Summary
Visuella chemotaxis analyser är avgörande för en bättre förståelse för hur eukaryota celler styr chemoattractant-medierad riktad cellmigration. Här beskriver vi detaljerade metoder för: 1) i realtid, hög upplösning övervakning av flera chemotaxis analyser och 2) samtidigt visualisera den kemoattraherande gradient och Spatiotemporal dynamik signalering händelser i neutrofiler liknande HL60-celler.
Introduction
Eukaryota celler känner och rör sig mot högre koncentration inom ett kemoattraherande gradient, en cellulär process kallad kemotaxi. Kemotaxi spelar kritiska roller i många fysiologiska processer, såsom embryogenes 1, neuron mönstring 2, metastas av cancerceller 3, rekrytering av neutrofiler till inflammationsställen 4, och utvecklingen av modellorganism Dictyostelium discoideum 5. I allmänhet, eukaryota celler avkänna kemoattraktanter som använder G-proteinkopplade receptorer 5. Ingreppet av kemoattraherande ämnen med dessa receptorer främjar dissociation av de heterotrimera G-proteiner Ga och Gβγ, som i sin tur aktiverar nedströms signaltransduktionsvägar som slutligen reglerar Spatiotemporal organisationen av aktincytoskelettet att driva cellmigration 5-9.
Cellbiologer har varit att utveckla och förbättra chemotaxär analyser för att undersöka hur G-proteinkopplade receptorer (GPCR) signalerar förmedlar riktad cellmigrering. Den Boyden kammare eller transwell migrationsanalys utvecklades 1960 av Boyden 10. Analysen fungerar genom att skapa en gradient av kemoattraherande föreningar mellan två brunnar som skiljs åt av ett mikroporöst membran. Dess enkelhet och användarvänlighet gör det den mest använda chemotaxis analys hittills. Emellertid analysen gör det inte möjligt den vandrande processen för de celler som skall visualiseras. Den Zigmond Kammaren är den första visuella mikroflödessystem enhet som tillåter tydlig avbildning av cellmigration på ett täck över en smal förträngning mot en källa chemoattractant 11. Dunn 12 och Insall 13 modifieras och förbättras den högupplösta och långsiktig avbildningsförmågan hos Zigmond kammar kemotaxi-analysen. På grund av de mycket förutsägbara, diffusion-dominanta egenskaper vätskeflöde har mikrofluidik varit att tillhandahålla lösningar för nästa generatipå kemotaxi analyser såsom EZ-TAXIScan (en cellrörlighet analysanordning).
Med stabiliteten i lutning garanteras gör att enheten sex kemotaxi analyser som skall utföras samtidigt (Figur 1A). I motsats till de riktnings fasta gradienter som genereras i de olika kammaranalyser ovan, nålen eller mikropipett analys utvecklad av Guenther Gerisch genererar en gradient med en rörlig källa 14. I analysen, är chemoattractant frigörs från en rörlig mikropipett för att generera en stabil gradient. Med denna nål analys, fann forskarna att olika celler genererar pseudopods med fundamentalt olika egenskaper. Tillämpa fluorescensmikroskopi, kunde vi visualisera gradienten för att underlätta kvantitativ mätning under 15. I denna studie beskriver vi detaljerade metoder för framställning av kemotaktisk HL60 (human promyelocytisk leukemi) celler, samtidigt övervaka flera kemotaxi assays med cellrörlighet analysanordningen, och visualisera de GPCR-medierad Spatiotemporal dynamiken i signalmolekyler såsom proteinkinas D1 i enstaka levande celler som svar på synliga, spatiotemporally kontrollerbara kemoattraherande stimuli. Våra avancerade avbildningsmetoder kan tillämpas på allmänna chemotaxis studier, och är särskilt lämpliga för däggdjurscellsystem.
Protocol
1. Kultur och differentiering av humant neutrofilt liknande HL60-celler
- Förbereda RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 odlingsmedium, som innehåller RPMI 1640-medium, 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat, och 25 mM HEPES (4- (2-hydroxietyl) -1 -piperazineethanesulfonic syra). Värma RPMI 1640 odlingsmedium till 37 ° C.
- Med användning av en hemocytometer bestämma celldensitet på HL60-celler för att se till att cellerna är i tillväxtfas log-fas.
