Abstract
Trots den regenerativa kapaciteten hos skelettmuskel, permanenta funktionella och / eller kosmetiska underskott (t.ex. volymetriska muskel förlust (VML) till följd av traumatisk skada, sjukdom och olika medfödda, genetiska och förvärvade villkor är ganska vanligt. Tissue engineering och regenerativ medicin teknik har en enorm potential att ge en terapeutisk lösning. Men användningen av biologiskt relevanta djurmodeller i kombination med längsgående bedömningar av relevanta funktionella åtgärder är avgörande för utvecklingen av förbättrade regenerativa terapier för behandling av VML-liknande skador. i detta avseende ett kommersiellt muskel hävstångssystem kan användas för att mäta längden, spänning, kraft och hastighetsparametrar i skelettmuskel. Vi använde detta system, tillsammans med en hög effekt, bifas stimulator, för att mäta in vivo-kraft produktion som svar på aktivering av den främre crural utrymmet i råttan bakben. Vi har PREVígare använt denna utrustning för att bedöma den funktionella effekten av VML skada på tibialis anterior (TA) muskler, liksom omfattningen av funktionell återhämtning efter behandling av de skadade TA muskeln med vår vävnadstekniska muskelreparation (TEMR) teknologi. För sådana studier är den vänstra foten av en nedsövd råtta säkert förankrad vid en fotplatta kopplad till en servomotor, och den gemensamma peronealnerven stimuleras av två perkutan nålelektroder att framkalla muskelsammandragning och dorsalflexion av foten. Peronealnerven stimulering-inducerad muskelsammandragning mäts över ett område av stimuleringsfrekvenser (1-200 Hz), för att säkerställa en eventuell platå gällande produktion som gör det möjligt för en noggrann bestämning av topp tetanic kraft. Förutom utvärdering av omfattningen av VML skada samt graden av funktionell återhämtning efter behandling, kan denna metod lätt tillämpas för att studera olika aspekter av muskelfysiologi och patofysiologi. Ett sådant tillvägagångssätt should hjälpa till med mer rationell utveckling av förbättrade läkemedel för muskel reparation och förnyelse.
Introduction
Skelettmuskel har en anmärkningsvärd inneboende kapacitet för reparation som reaktion på skada eller sjukdom 1,2. Experimentellt har robusthet denna regenerativa svar är väl dokumenterade i djurmodeller genom att studera till exempel tidsförloppet av skelett muskelskada, reparation och återhämtning efter applicering av myotoxins (t.ex. cardiotoxin) 3-7. Närmare bestämt, efter omfattande cardiotoxin-inducerad muskelskada (38-67% av muskelfibrer 8), är regeneremedieras av satellitceller, de inhemska stamceller som mogna att slutligen bli funktionella muskelfibrer 4,9-13. Slutresultatet är en ökad efter skada funktionell regenerering av friska, kraftproducerande muskelvävnad 14-16. Även om detaljerna är långt utanför ramen för denna rapport, den mekanistiska grunden för muskelregenere speglar noggrant iscensatt händelser för många celltyper från flera linjer utnyttjar canonical signaleringsvägar avgörande för både vävnadsutveckling och morfogenes 5,17-21. Viktigast är myotoxin-inducerad regeneremöjliggörs av det faktum att den extracellulära matrisen, neuronal innervation och blodkärls perfusion förblir strukturellt intakt efter cardiotoxin-inducerad muskelskada 3,8,22. I skarp kontrast, dessa viktiga vävnadsstrukturer och komponenter är per definition helt frånvarande i samband med VML skada; där frank förlust av vävnad, på grund av en mängd olika orsaker, resulterar i permanenta funktionella och kosmetiska underskott 23-25.
