Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

anvendelser av Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54487
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Virginia

Abstract

Til tross for evne til reproduksjon av skjelettmuskulatur, permanente funksjonelle og / eller kosmetiske underskudd (f.eks volumetrisk muskel tap (VML) som følge av traumatiske skader, sykdom og ulike medfødte, genetiske og ervervede forhold er ganske vanlig. Tissue engineering og regenerativ medisin teknologiene har enorm potensial til å gi en terapeutisk løsning. Men bruk av biologisk relevante dyremodeller, i kombinasjon med langsgående vurderinger av relevante funksjonelle tiltak er kritisk for utvikling av forbedrede regenererende terapeutika for behandling av VML-lignende skader. i den forbindelse, et kommersielt muskel spak system kan brukes til å måle lengde, spenninger, styrke og hastighetsparametre i skjelettmuskel. Vi brukte dette system, i forbindelse med en høy effekt, bi-fase stimulator, for å måle in vivo kraft produksjon som reaksjon på aktivering av den fremre crural rommet rotte bakben. Vi har Previgere brukte dette utstyret for å vurdere den funksjonelle virkningen av VML skade på tibialis anterior (TA) muskel, så vel som omfanget av funksjonell restitusjon etter behandling av de skadde TA muskelen med vår vev konstruert muskelreparasjon (TEMR) teknologi. For slike undersøkelser, blir den venstre foten av en bedøvet rotte godt forankret til en fotplate koblet til en servomotor, og den felles peroneal nerve stimuleres av to perkutan nålelektroder for å fremkalle muskelsammentrekning og bøyning til flere sider av foten. Peroneal nervestimulering-indusert muskelkontraksjon måles over et område av stimulerings frekvenser (1-200 Hz), for å sikre at en eventuell platå i kraft produksjon som gir mulighet for en nøyaktig bestemmelse av topp tetanic kraft. I tillegg til vurderingen av omfanget av VML skade, så vel som graden av funksjonell restitusjon etter behandling, kan denne metoden kan lett brukes til å studere forskjellige aspekter av muskel fysiologi og patofysiologi. En slik tilnærming should bistå med mer rasjonell utvikling av bedre terapi for muskel reparasjon og regenerering.

Introduction

Skjelettmuskulatur har en bemerkelsesverdig indre kapasitet for reparasjon som respons på skade eller sykdom 1,2. Eksperimentelt, har robustheten denne regenerativ respons er godt dokumentert i dyremodeller ved å studere, for eksempel, den tiden løpet av skjelettmuskelskader, reparasjon og regenerering etter påføring av myotoxins (f.eks Cardiotoxin) 3-7. Mer spesifikt, etter omfattende Cardiotoxin-indusert muskelskader (38-67% av muskelfibre 8), er regenerering formidlet av satellittceller, bosatt stamceller som modnes til slutt bli funksjonelle muskelfibre 4,9-13. Sluttresultatet er økt etter skade funksjonell regenerering av sunt, kraftproduserende muskelvev 14-16. Selv om detaljene er godt utenfor rammen av denne rapporten, den mekanistiske grunnlaget for muskelregenerasjonenen reflekterer nøye orkestrert hendelsene i mange celletyper fra flere linjene benytter canonical signalveier kritisk til både vev utvikling og morphogenesis 5,17-21. Viktigere er myotoxin-indusert regenerering aktivert av det faktum at den ekstracellulære matriks, neuronal innervasjon og blodkar perfusjon forbli strukturelt intakt etter Cardiotoxin-indusert muskelskade 3,8,22. I sterk kontrast til disse viktige vev strukturer og komponenter er, per definisjon, helt fraværende i sammenheng med VML skade; hvor frank tap av vev, på grunn av en rekke årsaker, resulterer i faste funksjonelle og kosmetiske underskudd 23-25.