OBS: Celler är oftast i logfas på den tredje dagen efter passage. Densiteten hos log-fasceller är vanligtvis 6-8 x 10 5 celler / ml. Celldensiteten som krävs för att starta en ny kultur är ca 1,5 x 10 5 celler / ml.
OBS: Till exempel, för en 10 ml ny kultur i en T-75 platt kolv, om celldensiteten av log-fasceller är 6 x 10 5 celler / ml, sedan 2,5 ml av log-fas-celler (6 x 10 5 ) späds till 1,5 x 10 5 celler / ml i 10 ml ny kultur. För att göra en slutvolym av 10 ml kultur, 7,5 ml av RPMI 1640-odlingsmedium tillsätts. - Placera den beräknade volymen av varmt RPMI 1640 odlingsmedium till en platt kolv. För en T-75 platt kolv kultur, är den totala volymen av cellkulturen 10 ml.
- Lägga den beräknade volymen av log-fas växande HL60-celler in i den platta kolven att nå en celldensitet på 1,5 x 10 5 celler / ml.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
OBS: dubbleringstid av HL60 är nästan 24 timmar. - Passage cellerna med RPMI 1640-odlingsmedium var 2-3 dagar. Det är viktigt att celldensiteten hos HL60-celler aldrig överstiger 1,5 x 10 6 celler / ml och cellpassagen inte varar längre än 2 månader.
- Differentiera HL60-celler 5 dagar före experimenten.
OBS: RPMI 1640 differentieringsmedium innehåller RPMI 1640-medium, 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat, 25 mM HEPES, och 1,3% dimetylsulfoxid (DMSO). Med andra ord är det 1,3% DMSO i RPMI 1640-odlingsmedium.- Att differentiera HL60-celler, för-värma RPMI 1640 odlingsmedium till 37 ° C. Lägga den varma RPMI 1640 odlingsmedium till en platt kolv.
- För en slutlig 10 ml HL60 differentiering kultur, tillsätt 130 ul DMSO direkt till RPMI 1640-odlingsmedium i lägenheten kolven medan virvlande flaskan så att DMSO snabbt späds ut av RPMI 1640-odlingsmedium.
- Lägg log-fas HL60-celler till en slutlig celldensitet av 1,5 x 10 5 celler / ml i en slutlig 10 ml RPMI 1640 differentieringsmedium. Kultur de HL60-celler i RPMI 1640 differentieringsmedium vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 5 dagar.
2. Beläggning Cover glasyta 4well avdelningen
- Ta flaskan med 2% gelatinstamlösning från kylskåpet, rengöra den med 70% etanol, och placera den i huven. Take en ml 2% gelatin stamlösning och returnera kvarvarande gelatinstamlösningen till kylskåpet omedelbart.
- Tillåta gelatinlösningen för att fullständigt smälta vid 37 ° C och pipettera det grundligt. Späd 2% gelatinstamlösning med 9 ml förvärmd 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) buffert till en slutlig koncentration av 0,2% gelatin.
- Tillsätt 0,5 ml eller 2 ml 0,2% gelatin i HBSS till de två mittersta brunnarna i en 4-brunnars kammare eller en 1-brunnars kammare med ett täckglas i botten, respektive. Luta plattorna i flera riktningar så att vätskan täcker hela ytarean.
- Placera plattorna i en 37 ° C inkubator. Plattorna kommer att vara redo för användning i en timme. De kan användas i upp till fem dagar. Strax före sådd celler, ta bort gelatinlösningen från 4 brunnar eller en brunnar kammare.
3. Chemotaxis analys Använda Cell Mobility analysanordning
- Förbered och värm RPMI 1640 svältande medium, vilket är RPMImedium innehållande 0,1 mM natriumpyruvat (tillval) och 25 mM HEPES.
- Förbered 100 pl 100 nM fMLP (N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin) i RPMI 1640 svältande medium.
- Förbereda 3 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) / RPMI 1640 medium som innehåller 1% BSA i RPMI 1640 svältande medium och 10 ml 0,1% BSA / RPMI 1640-medium.
- Coat en 22 mm fyrkant täckglas och en 5 | j, m cellrörlighet analysanordning chip med nyframställd 1% BSA / RPMI 1640-medium under 1 timme vid RT.