Oberoende av ytterligare utmaningar i samband med muskel reparation och regenerering efter VML skada i jämförelse med myotoxin framkallad muskelskada, ökad förståelse av den mekanistiska grunden för skelettmuskel förnyelse och reparation, i en mängd olika sammanhang, skulle tjänas väl genom utnyttjande av biologiskt relevanta djurmodeller i kombination med längd enssessments av relevanta funktionella åtgärder. Såsom diskuteras häri, studier av råttan bakben ger en utmärkt modellsystem för detta ändamål. Mer specifikt, musklerna i främre crural facket (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) och hallicus longus (HL)), som ansvarar för dorsalflexion av foten, lätt identifieras och manipuleras. Dessutom är de betjänas av större blodkärl (höft och grenar), och innerveras av nerver (ischias och grenar, inklusive peroneal) kör längden av benet 26-28. Som sådan, kan man använda råtta bakbenen modell för att direkt bedöma skelettmuskelfunktion / patologi in vivo, eller för att utvärdera mer indirekta effekterna av patologirelaterade förändringar i blodkärl eller nerver på motsvarande skelettmuskelfunktion. I båda fallen kan sjukdomens svårighetsgrad, liksom effekten av behandlingen bestämmas som en funktion av muskelstyrka produktion (vridmoment) och motsvarande fot movement 29-34.
Helst är kraftmätningar tillsammans med histologiska studier och analys av genuttryck till striktare utvärdera den strukturella och molekylära status skelettmuskulaturen. Grundläggande histologi och immunohistokemi, till exempel, kan svara på frågor om muskelmassa, muskelfiberinriktning, extracellulära matriskomposition, placering av kärnor, cellantal och proteinlokalisering. Genuttryck analys, i sin tur, är nödvändig för att identifiera de molekylära mekanismer som kan påverka / modulerar mognad muskelfibrer, sjukdomstillstånd och metabolisk aktivitet. Även om dessa metoder ger viktig information, de i allmänhet representerar terminal endpoints, och viktigast, inte de direkt ta itu med funktionsförmåga i skelettmuskulaturen, och därmed är korrelat snarare än orsak. Men när histologiska studier och analys av genuttryck utvärderas i samband med funktionell measures alltså mekanismer force produktion och funktionell regenerering kan mest noggrant identifieras.
I detta avseende kan den kraft producerande förmågan hos en muskel mätas in vitro, in situ eller in vivo. Alla tre metoder har både fördelar och begränsningar. I en in vitro experiment, till exempel, är muskeln helt isolerad och avlägsnas från kroppen av djuret. Genom att ta bort påverkan av blodkärl och nerver som försörjer musklerna kan sammandragande förmågan hos vävnaden bestämmas i en hårt kontrollerad yttre miljön 35. In situ muskeltestning gör muskeln som ska isoleras, som med in vitro-preparat, men , innervation och blodtillförseln förblir intakta. Fördelen med in situ försöksmodell är att det tillåter en individ muskel som ska studeras medan innervation och blodtillförseln är minimalt störs 36. I bådain vitro och in situ experiment, kan farmakologiska behandlingar tillämpas mer direkt utan att behöva ta hänsyn till effekterna av eventuella omgivande vävnader eller effekterna av cirkulationssystemet på de uppmätta kontraktila svar 37. Emellertid in vivo funktionstest, såsom beskrivs häri, är den minst invasiv teknik för utvärdering av muskelfunktion i dess nativa miljö 38, och kan utföras upprepade gånger över tiden (dvs i längdriktningen). Som sådant, kommer det att vara i fokus för diskussionen nedan.