Uavhengig av de ekstra utfordringer knyttet til muskel reparasjon og regenerering etter VML skade sammenlignet med myotoxin-indusert muskelskader, bedre forståelse av mekanistiske grunnlaget for skjelettmuskulatur regenerering og reparasjon, i en rekke sammenhenger, ville være godt tjent med utnyttelse av biologisk relevante dyremodeller, i kombinasjon med langsgående enssessments av relevante funksjonelle tiltak. Som omtalt heri, studier av rotte bakben gir en utmerket modellsystem for dette formål. Mer spesifikt, musklene i fremre crural rommet (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) og hallicus longus (HL)), som er ansvarlig for bøyning til flere sider av foten, er lett identifisert og manipulert. Videre er de tjent med store blodårer (bekken og grener), og er innervated av nerver (hofte og grener, inkludert peroneal) kjører lengden på beinet 26-28. Som sådan kan man bruke rotte bakben modell for direkte å vurdere skjelettmuskelfunksjon / patologi in vivo, eller for å evaluere mer indirekte påvirkning av patologi relaterte endringer i blodårer eller nerver på tilsvarende skjelettmuskelfunksjon. I begge tilfeller kan alvorlighetsgraden av sykdommen, så vel som effekten av behandlingen bestemmes som en funksjon av muskelkraft produksjon (moment) og tilhørende fot movement 29-34.

Ideelt sett er kraftmålinger ledsaget av histologiske studier og genuttrykk analyser til mer grundig vurdere strukturelle og molekylære status av skjelettmuskulatur. Grunnleggende histologi og immunhistokjemi, for eksempel, er i stand til å svare på spørsmål om muskelstørrelse, muskelfiberinnrettings, ekstracellulær matrise-blandingen, plassering av kjerner, cellenummer, og protein lokalisering. Genekspresjonsanalyser, i sin tur, er nødvendig for å identifisere de molekylære mekanismer som kan påvirke / modulerer modenhet av muskelfibrene, sykdomstilstander og metabolske aktivitet. Selv om disse metodene gir viktig informasjon, de vanligvis representerer terminalpunktene, og viktigst, de ikke klarer å direkte adresse funksjonsevne av skjelettmuskulatur, og dermed er samsvarende snarere enn utløsende. Men når histologiske studier og genuttrykk analyser vurderes i forbindelse med funksjonell Måltes, da, mekanismer for styrkeproduksjon og funksjonell regenerering kan mest nøyaktig identifisert.

I denne forbindelse, kan den kraft som fremkallende egenskaper av en muskel kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Alle tre fremgangsmåter har både fordeler og begrensninger. I et in vitro eksperiment, for eksempel, er den muskel fullstendig isolert og fjernet fra kroppen til dyret. Ved å fjerne påvirkning av blodårer og nerver som forsyner muskelen, kan den kontraktile evne til vev bestemmes på en kontrollert ytre miljø 35. In situ muskeltesting tillater at muskel å være isolert, som med in vitro-preparater, men den innervasjon og blodtilførselen forblir intakt. Fordelen med in situ eksperimentelle modellen er at den tillater en person muskel til å bli studert mens innervasjon og blodtilførselen er minimal opprørt 36. I beggein vitro og in situ forsøk, kan farmakologisk behandling påføres mer direkte, uten å måtte ta hensyn til virkningene av alle omkringliggende vev eller virkningen av sirkulasjonssystemet for de målte kontraktile responser 37. Imidlertid in vivo funksjonstesting, som beskrevet heri, er den minst invasiv teknikk for vurdering av muskelfunksjon i dets native miljø 38, og kan utføres gjentatte ganger over tid (dvs. i lengderetningen). Derfor vil det være det sentrale punktet i diskusjonen nedenfor.

I denne forbindelse, perkutane elektroder innsatt nær den muskel av interesse, eller den motor nerve som betjener det, tilveiebringe et elektrisk signal til muskelen. En svinger måler deretter den resulterende lengde eller kraft endringer i den aktiverte muskelen som anvist av en forhåndsbestemt, tilpasset programvare protokollen. Fra disse data kan de fysiske egenskapene til muskel bestemmes. Disse inkluderer force-frekvens, maksimal stivkrampe, kraft-hastighet, stivhet, lengde spenning og tretthet. Muskel lengde eller kraft kan også holdes konstant slik at muskelen kontrakter isometrisk eller isotonisk. Viktigere, kan disse eksperimentelle protokoller hurtig bli utført, lett gjentatt, og customized- samtidig som dyret er bedøvet, og med en hvileperiode på timer til dager. En enkelt dyr kan gjennomgå in vivo kraft testing av flere ganger, og dermed gjør longitudinelle studier av sykdomsmodeller eller evaluering av terapeutiske plattformer / teknologier.