- Montera hållaren på följande sätt:
- Placerar hållaren basen med hävarmarna i det vertikala läget, så att hävarmarna kan luta mot användaren. Applicera 70% etanollösning till ytan av det 41 mm glas. Torka ytorna med en torka, noga med att inte repa dem.
- Sätt i 41 mm glas i hållaren bas. Sätt BSA-belagda 22 mm fyrkant täck ovanpå 41 mm glas i hållaren bas.
OBS: Den belagda kvadrat coverslip mellan 41 mm glas och chip tillåter chemotaxis att uppstå på underlaget av beläggningsytan. - Sätt i O-ringen (liten) i botten av brickan huset, och montera skivhuset i hållaren bas med den elliptiska hålet baktill. Dra den inre nivån av innehavaren bas fram till horisontellt läge för att låsa skivan huset på plats.
- Blåsa damm från det inre av skivan huset med en luftblåsare. Tillsätt 4 ml av 0,1% BSA / RPMI 1640-medium in i rånet huset.
- Montera BSA-belagda cellrörlighet analysanordning chip i centrum av skivan huset med den strukturella ansiktet nedåt i kontakt med glaset.
OBS: Att chipet måste sättas med positioneringsmärket (hålet i toppen av chip) på baksidan. - Anbringa gummipackningen till botten av brickan klämman genom att montera de två utsprången på gummipackningen in i hålen.
- Montera O-ringen (stor) påtoppen av brickan huset. Montera skivklämman med sensorn hålet baktill. Dra den yttre spaken av huset bas fram till horisontellt läge för att låsa skivklämman på plats.
- Efter montering av hållaren, placera botten av hållaren på ljuslådan för att bekräfta att det inte finns några luftbubblor i brunnarna. Om luftbubblor upptäcks, ta bort dem med hjälp av den medföljande plastspruta utrustad med en provladdningsspets.
- Ta bort locket och sätta enheten på plattan ovanpå cellrörlighet analysanordningen enheten. Fäst sensorblocket till innehavaren.
- Förbereda HL60-celler för Chemotaxis Assay:
- Beräkna celltäthet av differentierade HL60-celler med en hemocytometer. Efter 5 dagars differentiering, är celldensiteten cirka 1,0 x 10 6 celler / ml.
- Beräkna slutlig volym av HL60-celler vid en slutlig celldensitet av 2 x 10 6 celler / ml. Om exempelvis celldensiteten hosdifferentierade HL60-celler är 1,0 x 10 6 celler / ml, sedan 10 ml av differentierade HL60-celler kommer att återsuspenderades med 5 ml 0,1% BSA / RPMI 1640-medium för att nå 2 x 10 6 celler / ml.
- Centrifugera differentierade HL60-celler på 200 xg under 5 min vid RT. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med den beräknade volymen av 0,1% BSA / RPMI 1640-medium vid steg 3.6.2) till en slutlig celltäthet av 2 x 10 6 celler / ml.
- Starta cellrörlighet analysanordningsenhet och PC för bildtagning. Anslut enheten till datorn. Slå på cellrörlighet analysanordningen. Slå på datorn.
- Starta Cell Mobility Analysis Device Software.
- Observera 5 kontrollpaneler: kamera, värmare, skytte, memo, och kamerabilder.
- På kamerabilden kontrollpanelen använder "horisontell linje" eller "vertikal linje" för att justera hållaren / visa position i realtid för att centrera kameran i bildpanelen.
- På kontrollpanelen kameran väljer CH1 till CH6 för att flytta kameran till den definierade kanalen. För att centrera visningsfält i en kanal, klicka på "Flytta L" eller "Flytta R" för att justera X-koordinaten för kameran och centrera kamerans horisontellt.
- Justera Y-koordinaten för kameran genom att vrida läge ratten på framsidan av cellrörlighet analysanordning enheten vertikalt justera bilden för att centrera skärmen.
- På värmekontrollpanelen ställa in "innehavare temp" till 37,0 ° C och "plattan temp" till 39 ° C. Klicka på "Heat" för att starta uppvärmning. klicka även "innehavare" för att reglera temperaturen med hjälp av den termiska sensorn är ansluten till hållaren.
