aux bornes des électrodes. Cependant, dans la configuration décrite ici, il est important de faire preuve de prudence lorsque l'on augmente la tension comme un moyen d'augmenter la production de force parce que la tension accrue va stimuler les nerfs qui innervent les muscles antagonistes.
Il y a trois problèmes techniques clés qui doivent être surveillés pour veiller à ce que le placement des électrodes reste optimale. Tout d'abord, le pied de l'animal anesthésié doit être solidementancré à l'appareil de pédale de commande , qui mesure la production de force musculaire (figure 2). Si le pied est ancré solidement pas, la force réelle produite par le muscle peut être partiellement convertie en le transducteur de force. Fixation du pied Unstable introduit également le risque de perdre le placement optimal des électrodes en mouvement au - delà de la contraction musculaire normale (c. -à- pied se éloigner de la platine) peut provoquer le déplacement des électrodes à partir de leur position superficielle ou déloger complètement. Soit le scénario va diminuer la force mesurée. Deuxièmement, le corps de l'animal doit être complètement décubitus et aligné dans un plan rectiligne (Figure 2). Le positionnement correct du corps des animaux empêche de légers mouvements de la jambe due à la respiration, et minimise également la torsion de la jambe et du bassin, ce qui permet un meilleur positionnement et un contact continu des électrodes de stimulation. Troisièmement, le bon positionnement et d'ancrage du genou est critical pour veiller à ce que la jambe reste stable, et donc, contribue à stabiliser le placement optimal des électrodes de stimulation pour permettre l'activation cohérente du nerf sciatique poplité externe.
Il y a quelques points supplémentaires qui devraient être soulignés. Tout d'abord, le système de levier du muscle commercial est conçu pour effectuer des tests sur la jambe gauche, mais la configuration peut être modifiée pour effectuer des tests sur la jambe droite aussi bien. Deuxièmement, les systèmes de levier musculaires peuvent être choisis en fonction de la taille de l'animal, afin que les utilisateurs doivent veiller à ce que la plate-forme utilisée est adéquate pour mesurer et soutenir la force produite par le modèle animal de choix. muscles testables pour la plate-forme d'équipement sont limités à ceux qui induisent l'extension plantaire ou dorsiflexion du pied. Troisièmement, il convient encore de souligner que le placement des électrodes peut être difficile et exige de la patience et de pratique pour maîtriser la technique. Electrodes deviennent aussi terne rapidement avec une utilisation régulière, il est donc utile d'avoir plusieurs s de rechangeets pour une fois, il devient difficile de piquer la peau superficielle. En troisième lieu, le protocole décrit dans le présent rapport utilise des séquences de stimulation spécifiques et des procédures d'analyse des données. Le logiciel d'analyse de logiciels et les données de contrôle du système levier musculaire et les données qu'il fournit peut répondre à de nombreuses autres questions expérimentales et donc son utilité va au-delà ce qui est décrit ici. En tant que tel, les utilisateurs sont encouragés à explorer au-delà des limites du protocole logiciel (s) présenté dans cet article. En dépit de ces limitations mineures dans les tests de la fonction musculaire in vivo est une approche puissante pour déterminer la capacité du muscle squelettique santé et contractile , car il est peu invasive et peut être effectuée à plusieurs reprises, sur une période de temps prolongée, sur le même animal. En bref, ce type d'utilitaire réparable rend le système particulièrement habile à tester les effets de nouveaux traitements pour les lésions du muscle squelettique ou de la maladie dans le hindlimb de rat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
| Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
| Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
| Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
| VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
| T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
| A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
| Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
| Alcohol Swabs | |||
| 200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
| cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
| Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
| servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
| Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
| Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
| High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
| Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
| Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |
References
- Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
- Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
- Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
- Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
- d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
- Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
- Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
- Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
- Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
- Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
- Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
- Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
- Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
- Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
- Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
- Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
- Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
- Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
- Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
- Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
- Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
- Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
- Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
- Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
- Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
- Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
- Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
- Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).