Som beskrevet her, et kommersielt muskel spak system i forbindelse med en høy effekt, er tofase-stimulator som brukes til å utføre in vivo muskelfunksjon tester for å evaluere bidraget av tibialis anterior muskel av rotte bakben til bøyning til flere sider av foten via stimulering av peroneal nerve. Vi har utviklet en protokoll som er spesielt utformet for å evaluere regenerativ medisin / tissue engineering teknologier for muskel reparasjon følgende traumatisk VML skade av rotte TA muskelen. Det bør merkes; EDL og HL trenger å bli dissekert ut fra det fremre kammer crural for spesifikt å evaluere TA muskelen (de utgjør omtrent 15-20% av den totale tibialis anterior moment målt følgende peroneal nervestimulering (Corona et al., 2013) ). Fordi denne tilnærmingen gir omfattende langsgående analyse av muskelfysiologi / funksjon, kan det kaste viktig mekanistisk innsikt på en rekke andre typer fysiologiske undersøkelser samt en rekke sykdommer eller terapeutiske områder 39. For eksempel in vivo-muskelfunksjon testing er anvendelig for studier av treningsfysiologi, iskemi / reperfusjon forskning, myopati, nerveskader / neuropati og blodåresykdom, sarkopeni, og muskeldystrofier 40.

Protocol

Alle dyrene ble humant behandlet og alle protokoller ble godkjent av University of Virginia IACUC.

1. Utstyr Forberedelser

  1. Sørg for at alle maskiner er riktig tilkoblet.
  2. Slår på maskinen, etterfulgt av høy effekt tofase-stimulator og dual-mode spak system.
  3. På denne tiden, plasserer dyret inn i anestesi kammer leveres med 2% isofluran, og slå på varmeelementet slik at plattformen er oppvarmet til 37 ° C.
  4. Plasser elektrodene i 70% etanol slik at polytetrafluoretylen (PTFE) belagt tips er nedsenket og skal desinfiseres når du setter opp enheten og programvaren.
  5. Finn og åpne spaken system kontroll programvare på skrivebordet.
    MERK: Dette vil være den programvaren som trengs for å utføre funksjonstesting.

2. Oppsett av programvare

  1. Når programmet er åpnet (figur 1A), endre parameters for Instant Stim under oppsettmenyen til ønskede verdier.
    MERK: I denne protokollen, alle parametere ligge på de forhåndsinnstilte nivåer med unntak av "Run Time (s)", som er endret til 180 sek (figur 1B).
  2. Lag en autolagringsmappe under innstillingsmenyen.
  3. Finn en type-stand vindu merket "Automatisk lagring Base". Skriv inn navnet på prøven, for eksempel "Rat1-date-endepunktet". Direkte til venstre for "Automatisk lagring Base" type-stand vinduet, klikk på boksen til "Enable Automatisk lagring."
  4. På toppen av kontrollskjermen, velger du "Sequencer". Et nytt vindu åpnes. På bunnen av det nye vinduet, velg "Åpne Sequence". Et nytt vindu åpnes. Velg forhåndslagde sekvens og klikk på OK. En protokoll liste med sekvensparametre inkludert hyppighet, varighet av stimuli og hviletid vil utvikle seg i vinduet som heter: Sequence Editor (figur 1C). Klikk på "Load Sequence" -> & #34, Close Window ".
  5. For å se sanntid nåværende og stimulering, velg "File" -> "Levende data Monitor". Et nytt vindu åpnes.
  6. I den nye Live datavindu, format skjerm for testing ved hjelp av autoskalering funksjon, eller manuelt angi maksimums- og minimums y-verdiene som vises på skjermen.

3. Animal Set-up

MERK: Alle kraftmålinger er de av en 11 uker gamle Lewis rotte. Det er en lineær korrelasjon mellom muskelmasse og styrke produksjon (i Newton). Derfor, som en alder av rotte øker, bør kraftverdiene produsert av benet øke i tillegg.