- På skjutpanelen anger "15 sec" på "Interval" och "30 minuter" på "Time" för intervaller och varaktigheten av kemotaxi-analysen. Kontrollera "värmaren i slutet av skytte" av säkerhetsskäl. Utse en destination för de lagrade bilderna.
- På memo panelen mata in detaljerna i experimenten, såsom cellinje som används, med eller utan behandling applicerades, och koncentrationen av kemo-attraherande tillämpas.
- Kontrollera mittläge alla kanaler som kommer att användas i försöken, och upprepa justeringen för alla kanaler om det behövs.
- Injicera och Rikta celler enligt följande:
- Ta bufferten från hållaren och ta ut 8 pl buffert från tredje väl från toppen för varje kanal.
- Använda en spruta för att injicera 2 | il av celler till den andra brunnen i samma kanal under övervakning av skärmen i realtid för att styra antalet celler och flyta under injektion. Efter det att cellerna är snyggt inriktade omedelbart lägga till 8 pl buffert tillbaka. Upprepa samma procedur för de andra kanalerna (Figur 1B).
- Tillsätt 2 ml buffert tillbaka till hållaren, och tillsätt 1 pl 100 nM fMLP till den tredje väl från toppen. Starta bildtagning och spara data. Analysera data som erhållits med hjälp av bild spåra programvara 9 (Figur 2).
4. Transfektion med Elektroporering
- Differentiera HL60-celler 5 dagar innan försöket som beskrivs i avsnitt 1. Coat fyra brunnar eller en brunnar kammare enligt anvisningarna i avsnitt 2.
- Förbereda och varmt RPMI 1640 elektroporering återställningsmedium, som innehåller RPMI 1640-medium, 20% (volym / volym) FBS, 0,1 mM natriumpyruvat, och 25 mM HEPES, till 37 ° C.
- Precis innan start av transfektionsexperiment, tillsätt antingen 300 | al eller 3 ml RPMI 1640-odlingsmedium in i brunnarna i de förbelagda 4-brunnars eller 1-brunnars kammare, respektive.
- Inkubera kamrarna i en fuktad 37 ° C inkubator med 5% CO2. Använd dessa kammare omedelbart eller lagra i inkubatorn för framtida användning (två veckor).
- Räkna celltäthet av den differentierade HL60-celler med en hemocytometer.
OBS: Den celldensiteten når ofta ca 1,0 x 10 6 celler / ml. Celldensitet större än 3,0 x 10 6 celler / ml vanligen ger oönskade transfektionseffektivitet. Som HL60-celler är suspensionsceller, ingen resuspension krävs. - Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min vid RT. Avlägsna supernatanten och återsuspendera 2 x 10 6 HL60-celler i 100 pl transfektionsreagens.
- Tillsätt 4 mikrogram av GFP-PKD 1 plasmid 9 i 100 pl blandning av celler och transfektionsreagens och blanda försiktigt och noggrant. Lägg blandningen i kyvett.
- Välj tillverkarens förinställda program för human leukocyt cellinje och utföra elektroporering.
OBS! Ytterligare information kan erhållas från tillverkarens webbplats. - Efter elektroporering, omedelbart och försiktigt lägga förvärmda 500 pl RPMI 6140 elektroporering återställningsmedium till cellerna, ochförsiktigt överföra celler från kyvetten till en 1,6 ml rör med plastpipetter som tillhandahålls.
- Inkubera cellerna i 30 min i en fuktad 37 ° C inkubator med 5% CO2. Seed 100 ^ eller 500 pl celler i en brunn på en 4-brunn eller en 1-väl kammare, respektive.
- Lägga RPMI 1640 odlingsmedium till en slutlig volym av 1 ml eller 4 ml till samma brunn i en 4-brunn eller en 1-brunnars kammare, respektive. Inkubera cellerna i en fuktad 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 3 h. Pre-varm RPMI 1640 svältande medium till 37 ° C.
- Med användning av en 1 ml pipett, försiktigt bort 0,8 ml eller 3 ml av RPMI 1640-odlingsmedium från brunnen av en 4-brunnars kammare eller en 1-brunnars kammare, respektive. Var försiktig och undvika att suga bort vidhäftande HL60-celler.