I detta avseende perkutana elektroder införda nära muskeln av intresse, eller motornerven som servar det, tillhandahålla en elektrisk signal till muskeln. En givare mäter sedan de resulterande längd eller tvinga förändringar i den aktiverade muskeln som leds av en förutbestämd, anpassad programvara protokoll. Från dessa data, kan de fysikaliska egenskaperna hos muskeln bestämmas. Dessa omfattar tillce-frekvens, maximal stelkramp, tvångs hastighet, stelhet, längd spänning och trötthet. Muskel längd eller kraft kan också hållas konstant så att muskelkontrakt isometriskt eller isotoniskt. Viktigt kan dessa experimentella protokoll snabbt utföras, lätt upprepas och customized- allt medan djuret bedövas och med en återhämtningsperiod på timmar till dagar. En enda djur kan genomgå in vivo kraft testa flera gånger, vilket gör det möjligt longitudinella studier av modeller eller utvärdering av terapeutiska plattformar / teknik sjukdomar.
Som beskrivs häri, en kommersiell muskel hävstångssystem i samband med en hög effekt, är bi-fas stimulator som används för att utföra in vivo muskelfunktionstest för att utvärdera bidraget från tibialis anterior hos råtta bakbenen till dorsalflexion av foten via stimulering av peronealnerven. Vi har utvecklat ett protokoll som är särskilt utformade för att utvärdera regenerativ medicin / tissue teknik för ett muskelreparation efter traumatisk VML skada av råttan TA muskeln. Det bör noteras; EDL och HL måste dissekeras ut ur den främre crural cockpit för att specifikt utvärdera TA muskeln (de står för cirka 15-20% av den totala tibialis anterior vridmoment mätt efter peronealnerven stimulering (Corona et al., 2013) ). Eftersom detta tillvägagångssätt ger omfattande längsgående analys av muskelfysiologi / funktion, kan det sprida viktig mekanistisk insikt om många andra typer av fysiologiska undersökningar samt en mängd olika sjukdomar eller terapeutiska områden 39. Till exempel, in vivo muskelfunktionstest är tillämplig på studier av träningsfysiologi, ischemi / reperfusion forskning, myopati, nervskada / neuropati och vaskulopati, sarcopeni och muskeldystrofi 40.
Protocol
Alla djuren humant behandlade och alla protokoll godkändes av University of Virginia IACUC.
1. Förberedelse av utrustning
- Se till att alla maskiner är korrekt anslutna.
- Slå på datorn, följt av hög effekt bi-fas stimulator och dual-mode hävstångssystemet.
- Vid denna tidpunkt, placera djuret i anestesi kammaren levereras med 2% isofluran, och slå på värmeelementet så att plattformen upphettas till 37 ° C.
- Placera elektroderna i 70% etanol, så att polytetrafluoretylen (PTFE) belagda spetsarna nedsänkta och kommer att desinficeras samtidigt ställa in enheten och programvara.
- Leta upp och öppna spaken System Control på skrivbordet.
OBS: Detta kommer att vara den programvara som behövs för att utföra funktionella tester.
2. Installations
- När programmet öppnas (Figur 1A), ändra parameterns för direkt Stim under inställningsmenyn för att de önskade värdena.
OBS: I detta protokoll, alla parametrar kvar på de förinställda nivåer med undantag för "Run Time (s)", som ändras till 180 sek (Figur 1B). - Skapa en Autospara mapp under inställningsmenyn.
- Leta upp en typ kan fönstret märkt "Autospara Base". Mata in namnet på provet, till exempel "Rat1-date-tidpunkt". Direkt till vänster om "Autospara Base" typ-stånd fönster, klicka på rutan "Aktivera Autospara."
- På toppen av kontrollskärmen, välj "Sequencer". Ett nytt fönster öppnas. På botten av det nya fönstret, välj "Öppna Sequence". Ett nytt fönster öppnas. Välj färdiga sekvens och klicka på OK. Ett protokoll lista med sekvensparametrar, inklusive frekvens, varaktighet av stimuli och vilotid kommer att utvecklas i fönstret som heter: Sequence Editor (Figur 1C). Klicka på "Load Sequence" -> & #34; Close Window ".
- Att se i realtid ström och stimulans, välj "Arkiv" -> "Live Data Monitor". Ett nytt fönster öppnas.
- I den nya Live datafönstret, format skärmen för att testa med hjälp av autoscale funktionen eller manuellt ange högsta och lägsta y-värden som visas på skärmen.
3. Animal Set-up
OBS: Alla mätningar kraft är de av en 11 veckor gamla Lewis-råtta. Det finns ett linjärt samband mellan muskelmassa och styrka produktion (i Newton). Därför, såsom åldern på råtta ökar bör de kraftvärden som produceras av benet öka.
- Se till att djuret är i rätt plan anestesi innan du tar bort det ur narkosen kammaren. Helt ta bort allt hår på den laterala sidan mellan ankeln och bäcken experimentella benet med hjälp av en elektrisk hårklippare.
OBS: Det korrekta plan av anestesi uppnås när djuret is icke-reagerar för en tå nypa. Det är nödvändigt att följa de riktlinjer som tas fram av varje institution Animal Care och användning kommittén. - Placera djuret i ryggläge, vilket garanterar näsan hos djuret sitter säkert i anestesi noskon så det återstår vid tillräckligt djup anestesi.
- Reglera positionen av pedal anordningen av tre oberoende knoppar (Figur 2). Med hjälp av rattarna (A och B) för att justera på fotpedalen, placera pedalapparaten vid dess längst till vänster och lägsta läge, respektive. Detta kommer att möjliggöra korrekt placering av djurets fot medan utrymme för senare manipulationer. I detta läge använder ratten på vänster på banan för att flytta apparaten antingen mot eller längre bort från försöks så att djuret benet ligger i ett rakt plan.
- Rengör benet med tre byten av jod och alkohol. Jod bör förbli på benet under 30 sekunder.
- Justera djuret eller plattformen(Figur 2A, D), så att den förlängda benet garanterar fullständig kontakt mellan fotsulan och fotpedalen.
- Med kirurgtejp, säkra foten av djuret mot fotplattan (Figur 2D). Det är avgörande att hälen är tätt mot botten av pedalen och hela foten är platt och kommer inte att rubba från plattan under testning.
- Lokalisera klämmekanismen för att stabilisera benet. Skjut den stabiliserande tappen i tillräckligt långt för att minska rörelse av benet och låsa den på plats genom att vrida insexnyckel.
- Vid denna position, använder ratten C för att flytta anordningen antingen mot eller bort från försöksledaren så att ankeln, skenben och lårben ligger i en rak linje (figur 2C). Säkerställa att benet är parallell med fotpedalen. Gör justeringar på banan och fina rattar finns på baksidan av apparaten, att sakta ankeln så foten och skenbenet är i 90 ° position.
- continue för att flytta benet så lårbenet och skenbenet är på en 90-graders vinkelrätt vinkel (Figur 2B). Vid denna punkt, är djuret redo för elektroderna.
4. Placering av elektroderna
- Aktivera "Omedelbar Stim" genom att klicka på den orangea knappen "Direkt Stim".
- Placera båda elektrod ytligt på den proximala änden av tibialis anterior och flytta elektrodspetsarna runt tills spikes ses på den aktiva monitorn. Helst bör spikar vara cirka 0,4 N.
OBSERVERA: Elektrod bör placeras intill och vinkelrätt mot planet för peroneusnerven, vilket i sin tur, körs i sidled från knäet och vinkelrätt mot skenbenet. - Sätt en nål tillräckligt långt för att Pierce dermis, och knappt i muskelskiktet. Flytta den andra elektroden runt tills spikar ses på levande bildskärmen runt 0,6 N. Sätt nålar och klämma dem på plats med hjälp av en hobby klämma eller medicinsk tejp.
- enJ USTERA grova och finjusteringar för att hitta maximal kraft utgång.
- På hög effekt bi-fas stimulator, kommer det att finnas två rattar i mitten. En är märkt "RANGE" och den andra "Justera". Vrid "RANGE" vredet till önskad maximal strömstyrka.
OBS: Topparna kommer långsamt att öka i storlek, och den maximala strömstyrkan bestäms som den nivå där tre på varandra följande stimuli resulterar i identiska kontraktila svar. Motstå vrida strömstyrka större än nödvändigt; den maximala strömstyrkan kommer att stimulera hela muskeln att dra ihop sig, men något högre ström kommer att resultera i rekrytering av grann muskler och potentiellt antagonister också. - Vrid "ADJUST" ratten för att ange procentandelen av "RANGE" som kommer att användas för att stimulera muskeln. Vid det här laget bör kraft läsa ca 1,0 N. Detta kan kräva en ökning eller minskning av strömmen.
- Kontrollera igen elektroderna för att se till att de är säkra. SlutaOmedelbar Stim.
- På "Live Data" fönstret, klicka på "Start Sequence."
- Fortsätta att övervaka kurvorna genom att gå tillbaka till kontrollskärmen, och klicka på "Analysis" knappen ovanför orange "direkt Stim" -knappen. Tetanic kurvan ska börja ta form runt 60 Hz stimulering.
5. Efterbehandling Stimulering och städa upp
- Efter sekvensen är klar, ta bort elektroderna och torka rent med 70% alkohol. Placera elektroderna i täcket.
- Lossa knäet klämma och stänga anestesi. Ta bort djuret från anestesigas och placera djuret i liggande position, fortfarande på värmedyna. Bibehålla råtta på 100% O2 under några minuter efter det att isofluran gasen har blivit avstängd för att hålla råttan syresatt. Djuret kan röra sig i början, men inte tillbaka djuret tillbaka till buren tills djuret återfår medvetandet. Om träningsvärk är märktpå återhämtning, bör en dos av NSAID ges enligt uppgifterna från djurvård kommitté.
- Stäng av all utrustning som anges i steg 1,2, stänga programmet och fortsätter att dataanalys.
- Torka plattformen och fotpedalen.
6. Dataanalys
OBS: Dataanalys utförs för att passa en sekvens som designats av denna labb och enligt lab protokoll. Analysvärden, punkter som är viktiga data och andra aspekter av förfarandet kommer att ändras beroende på avsikten hos användaren.
- Öppna dataanalys programvara.
- Klicka på hög genomströmning menyn för att möjliggöra analys av flera datafiler (prover) i taget. Välj "Force Frequency" Analys.
- Klicka på "Välj filer" -knappen och öppna så många sparade datafiler som önskas.
- Välj "Manual" i markörplaceringsmetod rutan.
OBS: Detta gör det möjligt för användaren att analysera alla av daten inom ett önskat tidsstämpel, i motsats till programmet automatiskt välja analysen läge. - Ändra End Markör tidsstämpel värde till 2. Klicka på "Analysera" -knappen (Figur 1D).
- Om du vill spara tabellen och analysera data med hjälp av ett kalkylblad, klicka på "Spara tabell att ACSII knappen. Detta kommer att spara filen, och det kan öppnas med ett kalkylprogram vid ett senare tillfälle.
- Öppna den sparade datafilen i kalkylbladet.
- Skapa ytterligare kolumnen "Absolute Maximum", och avgöra skillnaden mellan baslinjen och maxvärden för varje prov. Detta kommer att ge den totala maximala kraft som alstras vid varje frekvens.
- För att bestämma vridmomentet, multiplicera varje kraftvärde av längden på hävarmen.
OBS: I detta fall, skulle det representeras av fotlängd av djuret. Detta protokoll använder medelvärdet experimentellt bestämda värdet på 30 mm. Användaren har nu fastställt värden för maximum vridmoment som alstras vid varje frekvens. - Rita dessa värden som en frekvensvridmomentkurva, eller, det maximala vridmomentet som produceras av djuret i alla stimuleringsfrekvenser.
OBS: Detta kan identifieras och användas som en enda jämförelse mellan prover.
Representative Results
Tetanic kurvan kan användas för att skilja optimala resultat från suboptimala resultat. Denna kurva börjar vanligtvis att bilda vid en frekvens av 60 Hz. Den viktigaste faktorn för att uppnå goda resultat är förmågan att stimulera muskeln så att den producerar sin maximala kraft och hävdar att kraft under stelkramp. Den ideala kurvan bör ha en oavbruten, skarp, vertikal uppgång vid tidpunkten för stimulering, följt av en plan platå fas med minimala svängningar, och en oavbruten, skarp vertikal nedgång perioden på terminering av stimulering (Figur 4). Avvikelser från den ideala kurvan finns indikationer på att muskeln är trött (Figur 5D) eller att muskeln inte är ordentligt stimuleras att producera maximal kraft (figur 5B - C). Det senare resulterar i allmänhet av felaktig elektrodplacering som leder till misslyckande av maximal rekrytering av muskelfibrer under stimulation. Ett utmärkande drag som gör det möjligt för forskare att avgöra om en icke-ideal kurva är resultatet av felaktig elektrodplacering eller patologiska förändringar i muskeln är huruvida tetanic kurvan är klar (smält) eller ofullständig (icke kondenserad). En icke-kondenserad, ofullständig tetanic kurvan anger att elektroderna är missriktad, vilket resulterar i muskeln inte upplever en maximal kontraktion. Ett exempel på en patologisk förändring i muskeln kan observeras som minskad maximal kontraktion jämfört med kontroll eller en kontraktila svaret som snabbare tröttar.
De tre olika typer av toppar som erhållits under loppet av detta förfarande representerar olika elektrod och benställningar och kan ses i Figur 3. De första topparna kommer att vara runt 0,4 N och förekommer när rätt elektrodplacering bestäms ytligt på huden (Figur 3A). Den andra uppsättningen av toppar har higher amplitud, vanligtvis runt 0.5-0.6N (figur 3B), och beror på elektroderna punkteras genom dermis. Efter dessa erhålls, är benet och foten justeras för att maximera kraftproduktionen, vilket uppnås när toppamplituden ökar till ungefär 1 N eller större (figur 3C). Vid denna punkt, kan Omedelbar Stim stängas av och sekvensen kan börja. Dessa riktlinjer säkerställa noggranna och reproducerbara resultat och är viktiga kontrollpunkter i hela protokollet.
De slutliga resultaten kan representeras på olika sätt beroende på den information som användaren heras från krafttestet och den experimentella utformningen. I detta protokoll, är den maximala kraften mätt över alla frekvenser av stimulering, kan dock andra datapunkter vara viktigt för en viss forskare eller applikation. Ett exempel är frekvensen av stimulering vid vilken tetanic kurvan börjar ta form. Than data kan jämföras med andra resultat som erhållits från en tidigare eller senare experiment på samma djur, eller för jämförelser mellan olika behandlingsgrupper. Force produktionen kan normaliseras genom kroppsmassa för att beräkna isometrisk kraft och ge en mer objektiv bedömning av effekterna av ålder på maximal kontraktion observeras. Även djur av olika kroppsvikt och ålder kommer att producera olika maximala krafter, bör formen på tetanic kurvan vara konsekvent mellan alla grupper när förfarandet utförs korrekt.
Figur 1: Översikt av systemet Lever Control and Data Analysis Software för analys (A) Översikt över styrprogram när du öppnar programmet.. (B) Parametrar för "direkt Stim." (C) Exempel sekvens för kraft-frekvensstimulering. (D Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kritiska aspekter för positionering av råtta och placering av foten i anordningen (A) råttan i ryggläge med vänster fot fast på fotplattan.. De räta vinklar som gjorts av foten, ben och lår är inringade. (B) Den räta vinkeln som skapas av ankeln är markerad. (C) Benet bör anpassas i en rak plan från fot till kropp. (D) Den elektrodplacering är parallella och vinkelrätt mot planet för peronealnerven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa Peaks Demonstration Vikten av rätt Elektrodplacering till maximal Force Produktion (A) Baseline topp tetanic svar observerades med elektroder placerade alltför ytligt.. (B) Större toppar med elektroder insatta på rätt plats. (C) Övergång från större toppar signalerings korrekt elektrodplacering för optimal försekvens toppamplitud som ben- och fotlägen optimalt justeras./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Optimal tetanic kurva vid 100 Hz Denna kurva ökar och minskar kraftigt och har en platt platå fas. Detta exempel visar korrekt elektrodplacering och maximal kraft stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Representativa exempel på Suboptimala Tetanic kurvor erhållna vid 100 Hz (A) Efter avkoppling, doppar denna kurva under baslinjen. Detta är ett tecken på stimuleringav antagonister. (B - D) Dessa diagram är ett resultat av felaktig elektrodplacering och ojämn rekrytering av muskelfibrer. Platåfaserna visar stora svängningar (B), en uppåtgående lutning (C), eller en nedförsbacke (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll visar en relativt enkel metod för att utföra in vivo muskelfunktionstest på den främre crural utrymme råtta bakbenen. Andra former av muskelfunktionstest, inklusive ex vivo och in situ-protokoll, kan också ge viktig information om muskelfysiologi. Men betydelsen av in vivo funktionstest ligger i dess icke-invasiv art, och det faktum att det mest exakt rekapitulerar endogena mekanismer för muskelstimulering. För både ex vivo och in situ testning, senan och / eller muskel utsätts för, och därför måste hållas fuktig eller nedsänkt 41,42. In vivo-testning bort störande variabler av trauma och inflammation som kan orsakas av de kirurgiska procedurer som krävs för in situ muskelfunktionstest; Detta är särskilt viktigt om målet med försöket är att undersöka inflammatoriska och cellulära processer
Det finns flera viktiga steg som bör noggrant utförda för att säkerställa optimala och reproducerbara experimentella resultat, det vill säga i linje maximal kraft produktionen av muskeln till en mängd olika stimuleringsparametrar. Flera av de viktigaste funktionerna beskrivs i Figur 2. Emellertid är korrekt placering och stabilitet hos den stimulerande elektroden en absolut förutsättning för reproducerbar maximal stimulering av peronealnerven. I detta avseende bör elektroderna placeras ytligt. Det vill säga om den elektrodplacering är för djup, riskerar en direkt elektrisk stimulering av antagonistmuskler, vilket minskar storleken av den observerade kontraktila svaret av den främre crural utrymmet. Vidaretvå elektroder ska placeras i så nära anslutning till varandra som möjligt för att minska den elektriska resistansen hos den omgivande huden och bindväv. I allmänhet, elektrod positionering nära knäet och mediala till benet direkt spåra kanten av tibialis anterior där den möter gastrocnemius ger ofta tillräcklig kraft produktion. Detta säkerställer också att elektroderna är placerade intill och vinkelrätt mot planet för den peronealnerven, vilket i sin tur, är vinkelrät mot skenbenet och i sidled ner benet från knäet. Men den naturliga variationen i anatomi mellan djur kräver ständig vaksamhet för att säkerställa att elektrodplacering är optimerat från fall till fall. Som sådan, det finns en viss grad av trial and error i samband med elektrodplacering som väsentligt minskar genom upplevelsen av användaren. Antalet gånger elektrod hål i huden bör minimeras för att minska svullnad och inflammation, vilket minskar migasured kraft produktion. Detta är beroende av var nålar inledningsvis placeras, men det rekommenderas att flytta nålarna två gånger eller mindre speciellt i området runt knäskålen. Slutligen, när elektroderna är placerade i benet hos djuret, mindre justeringar kan göras för att positioneringen av benet och strömmen som levereras genom elektroderna. Detta bör göras samtidigt övervaka kraften produceras från en enda ryckning. Förutom elektrodplacering, kan justeringar också göras till den spänning som levereras över elektroderna. Men i inställnings beskrivs här, är det viktigt att vara försiktig vid ökning av spänningen som ett sätt att öka kraften ut eftersom den ökade spänningen kommer att stimulera de nerver som innerverar antagonistmuskler.
Det finns tre viktiga tekniska problem som måste övervakas för att säkerställa att elektrodplacering förblir optimal. Först måste foten av sövda djur vara säkertförankrad vid fotpedalen apparaten, som mäter muskelkraften (figur 2). Om foten inte är ordentligt förankrad, kan den sanna kraften som produceras av muskeln vara ofullständigt översättas till kraftomvandlaren. Instabil fot fixering införs också risken att förlora den optimala placeringen av elektroderna som rörelse utöver normal muskelsammandragning (dvs foten rör sig bort från fotplattan) kan orsaka förskjutning av elektroderna från sin ytliga ställning eller rubba dem helt. Båda fallen minskar den uppmätta kraften. För det andra bör djurets kropp vara helt liggande och inriktade i en rak plan (Figur 2). Korrekt positionering av djuren kropp förhindrar små rörelser i benet på grund av andning, och minimerar också vridning av benet och bäckenet, vilket möjliggör bättre placering och kontinuerlig kontakt mellan de stimulerande elektroderna. För det tredje, korrekt placering och förankring av knäet är critical för att säkerställa att benet förblir stadig, och sålunda, hjälper till att stabilisera den optimala placeringen av de stimulerande elektroderna för att möjliggöra konsekvent aktivering av peronealnerven.
Det finns några ytterligare punkter som bör betonas. Först kommersiella muskelspaken som utformats för att utföra tester på vänster ben, men installationen kan modifieras för att utföra tester på höger ben samt. För det andra, kan muskel hävarmssystem väljas utifrån storleken på djuret, så att användarna ska se till att den plattform som används är tillräcklig för att mäta och stödja den kraft som produceras av djurmodell för val. Prövbara muskler för utrustning plattform är begränsade till dem som framkallar plantar förlängning eller dorsalflexion av foten. För det tredje bör det återigen understrykas att elektrodplacering kan vara utmanande och kräver tålamod och träna på att behärska tekniken. Elektroder blir också tråkig snabbt med regelbunden användning, så det är bra att ha flera reserv sets för när det blir svårt att sticka huden ytligt. För det tredje, det protokoll som beskrivs i denna rapport använder specifika stimulerings sekvenser och förfaranden för dataanalys. Muskeln spaken System Control och dataanalys programvara och data som den tillhandahåller kan svara på många andra experimentella frågor och därmed dess användbarhet sträcker sig utöver vad som beskrivs häri. Som sådan, användarna uppmanas att utforska bortom gränserna för programvaruprotokoll (s) som presenteras i detta dokument. Trots dessa mindre begränsningar, in vivo muskelfunktion testning är en kraftfull metod för att bestämma hälsa och kontraktila förmågan hos skelettmuskel, därför att den är minimalt invasiv och kan utföras vid flera tillfällen, under en längre tidsperiod, på samma djur. Kort sagt, den här typen av funktionsdugliga verktyg gör systemet särskilt skickliga på att testa effekterna av nya terapier för skelettmuskel skada eller sjukdom i råtta bakbenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
| Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
| Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
| Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
| VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
| T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
| A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
| Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
| Alcohol Swabs | |||
| 200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
| cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
| Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
| servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
| Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
| Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
| High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
| Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
| Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |
References
- Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
- Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
- Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
- Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
- d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
- Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
- Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
- Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
- Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
- Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
- Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
- Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
- Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
- Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
- Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
- Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
- Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
- Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
- Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371 (2014).
- Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
- Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
- Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
- Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
- Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167 (2011).
- Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
- Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37 (2011).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
- Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
- Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).