  1. Sikre at dyret er i riktig plan for anestesi før du fjerner den fra anestesi kammeret. Fjerne alt hår på den laterale side mellom ankelen og bekkenet av den eksperimentelle beinet ved hjelp av en elektrisk hårklipper.
    MERK: Den riktige flyet av anestesi oppnås når dyret jegs non-respondere på en tå klype. Det er nødvendig å følge retningslinjene lagt frem av hver institusjonens Animal Care og bruk komité.
  2. Plasserer dyret i liggende stilling, slik at nesen på dyret sitter godt i anestesi nesepartiet slik at den forblir på det tilstrekkelig dybde av anestesi.
  3. Regulerer stillingen til pedalen anordningen av tre uavhengige knotter (figur 2). Bruk av knottene (A og B) for å justere pedalen, plassere pedal apparat på sitt helt til venstre og laveste posisjon, henholdsvis. Dette vil muliggjøre korrekt posisjonering av dyrets foten mens forlate rommet for senere manipulasjoner. På denne posisjonen, kan du bruke knappen til venstre på banen for å flytte apparatet enten mot eller lenger bort fra eksperimentator slik at dyret etappe ligger i en rett plan.
  4. Rens ben med tre forandringer av jod og alkohol. Den jod bør forbli på benet i 30 sek.
  5. Juster dyret eller plattformen(Figur 2A, D), slik at den forlengede ben sikrer fullstendig kontakt mellom fotsålen og fotpedalen.
  6. Ved hjelp av medisinsk tape, feste foten av dyret mot fotplaten (figur 2D). Det er avgjørende at hælen er flush mot bunnen av pedalen og hele foten er flatt og vil ikke løsne fra platen under testing.
  7. Lokalklemmekanismen for å stabilisere benet. Skyv stabiliseringspinnen i langt nok for å redusere bevegelse av benet og lås den på plass ved å dreie unbrakonøkkel.
  8. På denne posisjonen ved å bruke bryteren C for å flytte anordningen enten mot eller bort fra experimenter, slik at ankelen, tibia og femur ligge på en rett linje (figur 2C). Pass på at beinet er parallell med fotpedal. Foreta justeringer på kurset og fine knotter som finnes på baksiden av apparatet, for å sakte bevege ankelen så foten og tibia er i 90 ° stilling.
  9. continue for å bevege benet så femur og Tibia er ved en 90-graders vinkelrett vinkel (figur 2B). På dette punkt er den dyr klar for elektrodene.

4. Plassering av elektrodene

  1. Aktiver "Instant Stim" ved å klikke på den oransje knappen merket "Instant Stim".
  2. Plassere begge elektroder overfladisk på den proksimale enden av tibialis anterior og bevege elektrodespissene rundt inntil piggene blir sett på den aktive skjermen. Ideelt sett bør toppene være rundt 0,4 N.
    MERK: Elektrodene bør plasseres tilstøtende og vinkelrett på planet for peroneal nerve, som i sin tur går sideveis fra kneet og vinkelrett på tibia.
  3. Sett en nål langt nok til å pierce dermis, og knapt i det muskulære laget. Flytt den andre elektroden rundt til piggene blir sett på live monitor rundt 0,6 N. Sett nåler og klemme dem på plass ved hjelp av en hobby klemme eller medisinsk tape.
  4. ENJ USTER grove og fine justeringer for å finne maksimal kraft utgang.
  5. På høy effekt bi-fase stimulator, vil det være to knotter i sentrum. Den ene er merket "RANGE" og den andre "ADJUST". Drei "RANGE" knappen til ønsket maksimal strømstyrke.
    MERK: Toppene vil sakte øke i omfang, og den maksimale strømstyrken bestemmes som det nivået der tre påfølgende stimuler resultere i identiske kontraktile responser. Motstå snu strømstyrken høyere enn nødvendig; den maksimale strømstyrke vil stimulere hele muskelen til å trekke seg sammen, men en hvilken som helst høyere strøm vil resultere i rekruttering av nabo muskler og potensielt antagonister også.
  6. Drei "ADJUST" knappen for å angi prosentandelen av "RANGE" som skal brukes til å stimulere muskelen. På dette punktet, bør kraft lese rundt 1,0 N. Dette kan kreve en økning eller reduksjon i strøm.
  7. Kontroller elektrodene for å sikre at de er sikre. StoppeInstant Stim.
  8. På "live data" vinduet, klikk på "Start Sequence."
  9. Fortsett å overvåke kurvene ved å gå tilbake til kontrollskjermen, og klikke på "Analyse" -knappen plassert over den oransje "Instant Stim" -knappen. Den tetanic kurve bør begynne å ta form rundt 60 Hz stimulering.