OBS: HL60 celler växer och differentieras i suspensionsmedium. Efter att ha differentierade eller med vissa behandlingar, HL60-celler vidhäfta till substratet belagd med polylysin, kollagen, gelatin, eller fibronectin. - Lägga 0,8 ml eller 3 ml av RPMI 1640 svältande mediet i brunnen av en 4-brunn eller en-brunnars kammare, respektive. Vänta en timme.
OBS: Vid denna punkt cellerna är redo för avbildning experiment 9.
5. Övervakning GPCR-medierad membran förflyttning av PKD 1 av flerkanals fluorescensmikroskopi
- Bered en färsk blandning av 100 nM fMLP och 1 mikrogram / ml Alexa 594 i RPMI 1640 svältande mediet som stimuli.
OBS: blandning av fMLP och Alexa 594 behöver vara nygjorda för att säkerställa maximal effektivitet. - Montera en 4-väl kammare ympades med celler över en 40X olja lins.
- Ställ in fluorescerande mikroskop i Multichannel konfiguration som följer:
- Ställ den gröna utsläppskanalen (500-530 nm) för GFP-märkta PKD 1, röd utsläpp kanal (580-620 nm) för chemoattractant fMLP (Alexa 594), och transmitterat ljus kanal för att identifiera vidhäftande HL60-celler.
- Start "live" förvärv ochoptimera förvärvsvillkor för de tre kanaler:
- Finjustera mellan intensitet och lasereffekt för alla tre kanaler för att minimera photobleach under en längre period av avbildning.
- Om det är nödvändigt, i genomsnitt varje två till fyra ramar för att minska bakgrundsbrusförhållandet för bättre kvalitet på bilderna. Använd en 1 sek intervall.
- Sök för att vidhäfta celler som uttrycker stark PKD 1-GFP i synen på GFP och DIC (differential interferens kontrast) kanal. Vidhäftande celler är morfologiskt plan och rör sig inte snabbt.
- Efter att ha identifierat vidhäftande HL60-celler som är mycket uttryck GFP-PKD 1, optimera förvärv tillstånd genom att sänka lasereffekt och samtidigt öka detektorförstärkningen för varje kanal för att minska photobleach för långsiktig imaging (figur 3A).
- Ta upp 100 pl fMLP / Alexa 594 lösning med en 200 l pipett och ställ åt sidan. Välj "time-lapse förvärv" och ange intervall till2 sek och antalet bildrutor att förvärva 100.
OBS: intervall och antalet bildrutor att förvärva beror på syftet med experiment. 1-2 sek mellanrum och 100 bilder används ofta för avbildningsexperiment, som visas i figur 3. För långsamt vandrande celler, längre intervaller är nödvändigt för långsiktig avbildning. I kontrast, för att snabbt migrerande celler, är kortare intervall som krävs för att observera de kontinuerliga detaljer av cellmigration. - Noggrant ta av locket på en 4-brunnars kammare så att läget av kammaren inte ändras. Starta förvärv omedelbart och förvärva 3-5 bilder av ostimulerade celler medan placera 200 ul pipett direkt över celler med ljuspunkt av laserljus som en guide.
- Pipett fMLP / Alexa 594 blandningen över cellerna avbildas med en snabb och jämnt flöde och avsluta komplett uppsättning av time-lapse förvärv. Namnge och spara de data som kommer att utsättas för ytterligare dataanalys. 6. Imaging Chemotaxing celler i synliga och kontrollerbar Chemo-attraherande Stimuli
- Med hjälp av en 10 pl micropipetter och injektions tips, återfylla en mikropipett med 30 pl nylagade blandning av fMLP och Alexa594.
- Fäst mikropipett till en mikropipett hållare monterad på toppen av ett mikroskop scenen och anslut slangen till tryckförsörjningsenheten, en anordning som åstadkommer ett konstant tryck för att frigöra fMLP / Alexa594 lösning från mikropipett för att generera en stadig lutning.
- Slå på tryckkällan och ställ in tryckkompensationen (Pc) till 70 hPa.
- Montera en 1-väl kammartäck ympades med HL60-celler som uttrycker PKD 1-GFP över en 40X olja objektiv på en konfokalmikroskop eller motsvarande fluorescerande mikroskop.
- Ställ förvärv i kanalläge i följande konfiguration: gröna kanalen (500-530 nm) för GFP-märkta PKD 1; röda kanalen (580-620 nm) för chemoattractant fMLP (Alexa594); och transmitted ljuskanal för att identifiera vidhäftande HL60-celler.