5. Etterbehandling Stimulering og Clean Up

  1. Etter sekvensen er ferdig, fjern elektrodene og tørk av med 70% alkohol. Plasser elektrodene i dekslene.
  2. Løsne kneet klemme og slå av anestesi. Fjern dyret av bedøvelsen gass og plasserer dyret i liggende stilling, fortsatt på varmeputen. Opprettholde rotte på 100% O 2 for noen få minutter etter at isofluran gass har blitt slått av for å holde rotte oksygen. Dyret kan bevege seg i utgangspunktet, men ikke returnere dyret tilbake til buret før dyret gjenvinner bevisstheten. Hvis stølhet er lagt merke tiloverhales, bør gis en dose av NSAID som angitt av dyr omsorg komiteen.
  3. Slå av alt utstyret som er oppført i trinn 1.2, lukker programvaren, og fortsetter å dataanalyse.
  4. Tørk av plattformen og fotpedal.

6. Data Analysis

MERK: Dataanalyse er utført for å passe en sekvens designet av denne lab og i henhold til lab protokoller. Analyseverdier, datapunkter av betydning, og andre aspekter av prosedyren vil endres avhengig av hensikten med brukeren.

  1. Åpne dataanalyse programvare.
  2. Klikk på høy gjennomstrømning menyen for å muliggjøre analyse av flere datafiler (prøver) om gangen. Velg "Force Frequency" Analyse.
  3. Klikk på "Velg filer" knappen og åpne så mange lagrede datafiler som ønsket.
  4. Velg "Manual" i Markør Placement Method boks.
    MERK: Dette vil tillate brukeren å analysere alt av daten innenfor et ønsket tidsstempel, i motsetning til programmet automatisk velge analysen sted.
  5. Endre End Markør systemtidverdi til 2. Klikk på "Analyze" (figur 1D).
  6. For å lagre tabellen og analysere data ved hjelp av et regneark, klikk på "Lagre tabell til ACSII knappen. Dette vil lagre filen, og det kan åpnes med et regneark på et senere tidspunkt.
  7. Åpne den lagrede datafilen i regnearket.
  8. Lag en ekstra kolonne merket "Absolute Maximum", og bestemme forskjellen mellom grunnlinjen og maksimumsverdier for hver prøve. Dette vil gi den totale maksimale kraft som produseres ved hver frekvens.
  9. For å bestemme dreiemomentet, multiplisere hver kraftverdi ved lengden av vektarmen.
    NB: I dette tilfellet ville det være representert ved foten lengden av dyret. Denne protokollen bruker gjennomsnitts eksperimentelt bestemte verdi på 30 mm. Brukeren har nå fastslått at verdiene for maximum moment produsert ved hver frekvens.
  10. Grafen til disse verdiene som en dreiemomentkurve frekvens, eller den maksimale dreiemomentet som produseres av dyret på tvers av alle stimulerings frekvenser.
    MERK: Dette kan identifiseres og brukes som en single point of sammenligning mellom prøvene.

Representative Results

Den tetanic kurven kan brukes til å skille optimale resultater fra sub-optimale resultater. Denne kurve vanligvis begynner å dannes ved en frekvens på 60 Hz. Den avgjørende faktor for å oppnå gode resultater, er evnen til å stimulere muskelen, slik at det frembringer sin maksimale kraft og opprettholder den styrke i løpet av stivkrampe. Den ideelle kurve skal ha en uavbrutt, skarpe, vertikale oppsving ved stimulering, etterfulgt av et flatt platå fase med minimale svingninger, og en uavbrutt, skarp nedgang vertikal periode ved avslutning av stimulering (figur 4). Avvik fra den ideelle kurven er indikasjoner på at muskelen er fatigued (figur 5D) eller at muskelen ikke blir riktig stimulert til å produsere maksimal kraft (figur 5B - C). Sistnevnte gir vanligvis av feil plassering av elektrodene som fører til svikt i maksimal rekruttering av muskelfibre under Stimulasjon. Et kjennetegn som gjør det mulig for forskeren å avgjøre om en ikke-ideell kurve er et resultat av feil plassering av elektrodene eller patologiske forandringer til muskelen er hvorvidt tetanic kurven er ferdig (smeltet) eller ufullstendig (sammensmeltede). En ukondensert, ufullstendig tetanic kurve indikerer at elektrodene er feilplassert, noe som resulterer i muskelen ikke opplever en maksimal kontraksjon. kan observeres et eksempel på en patologisk endring i muskelen som redusert maksimal kontraksjon sammenlignet med kontroll, eller en kontraktile respons som raskere fatigues.

De tre forskjellige typer av toppene som oppnås i løpet av denne prosedyren representerer forskjellige elektrode og beinstillingen og kan sees i figur 3. De første toppene vil være rundt 0,4 N og forekommer når den riktige plassering av elektrodene blir bestemt på overflaten på huden (figur 3A). Det annet sett av topper har higher amplitude, vanligvis rundt 0.5-0.6N (figur 3B) og forekommer når elektrodene pierce gjennom dermis. Etter disse er oppnådd, blir benet og foten innstilles for å maksimere produksjonen kraft, som oppnås når toppamplituden øker til ca. 1N eller høyere (figur 3C). På dette punktet, kan Instant Stim slås av og sekvensen kan begynne. Disse retningslinjene sikre nøyaktige og reproduserbare resultater og er viktige sjekkpunkter i hele protokollen.

De endelige resultatene kan representeres på forskjellige måter avhengig av den informasjon som brukeren ekstraheres fra krafttesten og den eksperimentelle design. I denne protokollen, er maksimal kraft målt på tvers av alle frekvensene av stimulering, kan likevel andre datapunkter være viktig for en bestemt forsker eller applikasjon. Et eksempel er frekvensen av stimulering ved hvilken tetanic kurven begynner å ta form. Than data kan sammenlignes med andre resultater som ble oppnådd fra et tidligere eller senere eksperiment på samme dyr, eller for sammenligninger mellom forskjellige behandlingsgrupper. Styrkeproduksjon kan normaliseres etter kroppsmasse å beregne isometrisk kraft og gi en mer objektiv vurdering av virkningen av alder på maksimal kontraksjon observert. Selv om dyr av forskjellig kroppsvekt og alder vil produsere ulike maksimalkrefter, bør formen på kurven tetanic være konsistent mellom alle grupper når fremgangsmåten utføres på riktig måte.