- Start "live" förvärv och optimera förvärvsvillkor för de tre kanalerna: justera intensiteten hos varje kanal för kvantitativ analys av bilddata; finjustera mellan intensitet och lasereffekt för alla tre kanaler för att få bilder med bästa kvalitet och minimera foto blekmedel. Om det är nödvändigt, i genomsnitt var två till fyra ramar för bättre bildkvalitet. Vi brukar använda en 1 sek intervall.
- Start "live" förvärv och söka efter vidhäftande celler som uttrycker stark PKD 1-GFP i synen på GFP och överförda ljuskanaler. Med hjälp av ljusfält optik, centrum mikropipett i centrala synfältet (Figur 4A) för att visualisera fMLP gradienten och de vidhäftande HL60-celler som uttrycker PKD 1-GFP.
- Välj tidsförlopp förvärv och ange intervallen till 2 sek intervall och antalet bildrutor att förvärva 100.
OBS: Efter att samla varje tIME-lapse serien, namn och spara de data som kommer att utsättas för ytterligare dataanalys.
Representative Results
Samtidig avbildning av kemotaxi av flera HL60-celler med hjälp av cellrörlighet analysanordning
Baserat på principen om mikrofluidik 16, har tillverkaren förutsatt simulerade profiler av gradienter: en gradient genereras inom en minut, stabiliseras inom 5 minuter, och hölls under två timmar. De i hög grad förutsägbara profilerna för de stabila gradienter genereras av mikrofluidik tillåta flera av kemotaxi-analyser som skall utföras samtidigt. I föreliggande studie observerade vi tre samtidiga kemotaxi-analyser (Figur 2A och film 1). Vi fann att HL60-celler började chemotaxing omedelbart efter det kemoattraherande injicerades in i brunnen av kemoattraherande, och hålls chemotaxing på en rak väg för följande 60 min, i överensstämmelse med simuleringsresultaten för gradient stabilitet. Spåra rörelsebanan och morfologiav cellerna möjliggör kvantitativa mätningar och efterföljande jämförelse av kemotaxi beteenden med hjälp av en kemotaxi index som inkluderar totala banlängden, hastighet, riktverkan, och rundhet av cellerna (figur 2b). Totala banlängden är summan av längderna av de linjesegment som förbinder centroider av banan. Hastighet erhålls genom att dividera den totala väglängden av tiden. Rikt mäts uppåt och definieras som: (Y-koordinat för slutet av sökvägen minus Y-koordinat början) dividerat med totala banlängden. Detta ger 1,0 för ett föremål som rör sig direkt uppåt. Rundhet i cellen är ett mått (i procent) av hur effektivt en given mängd av omkretsen omsluter området. En cirkel har det största området för en given omkrets och har en rundhet parameter 100%. En rak linje omsluter inget område och har en rundhet parameter på 0%. Vi visar kvantitativt mätt kemotaxi beteende som beskrivs av de valda chemotaxis parametrar(Figur 2C).
Övervakning PKD subcellulär lokalisering i HL60 celler under en spatiotemporally synlig och kontrollerbar fMLP stimulans
Det är en stor teknisk förväg för att tillämpa fluorescerande och kontrollerbar chemoattractant stimulering till ett experimentellt system. Historiskt sett har vi tillämpat antingen homogen (även kallad uniform) stimulering eller gradient stimulering för att observera cellsvar och beteenden. Men "blind" stimulering ger inte bara ingen Spatiotemporal information om hur stimulans når cellerna, men också ifrågasätter några "onormala" observationer av cell svar på stimulering, helt enkelt eftersom vi inte ser stimulans. Vi har tidigare visat att fluorescerande färgämne (Alexa594) kan appliceras med chemoattractant att etablera ett linjärt förhållande mellan chemoattractant koncentration och monitored fluorescerande färgämne intensitet 15. Med en konfiguration förvärv av grönt fluorescerande protein (GFP), en röd emission av fluorescerande färgämne (Alexa594), och transmitterat ljus, har vi möjlighet att övervaka de vidhäftande cellerna, tillämpningen av stimulus, och cellen som svar på stimulus (figur 3A). Proteinkinas D är en familj av serin / treoninkinaser som spelar viktiga roller i riktad cellmigrering 9,17. Som svar på ett enhetligt sätt fMLP (röd) stimulering, HL60-celler förmedlar en robust membrantranslokation av GFP-märkta proteinkinas D1 (grön) (Figur 3B och film 2). I en fMLP gradient (röd) (Figur 4A), HL60-celler aktivt rekrytera PKD 1 till framkanten (figur 4B och Movie 3). En nära jämförelse av subcellulära lokalisering av GFP i den utskjutande delen av framkanten indikerar att PKD 1 lokaliserar på baksidan av framkanten (Figur 4C).
Figur 1. Cell rörlighet analysanordning tillåter upp till 6 samtidiga kemotaxi-analyser. (A) Schema visar utformningen av en cell rörlighet analysanordning chip för samtidig övervakning av 6 oberoende av kemotaxi-analyser. Röda visar kemoattraherande sattes till brunnarna. (B) Införande av HL60-celler till brunnarna av celler medan kemoattraktanten diffunderar att etablera en stadig fMLP gradient. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Samtidig övervakning av flera av kemotaxi-analyser med HL60-celler. (A (B) Scheme visar rese väglängden och morfologi spåras HL60-celler. (C) Kvantifiering av kemotaxi som total väglängd, hastighet, riktverkan, och rundhet. Medelvärde ± SD visas; n = 10, 12 eller 11 utan lutning, fMLP gradient utan CID755673 behandling, och fMLP behandling med CID755673 behandling, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GPCR-medierad robusta membrantranslokation av PKD 1 som svar på enhetligt tillämpade fMLP stimuli. (A) Multichannel övervakning av PKD 1-GFP (grönt), chemoattractant (1 ^ M fMLP blandades med 0,1 | j, g / ml fluorescerande färg Alexa 594, red) och DIC (differential interferens kontrast) för att identifiera de vidhäftande HL60-celler i en brunn i en 4well kammare belagd med 0,2% gelatin i RPMI 1640-medium. Skalstreck = 10 | im. (B) Montage visar att ett enhetligt sätt fMLP (röd) inducerar robust membrantranslokation av PKD 1-GFP (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 4. Framkants lokalisering av PKD 1 i chemotaxing HL60-celler. (A) Kanalläge förvärvs konfiguration underlättar visualisering av fMLP-gradient och de spatiotemporala dynamiken i PKD1. I A - C, HL60 celler uttryckte gående GFP-märkta PKD 1; att visualisera fMLP-gradient som genereras från en mikropipett (DIC), 100 nM fMLP (Röd) blandades med 0,1 | j, g / ml fluorescerande färg Alexa 594. (B) Anrikat lokalisering av PKD 1 vid den främre kanten av chemotaxing cellen. Skalstreck = 10 | im. (C) sammanslagna bilderna visar att PKD 1 lokaliserar på baksidan av framkanten i HL60-celler. Grön visar PKD 1 cellulär lokalisering, och DIC bilden visar den utskjutande området av framkanten. Skalstreck = 5 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I föreliggande studie visar vi två exempel på kemotaxi analyser: först, samtidig övervakning av flera av kemotaxi-analyser av cellrörlighet analysanordningen; och andra, visualisering av chemoattractant lutning och Spatiotemporal dynamik signalering händelser i samma celler i realtid.
Cellrörlighet analysanordning för flera samtidiga chemotaxis analyser
I den aktuella studien, införde vi ett detaljerat protokoll för att utföra flera samtidiga chemotaxis analyser med hjälp av en cell rörlighet analysanordning. Denna enhet gör att användaren kan observera cellulära chemotaxis beteende med en 10X objektiv i konventionella ljusfälts observation. På grund av de diffusions-dominanta egenskaper hos fluidflödet, genererar cellrörlighet analysanordningen mycket förutsägbara, stabila gradienter och tillåter upp till sex kemotaxi-analyser som skall utföras samtidigt. De kritiska stegen i protokollet äratt få tillförlitliga gradienter och anpassa cellerna på terrassen linjen. Användaren ska strikt följa tillverkarens anvisningar för hållaraggregatet och injektion av kemoattraherande ämnen och celler. Detaljerade anvisningar finns också på nätet. Jämfört med alternativa chemotaxis metoder 11-13,15, enheten avsevärt förbättrar tillförlitligheten och effektiviteten i kemotaxi analyser. Fyra storlekar av cellrörlighet analysanordning chip i storlekar 4, 5, 6, och 8 pm finns tillgängliga för att tillgodose olika typer och storlekar av celler. Vi funnit att en 4 eller 5 | j, m cellrörlighet analysanordning chip är lämplig för HL60 och D. discoideum-celler, som är omkring 10 till 15 ^ m i diameter. Emellertid är en begränsning att denna anordning inte är lämplig för alla typer av celler. Vi hade lite framgång med cellrörlighet analysanordningen kemotaxi analys med Raw267.4 celler. Orsaken kan vara att Raw267.4 celler migrerar alltför långsamt. Den tid som krävs för effektiv chemotaxis av Raw267.4 celler kan vara mycket längre än den tid som en gradient upprätthålls av enheten. Istället arbetade en Transwell migration analysbrunn för Raw267.4 celler 9. En annan begränsning är att fluorescerande observation är inte möjligt med den aktuella enheten. En framtida inriktning är att övervaka fluorescerande avbildning med högre förstoring. Detta är möjligt med den förbättrade cellrörlighet analysanordning, som är utrustad med fluorescensdetektion och en 100X objektivlins. Dessutom är antalet samtidiga analyser också ökat till 12. Alla dessa förbättringar underlättar förbättrad genomströmning av kemotaxi analyser och observation av subcellulära dynamik i migrera celler.
Hög transfektionseffektivitet av HL60-celler för att uttrycka fluorescerande protein-taggat protein
HL60-celler är en aktivt delande leukemi-cellinje och växa i suspension. Som tidigare rapporterats 18-20, HL60-celler är resistenta mot gene överföring. Både lipid och elektroporering genöverföring har testats, och högre effektivitet transfektion erhölls med elektroporering, såsom beskrivs i detalj i avsnitt 4. Få hög viabilitet efter elektroporering är kritisk för att erhålla hög transfektion effektivitet på grund av de allvarliga skador som är resultatet av elektroporering. Därefter noggrann och varsam hantering cell krävs, särskilt efter elektroporering. Alla medier måste vara förvärmd och försiktigt till cellerna i varje steg efter elektroporering. Det är även kritiskt att minimera exponeringstiden för celler till elektroporation reagenset. För att undvika celldöd efter elektroporering, RPMI 1640 elektroporering återställningsmedium måste läggas till cellerna omedelbart. Vi fann att 20% FBS i återställningsmedium ger en mycket högre cell återvinningsgrad än 10% FBS. Efter elektroporering, är avgörande för ökad lönsamhet och transfektion inkubation i RPMI 1640 elektroporering återställningsmedium under 30 minutereffektivitet. För att ytterligare öka transfektionseffektiviteten, använde vi även 4 | j, g plasmid-DNA per transfektion, vilket är nästan två gånger mängden av plasmiden som rekommenderas av tillverkaren.
Det finns två stora begränsningar på elektroporering transfektion: den KORTVARIGHET av proteinuttryck och mobilnummer gränsen (2 x 10 6 celler per transfektion). I odifferentierade celler, är uttryck detekterbara endast under de första celldelningar, eftersom vektorplasmiden späds med hälften efter varje celldelning. För differentierade HL60 celler överlever inte mer än 48 timmar. Som ett resultat, kräver något experiment färska transfektioner 6 h före experimentet. Cellantalet för en elektroporering endast uppfyller minimikravet för alla biokemiska analyser. För att upprepad användning eller stor mängd, är det starkt rekommenderat att en odifferentierad HL60-cellinje etableras som stabilt uttrycker proteinet av intresse which har märkts med ett fluorescerande protein genom en virusvektor, om en viral vektor är tillgänglig eller kan konstrueras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1 M HEPES sterile solution, pH 7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
| Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
| NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
| AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
| Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| 2% Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
| Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
| fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
| Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
| EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
| EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
| 1701RN 10 μl syringe | Hamilton | 80030 | |
| Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
| TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
| DIAS software | Solltech Inc. | ||
| LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |
References
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
- Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Zigmond, S. H.
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
- Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
- Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N.
- Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309 (2010).
- Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
- Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
- Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).
- Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).