Figur 1
Figur 1: Oversikt over Lever system kontroll og dataanalyse programvare for analyse (A) Oversikt over styringen programvare når du åpner programmet.. (B) Parametere for "Instant Stim." (C) Eksempel sekvens for kraft-frekvens stimulering. (D Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Kritiske aspekter for posisjonering av Rat og plassering av foten i apparatet (A) rotte er i liggende stilling med venstre fot godt festet til fotplaten.. De rette vinkler gjort av foten, leggen, og lår er sirklet. (B) Den rette vinkelen skapt av ankelen er uthevet. (C) Den bør benet bli justert i en rett fly fra fot til kroppen. (D) elektrodeplasseringen er parallelle og vinkelrett på planet av peroneal nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Representative Peaks demonstrere betydningen av riktig elektrodeplassering til Maximal Force Produksjon (A) Baseline rush tetanic responser observert med elektroder plassert altfor overfladisk.. (B) større topper med elektroder som er satt inn på riktig sted. (C) Overgang fra høyere topper signal riktig plassering av elektrodene til optimal pre-sekvens peak amplitude som benet og foten posisjoner er optimalt justert./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Optimal tetanic Curve 100 Hz Denne kurven øker og minker kraftig og har et flatt platå fase. Dette eksemplet viser riktig plassering av elektrodene og maksimal kraft stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Representative eksempler på suboptimal tetanic Curves oppnådd ved 100 Hz (A) Etter avslapping, fall denne kurven under grunnlinjen. Dette er en indikasjon på stimuleringav antagonister. (B - D) Disse grafene er et resultat av feil plassering av elektrodene og ulik rekruttering av muskelfibre. Platået faser viser store svingninger (B), en oppover bakke (C), eller en nedfart (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen viser en forholdsvis enkel fremgangsmåte for å utføre in vivo muskelfunksjon testing på den fremre crural rommet på rotte med bakbena. Andre former for muskelfunksjonen testing, inkludert ex vivo og in situ-protokoller kan også gi viktig informasjon om muskelfysiologi. Imidlertid er betydningen av in vivo funksjonsprøving ligger i dens ikke-invasive natur, og det faktum at den mest nøyaktig sammenfatter endogene mekanismer for muskelstimulering. Både ex vivo og in-situ-testing, sene og / eller muskel er utsatt, og derfor må holdes fuktig eller neddykket 41,42. In vivo-testing fjerner ledsagende variabler av trauma og betennelse som kan være forårsaket av de kirurgiske prosedyrene som kreves for in situ muskelfunksjon testing; Dette er spesielt viktig hvis målet med forsøket er å undersøke inflammatorisk og cellulære prosesser in vivo-testing krever lite kirurgisk dyktighet som muskelen ikke er isolert fra omgivelsene og ikke krever presise knuter for å redusere muskel / sene glidning (som er tilfellet for in situ eller ex vivo testing) 41. I tillegg, med tilstrekkelig praksis, hastigheten av korrekt plassering av elektrodene og evnen til raskt å foreta justeringer for å oppnå maksimal styrke produksjon av muskelen vil sikre at protokollen gjennomføringen er hurtig og reproducible- både i dyr og på tvers av ulike brukere av samme utstyr 39 . Det er gunstig å begynne med en vurdering av hele fremre crural komponent som vist, før fjerning av de mindre tilgjengelige synergis muskler (EDL og HL) for mer direkte undersøkelse av TA-muskelen. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan man ganske raskt oppnå mestring av teknikk. Mens prosedyren beskrevet her demonstrerer og fremhever nytten av en kraft frfrekvensskiftnøklede protokollen til å indusere stivkrampe og bestemme den maksimale kraft produsert av en muskel, bør brukerne bestemme type (r) av funksjonelle tester som ville best informere sine spesifikke eksperiment (er) og forskningsmål.

Det er flere kritiske trinnene som skal utføres nøye for å sikre optimal og reproduserbar eksperimentelle resultater, det vil si i samsvar maksimal kraft produksjon av muskelen til en rekke forskjellige stimuleringsparametere. Flere av de viktigste funksjonene er skissert i figur 2. Men riktig plassering og stabilitet av stimulerende elektrode er en absolutt forutsetning for reproduserbar maksimal stimulering av peroneal nerve. I denne forbindelse bør elektrodene være plassert på overflaten. Det vil si, hvis elektrodeplasseringen er for dypt, risikerer en direkte elektrisk stimulering av antagonist muskler, og dermed minske størrelsen av den observerte kontraktile respons av fremre crural rommet. Videre,to elektroder bør plasseres i så nær hverandre som mulig for å redusere den elektriske motstand i den omgivende hud og bindevev. Generelt elektrode posisjonering nær kneet og mediale til benet direkte tracing kanten av tibialis anterior til hvor den møter gastrocnemius gir ofte tilstrekkelig kraft produksjon. Dette sikrer også at elektrodene er plassert tilstøtende og vinkelrett på planet til peroneal nerve, som i sin tur løper vinkelrett på skinnebenet og sideveis ned i benet fra kneet. Men den naturlige variabiliteten i anatomi mellom dyr krever konstant årvåkenhet for å sikre at plassering av elektrodene er optimalisert på sak-til-sak basis. Som sådan, er det en viss grad av prøving og feiling i forbindelse med plassering av elektroder som er betydelig redusert av den erfaring av brukeren. Antall ganger elektrodene pierce huden bør minimaliseres for å redusere hevelse og betennelse, noe som reduserer megasured styrkeproduksjon. Dette er avhengig av hvor nålene er opprinnelig plassert, men det anbefales å flytte nålene to ganger eller mindre spesielt i området rundt kneskålen. Til slutt, når elektrodene er plassert i benet av dyret, mindre justeringer kan gjøres til posisjoneringen av benet og strømmen levert gjennom elektrodene. Dette bør gjøres samtidig med overvåking av den kraft som produseres fra en enkelt rykk. I tillegg til plassering av elektrodene, kan justeringer også gjøres til spenningen levert over elektrodene. Men i oppsettet som er beskrevet her, er det viktig å være forsiktig når du øker spenningen som en måte å øke kraft produksjonen fordi den økte spenningen vil stimulere nerver som innerverer antagonistiske muskler.

Det er tre viktige tekniske spørsmål som må overvåkes for å sikre at elektrodeplasseringen forblir optimal. Først må foten av dyret bedøvet være forsvarligforankret til fotpedalen apparat, som måler muskelkraften produksjon (figur 2). Hvis foten ikke er godt forankret, kan den sanne kraft produsert av muskelen bli ufullstendig oversatt til styrken svinger. Ustabil fot fiksering innfører også risikoen for å miste den optimale plassering av elektrodene som bevegelse utover normal muskelkontraksjon (dvs. foten beveger seg bort fra fotplaten) kan forårsake forskyvning av elektrodene fra deres overfladisk stilling eller løsne dem helt. Begge scenario vil redusere den målte kraft. For det andre bør dyrets kropp være helt liggende og justert i en rett plan (figur 2). Riktig plassering av dyr kroppen hindrer små bevegelser i bena på grunn av respirasjon, og minimerer også vridning av beinet og bekken, slik at bedre plassering og løpende kontakt med de stimulerende elektroder. Tredje, korrekt posisjonering og forankring av kneet er Critical for å sikre at benet forblir stabil, og dermed bidrar til å stabilisere den optimale plassering av de stimulerende elektroder for å muliggjøre konsistent aktivering av peroneal nerve.

Det er noen flere punkter som bør vektlegges. For det første er det kommersielle muskelen spaken system som er utformet for å utføre tester på venstre ben, men oppsettet kan modifiseres til å utføre testing på den høyre benet i tillegg. For det andre kan muskelspaksystemene bli valgt basert på størrelsen av dyret, slik at brukere skal sikre at plattformen som anvendes er tilstrekkelig til å måle og understøtte den kraft som frembringes av dyremodell av valg. Prøvbare muskler for utstyret plattformen er begrenset til de som induserer plantar forlengelse eller dorsalfleksjon av foten. For det tredje bør det igjen understrekes at elektrodeplasseringen kan være utfordrende og krever tålmodighet og praksis for å mestre teknikken. Elektroder også bli kjedelig raskt med regelmessig bruk, så det er nyttig å ha flere reserve sets for når det blir vanskelig å stikke huden overfladisk. Tredje, protokoll beskrevet i denne rapporten benytter spesielle stimuleringssekvenser og dataanalyse prosedyrer. Muskelen spaken system kontroll programvare og dataanalyse programvare og dataene den gir kan svare på mange andre eksperimentelle spørsmål og derfor utvider sin nytteverdi utover det som er skissert her. Som sådan, er brukere oppfordres til å utforske utover grensene for programvareprotokoll (s) presentert i denne artikkelen. Til tross for disse mindre begrensninger, in vivo muskelfunksjon testing er en kraftig metode for å bestemme helse- og kontraktile egenskaper av skjelettmuskulatur, fordi det er minimal invasiv og kan utføres på flere anledninger, over en lengre tidsperiode, på det samme dyret. Kort sagt, denne typen service på verktøyet gjør systemet spesielt flinke til å teste effekten av nye behandlingsformer for muskel-skjelettlidelser skade eller sykdom hos rotter bakben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
  2. Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
  3. Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
  5. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
  6. Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
  7. d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
  8. Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
  9. Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
  10. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  12. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
  13. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
  14. Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
  15. Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
  16. Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
  17. Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
  18. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  19. von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
  20. Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
  21. Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
  22. Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
  23. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
  24. Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
  25. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
  26. Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
  27. Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
  28. Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
  29. Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
  30. Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
  31. Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
  32. Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
  33. Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
  34. Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
  35. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
  36. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
  37. Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
  38. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
  39. Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
  40. Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
  41. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
  42. Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
  43. Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).

Tags

Bioteknologi , Muskelstyrkeproduksjon peroneal nerve stimulering tibialis anterior dorsiflexion tissue engineering regenerativ medisin skjelettmuskulatur gjenfødelse volumetrisk muskel tap muskelsykdommer patologi
anvendelser av<em&gt; I Vivo</em&gt; Functional Testing av Rat tibialis anterior for Vurderer Tissue Konstruert Skeletal Muscle Reparasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mintz, E. L., Passipieri, J. A.,… More

Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter