Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging G-protein-koblet receptor-medieret Kemotaksi og dens signaleringshændelser i Neutrofil-lignende HL60-celler

Published: September 14, 2016 doi: 10.3791/54511
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

Visuelle kemotaksiassays er afgørende for en bedre forståelse af, hvordan eukaryote celler styrer kemoattraktant-medieret retningsbestemt cellevandring. Her beskriver vi detaljerede metoder til: 1) realtid, høj opløsning overvågning af flere kemotaksiassays, og 2) samtidig visualisering af kemoattraktant gradient og spatiotemporale dynamik signalering begivenheder i neutrofil-lignende HL60 celler.

Introduction

Eukaryote celler sanse og bevæge sig mod den højere koncentration inden for en kemoattraktant gradient, en cellulær proces benævnt som chemotaxis. Kemotaksi spiller kritiske roller i mange fysiologiske processer, såsom embryogenese 1, neuron mønsterdannelse 2, metastase af cancerceller 3, rekruttering af neutrofiler til inflammationssteder 4, og udvikling af modelorganismen Dictyostelium discoideum 5. Generelt eukaryote celler fornemmer kemoattraktanter vha G-proteinkoblede receptorer 5. Indgrebet af kemoattraktanter med disse receptorer fremmer dissociation af de heterotrimere G-proteiner Ga og Gβγ, som igen aktiverer nedstrøms signaltransduktionsveje der i sidste ende regulerer Spatiotemporal organisering af actincytoskelettet at drive cellemigrering 5-9.

Cell biologer har været at udvikle og forbedre chemotaxer analyser at undersøge, hvordan G-protein-koblede receptor (GPCR) signalering medierer rettet celle migration. Den Boyden kammer eller transwell migration assay blev udviklet i 1960 af Boyden 10. Assayet fungerer ved at oprette en gradient af kemotiltrækkende forbindelser mellem to brønde, der er adskilt af en mikroporøs membran. Dens enkelhed og brugervenlighed gør det til det mest udbredte kemotaksiassay til dato. Men for at assayet ikke gør det muligt at migrere processen af ​​cellerne visualiseres. Den Zigmond kammer er den første visuelle mikrofluid anordning, der tillader tydelig billeddannelse af cellemigrering på et dækglas over en smal indsnævring mod en kilde kemoattraktant 11. Dunn 12 og Insall 13 modificeret og forbedret høj opløsning og langsigtet billeddannelse evne Zigmond kammer kemotaksi assay. På grund af de meget forudsigelige, diffusion-dominerende karakteristika væskestrøm, har mikrofluidik været at levere løsninger til næste-Generatipå kemotaksiassays såsom EZ-TAXIScan (en celle mobilitet analyseindretning).

Med stabiliteten af gradienten sikret, indretningen tillader seks kemotaksiassays der skal udføres samtidigt (figur 1A). I modsætning til de retningsbestemt faste gradienter frembragt i de forskellige kammer assays ovenfor, nålen eller mikropipette assay udviklet af Guenther Gerisch genererer en gradient med en bevægelig kilde 14. I assayet er kemoattraktant frigives fra en bevægelig mikropipette til at generere en stabil gradient. Med denne nål assay, fandt forskerne, at forskellige celler genererer pseudopodier med fundamentalt forskellige karakteristika. Anvendelse fluorescerende mikroskopi, var vi i stand til at visualisere gradienten at lette kvantitativ måling i hele 15. I denne undersøgelse beskriver vi detaljerede fremgangsmåder til fremstilling af kemotaktisk HL60 (human promyelocytisk leukæmi) celler, samtidig overvågning af flere kemotaksi ASSAys med cellen mobilitet analyseindretningen, og visualisere GPCR-medieret spatiotemporale dynamik signalmolekyler såsom protein kinase D1 i enkelte levende celler som reaktion på synlige, spatiotemporally styrbare kemotiltrækkende stimuli. Vores avancerede imaging metoder kan anvendes til generelle kemotaksi undersøgelser, og er især egnede til mammale cellekulturer.

Protocol

1. Kultur og Differentiering af human neutrofil-lignende HL60 celler

  1. Forbered RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 dyrkningsmedium, der indeholder RPMI 1640-medium, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat og 25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazineethanesulfonic syre). Varm RPMI 1640 dyrkningsmedium til 37 ° C.
  2. Anvendelse af et hæmocytometer bestemme celledensitet på HL60-celler for at sikre, at cellerne er i log-vækstfase fase.
    BEMÆRK: Celler er normalt i log-fase på den tredje dag efter passage. Densiteten af log-fase-celler er sædvanligvis 6-8 x 10 5 celler / ml. Celledensiteten kræves for at starte en ny kultur er omkring 1,5 x 10 5 celler / ml.
    BEMÆRK: For eksempel til et 10 ml ny kultur i en T-75 flad kolbe, hvis celledensiteten af log-fase-celler er 6 x 10 5 celler / ml, derefter 2,5 ml af log-fase-celler (6 x 10 5 ) fortyndes til 1,5 x 10 5 celler / ml i 10 ml ny kultur. At foretage en endelig volumen på 10 ml kultur, 7,5 ml RPMI 1640 dyrkningsmedium tilsættes.
  3. Placer beregnede mængde varme RPMI 1640 dyrkningsmedium til en flad kolbe. For en T-75 flad kolbe kultur, det samlede volumen af ​​cellekulturen er 10 ml.
  4. Tilsæt beregnede mængde log-fase voksende HL60-celler ind i lejligheden kolbe at nå en celledensitet på 1,5 x 10 5 celler / ml.
  5. Inkuber cellerne ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.
    BEMÆRK: fordoblingstid på HL60 er næsten 24 timer.
  6. Passage af cellerne med RPMI 1640 dyrkningsmedium hver 2-3 dage. Det er vigtigt, at celledensiteten af HL60-celler aldrig overstiger 1,5 x 10 6 celler / ml og cellen passage varer længere end 2 måneder.
  7. Differentiere HL60 celler 5 dage før forsøgene.
    BEMÆRK: RPMI 1640 differentiering medium indeholder RPMI 1640-medium, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat, 25 mM HEPES, og 1,3% dimethylsulfoxid (DMSO). Med andre ord er det 1,3% DMSO i RPMI 1640 dyrkningsmedium.
    1. At differentiere HL60-celler, pre-opvarme RPMI 1640 dyrkningsmedium til 37 ° C. Tilsæt varm RPMI 1640 dyrkningsmedium til en flad kolbe.
    2. For en endelig 10 ml HL60 differentiering kultur, tilsættes 130 ul DMSO direkte til RPMI 1640 dyrkningsmedium i det flade kolbe, medens kolben hvirvlende således at DMSO fortyndes hurtigt ved RPMI 1640 dyrkningsmedium.
    3. Tilføj log-fase HL60-celler til en endelig celletæthed på 1,5 x 10 5 celler / ml i en endelig 10 ml RPMI 1640 differentiering medium. Kultur de HL60-celler i RPMI 1640 differentiering medium ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 i 5 dage.

2. Belægning dækglasset overflade 4well Afdeling

  1. Tag flaske 2% gelatine stamopløsning fra køleskabet, rengøre den med 70% ethanol, og læg den i hætten. Take 1 ml 2% gelatine stamopløsning og straks returnere den resterende gelatine stamopløsning til køleskabet.
  2. Tillad gelatineopløsningen til helt flydende ved 37 ° C og pipette det grundigt. Fortynd 2% gelatine stamopløsning med 9 ml forvarmet 1x Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) buffer til en slutkoncentration på 0,2% gelatine.
  3. Tilsæt 0,5 ml eller 2 ml 0,2% gelatine i HBSS til de to midterste brønde i en 4-brønds kammer eller en 1-brønds kammer med et dækglas i bunden hhv. Vippe pladerne i flere retninger, således at væsken dækker hele overfladen.
  4. Placer pladerne i en 37 ° C inkubator. Pladerne vil være klar til brug i 1 time. De kan anvendes i op til 5 dage. Lige før såning celler, fjern gelatineopløsningen fra 4-brønds eller 1-brønds kamre.

3. kemotaksiassay Brug Cell Mobility analyseindretning

  1. Forberede og varme RPMI 1640 sultende medium, som er RPMImedium indeholdende 0,1 mM natriumpyruvat (ekstraudstyr) og 25 mM HEPES.
  2. Fremstilling af 100 pi 100 nM fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin) i RPMI 1640 sultende medium.
  3. Forbered 3 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) / RPMI 1640 medium, der indeholder 1% BSA i RPMI 1640 sultende medium og 10 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium.
  4. Coat en 22 mm kvadratisk dækglas og en 5 um celle mobilitet analyseindretning chip med frisk fremstillet 1% BSA / RPMI 1640 medium i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Saml Indehaveren på følgende måde:
    1. Placer holderen base med håndgrebene i den lodrette stilling, således at armene kan vippe mod brugeren. Påfør 70% ethanolopløsning til overfladen af ​​den 41 mm glas. Tør forsigtigt overfladen med en serviet, pas på ikke at ridse dem.
    2. Sæt 41 mm glas i holderen base. Sætte BSA-overtrukne 22 mm kvadratisk dækglas oven på 41 mm glas i holderen base.
      BEMÆRK: belagte torv coverslip mellem 41 mm glas og chippen tillader kemotaksi at opstå på substratet af overtrækket overflade.
    3. Sæt O-ring (lille) ind i bunden af ​​skiven boliger, og montere skiven huset i holderen base med den elliptiske hul bagtil. Træk indre plan af holderen basen frem til vandret stilling for at låse skiven boliger i position.
    4. Blæs støv fra det indre af wafer hus med en luft duster. Tilsæt 4 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium ind i wafer huset.
    5. Monter BSA-coatede celle mobilitet analyseindretning chip i midten af ​​skiven hus med den strukturelle ansigtet nedad i kontakt med glasset.
      BEMÆRK: der skal indsættes med anbringelsesmarkering (hullet i toppen af ​​chip) bag chippen.
    6. Anbringer gummipakningen til bunden af ​​skiven klemmen ved at montere de to fremspring på gummipakningen i hullerne.
    7. Monter O-ringen (stor) påtoppen af ​​wafer boliger. Monter wafer klemme med hullet sensor bagtil. Træk den ydre arm af huset basen frem til vandret stilling for at låse skiven klemme på plads.
    8. Efter montering indehaveren, placere bunden af ​​holderen på lyskassen for at bekræfte, at der ikke er luftbobler i brøndene. Hvis der registreres luftbobler, fjerne dem ved hjælp af den medfølgende plastik sprøjte forsynet med en prøve lastning tip.
    9. Fjern låget og sætte samlingen på pladen på toppen af ​​cellen mobilitet analyseindretningen enhed. Fastgør sensoren blok til indehaveren.
  6. Forbered HL60-celler til kemotaksiassay:
    1. Beregn celledensiteten af ​​de differentierede HL60-celler med en hæmocytometer. Efter 5 dages differentiering, celledensiteten er omkring 1,0 x 10 6 celler / ml.
    2. Beregn slutvolumen på HL60-celler ved en endelig celletæthed på 2 x 10 6 celler / ml. For eksempel, hvis celledensiteten afdifferentierede HL60-celler er 1,0 x 10 6 celler / ml, derefter 10 ml af differentierede HL60-celler vil blive resuspenderet med 5 ml 0,1% BSA / RPMI 1640-medium for at nå 2 x 10 6 celler / ml.
    3. Centrifuger differentierede HL60-celler ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes med den beregnede mængde af 0,1% BSA / RPMI 1640 medium ved trin 3.6.2) til en endelig celletæthed på 2 x 10 6 celler / ml.
  7. Start cellen mobilitet analyse enhed enhed og PC til erhvervelse billede. Slut enheden til pc'en. Tænd celle mobilitet analyseindretningen. Tænd for pc'en.
  8. Start Up Cell Mobility Analysis Device Software.
    1. Overhold 5 kontrolpaneler: kamera, varmelegeme, skydning, memo, og kamerabilleder.
    2. På kameraets billede kontrolpanel, bruge "Vandret linje" eller "Lodret linje" for at justere holderen / view position i realtid for at centrere kameraet i panelet kameraet billedet.
    3. På kameraets kontrolpanel, skal du vælge CH1 til CH6 at flytte kameraet til den definerede kanal. For at centrere visning områderne en kanal, skal du klikke på "Flyt L" eller "Flyt R" for at justere X-koordinat af kameraet og centrere kameraets position vandret.
    4. Juster Y-koordinat af kameraet ved at dreje position knappen på frontpanelet af cellen mobilitet analyseindretningen enhed til lodret justere billedet for at centrere skærmen.
    5. På varmeren kontrolpanelet, indstille "holder temp" til 37,0 ° C, og den "plade temp" til 39 ° C. Klik på "Heat" for at starte opvarmningen. klik Også "indehaver" for at styre temperaturen ved hjælp af den termiske sensor tilsluttet til indehaveren.
    6. På skyderiet panel, skal du indtaste "15 sec" på "Interval" og "30 minutter" på "Time" for intervallerne og varigheden af ​​kemotaksiassay. Check "varmelegeme i slutningen af ​​skydning" af sikkerhedsmæssige årsager. Udpeg en destination for de lagrede billeder.
    7. På memo panelet, input detaljerne i forsøgene, såsom cellelinje anvendes, uanset om behandlingen blev anvendt, og koncentrationen af ​​kemo-lokkemidler anvendt.
    8. Bekræft midterpositionen af ​​alle de kanaler, der vil blive anvendt i eksperimenterne, og gentag justeringen for alle kanaler, hvis nødvendigt.
  9. Sprøjt og Juster Celler som følger:
    1. Fjern bufferen fra holderen, og tag 8 pi puffer fra den tredje brønd fra toppen for hver kanal.
    2. Brug en sprøjte til at injicere 2 pi celler ind i den anden brønd i den samme kanal under overvågning af skærmen i realtid at kontrollere celleantal og flow under injektion. Efter at cellerne er pænt på linie, straks de 8 pi puffer tilbage. Gentag den samme procedure for de andre kanaler (Figur 1B).
  10. Tilsæt 2 ml buffer tilbage til indehaveren, og der tilsættes 1 pi 100 nM fMLP til den tredje brønd fra toppen. Start erhvervelse billede og gemme dataene. Analyser data opnået ved hjælp af billede sporing software 9 (figur 2).

4. Transfektion med Elektroporering

  1. Differentiere HL60 celler 5 dage før eksperimentet, som beskrevet i afsnit 1. Coat 4-brønds eller 1-brønds kamre som anvist i afsnit 2.
  2. Forberede og varm RPMI 1640 elektroporering recovery medium, der indeholder RPMI 1640-medium, 20% (vol / vol) FBS, 0,1 mM natriumpyruvat og 25 mM HEPES, til 37 ° C.
  3. Lige før start af transfektion eksperiment, tilføje enten 300 ul eller 3 ml RPMI 1640 dyrkningsmedium i brøndene på de forud overtrukne 4-brønds eller 1-brønds kamre, henholdsvis.
  4. Inkuber kamrene i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Brug disse kamre straks eller opbevares i inkubatoren til fremtidig brug (to uger).
  5. Tæl celle tæthed af den differentierede HL60-celler med en hæmocytometer.
    BEMÆRK: celledensitet ofte når ca. 1,0 x 10 6 celler / ml. Celletæthed større end 3,0 x 10 6 celler / ml normalt giver uønsket transfektionseffektivitet. Som HL60-celler er suspensionsceller, er ingen resuspension påkrævet.
  6. Centrifuger cellerne ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspender 2 x 10 6 HL60 celler i 100 pi transfektionsreagens.
  7. Tilsæt 4 ug af GFP-pKD1 plasmidet 9 ind i 100 pi blanding af celler og transfektionsreagenser og blandes forsigtigt og grundigt. Tilsæt blandingen ind i kuvetten billede.
  8. Vælg producentens forudindstillede program for human leukocyt-cellelinien og udfører elektroporering.
    BEMÆRK: Yderligere oplysninger fås fra producentens websted.
  9. Efter elektroporering, straks og forsigtigt tilføje forvarmet 500 pi RPMI 6140 elektroporering recovery medium til cellerne, ogforsigtigt overføre cellerne fra kuvetten til en 1,6 ml rør med plastpipetter forudsat.
  10. Inkubér cellerne i 30 minutter i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Seed 100 pi eller 500 pi celler i en brønd af en 4-brønd eller en 1-brønds kammer, henholdsvis.
  11. Tilføj RPMI 1640 dyrkningsmedium til et endeligt volumen på 1 ml eller 4 ml til samme brønd af en 4-brønd eller en 1-brønds kammer, henholdsvis. Inkubér cellerne i en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 3 timer. Pre-varm RPMI 1640 sultende medium til 37 ° C.
  12. Ved hjælp af en 1 ml pipette, forsigtigt fjerne 0,8 ml eller 3 ml RPMI 1640 dyrkningsmedium fra brønden af ​​en 4-brønd kammer eller en 1-brønd kammer, hhv. Være blid og undgå sutte væk adhærerende HL60-celler.
    BEMÆRK: HL60 celler vokser og differentieres i suspension medier. Efter at være blevet differentieret eller med visse behandlinger, HL60-celler klæbe til underlaget overtrukket med polylysin, collagen, gelatine eller fibronectin.
  13. Tilføj 0,8 ml eller 3 ml RPMI 1640 sultende medium i brønden af ​​en 4-brønd eller 1-brønds kammer, henholdsvis. Vent en time.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt er cellerne klar til billeddannelse eksperimenter 9.

5. Overvågning GPCR-medieret Membrane Translokation af pKD1 af flere kanaler Fluorescent Microscopy

  1. Forbered en frisk blanding af 100 nM fMLP og 1 pg / ml Alexa 594 i RPMI 1640 sultende medium som stimuli.
    BEMÆRK: blanding af fMLP og Alexa 594 behov for at være frisk gjort for at sikre maksimal effektivitet.
  2. Mount on-4-brønds kammer podet med celler over en 40X olie linse.
  3. Sæt Fluorescent mikroskop i Multichannel Konfiguration som følger:
    1. Indstil den grønne emission kanal (500-530 nm) for GFP-mærkede pKD1, rød emission kanal (580-620 nm) for kemoattraktant fMLP (Alexa 594), og transmitteret lys kanal til at identificere vedhængende HL60 celler.
    2. Start "live" erhvervelse ogoptimere erhvervelse forhold i de tre kanaler:
    3. Finjuster mellem intensitet og laser strøm til alle tre kanaler for at minimere photobleach for en længere periode med billeddannelse.
    4. Om nødvendigt gennemsnit hver 2 til 4 frames at mindske baggrunden støjforholdet for bedre kvalitet af billederne. Brug en 1 sek interval.
  4. Søgning efter vedhængende celler, der udtrykker stærk pKD1-GFP i visningen af ​​GFP og DIC (differential interferens kontrast) kanal. Vedhængende celler er morfologisk flade og ikke bevæger sig hurtigt.
  5. Efter at have identificeret vedhængende HL60-celler, der stærkt express GFP-pKD1, optimere erhvervelse tilstand ved at sænke lasereffekten samtidig øge detektoren forstærkning for hver kanal for at formindske photobleach for langsigtet billeddannelse (figur 3A).
  6. Tag 100 ul fMLP / Alexa 594 løsning med en 200 pi pipette og der er afsat. Vælg "time-lapse erhvervelse" og indstil intervallerne til2 sek og antallet af billeder til at erhverve til 100.
    Bemærk: intervaller og antal rammer til at erhverve, afhænger af formålet med forsøgene. 1-2 sec intervaller og 100 billeder anvendes ofte til billeddannelse eksperimenter, som i figur 3. For langsomt migrerende celler, længere mellemrum er nødvendige for langsigtet billeddannelse. I modsætning til hurtig migrerende celler, er kortere mellemrum kræves for tilsyn med kontinuerlige detaljer af cellemigrering.
  7. Omhyggeligt tage låget af en 4-brønds kammer, så at positionen af ​​kammeret ikke ændres. Start erhvervelse straks og erhverve 3-5 billeder af ustimulerede celler, mens placering af 200 pi pipette direkte over cellerne under anvendelse stedet af laserlys som vejledning.
  8. Pipette fMLP / Alexa 594 blandingen over de celler, der afbildes med en hurtig og jævnt flow og afslutte komplet sæt af time-lapse erhvervelsen. Navngiv og gem data, der vil blive udsat for yderligere analyse af data.
    9. 6. Imaging Chemotaxing Celler i Synlige og kontrollerbare kemo-lokkemiddel stimuli

    1. Ved hjælp af en 10 pi micropipetter og injektion tips, opfyldning en mikropipette med 30 pi frisklavede blanding fMLP og Alexa594.
    2. Fastgør mikropipette til en mikropipette holder monteret på toppen af ​​et mikroskop scenen og tilslut slangen til trykforsyning enhed, et apparat, som giver et konstant tryk for at frigive fMLP / Alexa594 opløsningen fra mikropipette til at generere en stabil gradient.
    3. Tænd for pres udbud og indstil trykudligning (Pc) til 70 hPa.
    4. Monter en 1-godt kamre dækglas podet med HL60 celler, der udtrykker pKD1-GFP over en 40X olie linse på en konfokal mikroskop eller tilsvarende fluorescerende mikroskop.
    5. Set erhvervelse i kanal mode i følgende konfiguration: grønne kanal (500-530 nm) for GFP-mærkede pKD1; rød kanal (580-620 nm) for kemoattraktant fMLP (Alexa594); og transindgivet lys kanal til identificering adhærerende HL60-celler.
    6. Start "live" køb og optimere erhvervelse betingelser for de tre kanaler: justere intensiteten af ​​hver kanal til kvantitativ analyse af billeddata; finjustere mellem intensitet og laser strøm til alle tre kanaler for at opnå billeder med den bedste kvalitet og minimere foto-blegemiddel. Hvis det er nødvendigt, gennemsnit hver 2 til 4 rammer for bedre billedkvalitet. Vi anvender normalt en 1 sek interval.
    7. Start "live" køb og søge efter vedhængende celler, der udtrykker stærk pKD1-GFP i visningen af ​​GFP og transmitteret lys kanaler. Brug af lyse-field optik, center mikropipetten i centrum synsfelt (figur 4A) for at visualisere fMLP gradient og de ​​vedhængende HL60-celler, der udtrykker pKD1-GFP.
    8. Vælg erhvervelse time-lapse og indstille intervallerne til 2 sek intervaller og antallet af billeder til at erhverve til 100.
      BEMÆRK: Efter opsamling hver time-lapse-serien, navn og gemme de data, der vil blive udsat for yderligere analyse af data.

Representative Results

Samtidig billeddannelse af kemotaksi af multiple HL60-celler under anvendelse af celle mobilitet analyseindretning

Baseret på princippet om mikrofluidik 16, har producenten forudsat simulerede profiler af gradienter: en gradient genereres inden for 1 min, stabiliseret inden for 5 min, og opretholdt over 2 timer. De stærkt forudsigelige profiler af de stabile gradienter frembragt af mikrofluidik tillader flere kemotaksiassays der skal udføres samtidigt. I den foreliggende undersøgelse har vi observeret tre samtidige kemotaksiassays (figur 2A og Movie 1). Vi fandt, at HL60-celler begyndte chemotaxing umiddelbart efter kemoattraktant blev injiceret i brønden af ​​kemoattraktant, og holdes chemotaxing i en lige bane for følgende 60 min, i overensstemmelse med resultaterne af simulationen for gradient stabilitet. Sporing rejse sti og morfologiaf cellerne muliggør kvantitative målinger og efterfølgende sammenligning af kemotaksi adfærd bruger kemotaksi indeks, der omfatter samlede vejlængde, hastighed, retningsvirkning og rundhed af cellerne (figur 2B). Total banelængde er summen af ​​længderne af de linjesegmenter forbinder centroider af stien. Hastighed opnås ved at dividere den samlede vejlængde af tiden. Direktionalitet måles opad og er defineret som: (Y-koordinat for enden af ​​stien minus Y-koordinat til begyndelsen) divideret med den samlede vejlængde. Dette giver 1,0 for et objekt bevæger sig direkte opad. Rundhed i cellen er en foranstaltning (i procent) af, hvor effektivt en given mængde omkreds omslutter området. En cirkel har det største område for en given omkreds og har en rundhed parameter på 100%. En lige linje omslutter intet område og har en rundhed parameter på 0%. Vi viser den kvantitativt kemotaksi adfærd, som beskrevet af de udvalgte kemotaksisplader parametre(Figur 2C).

Overvågning PKD subcellulære lokalisering i HL60-celler under en spatiotemporally synlig og kontrollerbar fMLP stimulus

Det er en stor teknisk fremskridt til at anvende fluorescerende mærket og kontrollerbar kemoattraktant stimulation til et eksperimentelt system. Historisk set har vi anvendt enten homogen (også kaldet uniform) stimulation eller gradient stimulation til at observere celle respons og adfærd. Men "blind" stimulation ikke kun giver ingen Spatiotemporal oplysninger om, hvordan stimulus når cellerne, men også sår tvivl om nogen "unormale" observationer af celle respons på stimulering, simpelthen fordi vi ikke kan se stimulus. Vi har tidligere vist, at fluorescerende farvestof (Alexa594) kan anvendes med kemoattraktant at etablere en lineær sammenhæng mellem kemoattraktant koncentration og monitored fluorescerende farvestof intensitet 15. Med en erhvervelse konfiguration af grønt fluorescerende protein (GFP), en rød emission af fluorescerende farvestof (Alexa594), og transmitteret lys, er vi i stand til at overvåge adhærerende celler, anvendelsen af stimulus, og cellen reaktion på stimulus (figur 3A). Protein kinase D er en familie af serin / threonin-kinaser, der spiller afgørende roller i rettet cellemigration 9,17. Som reaktion på ensartet fMLP (rød) stimulering, HL60 celler medierer en robust membran translokation af GFP-mærkede protein kinase D1 (grøn) (figur 3B og Movie 2). I en fMLP gradient (rød) (figur 4A), HL60-celler rekruttere aktivt pKD1 til forkanten (figur 4B og Movie 3). En tæt sammenligning af den subcellulære lokalisering af GFP i fremspringet af forkanten indikerer, at pKD1 lokaliseres på bagsiden af ​​den førende kant (Figur 4C).

figur 1
Figur 1. Cell mobilitet analyseindretning tillader op til 6 samtidige kemotaksiassays. (A) Skema viser udformningen af en celle mobilitet analyseindretning chip til samtidig overvågning af 6 uafhængige kemotaksiassays. Røde shows kemoattraktant tilsat til brøndene. (B) Indførelse af HL60 celler til brøndene af celler, mens kemoattraktanten diffunderer at etablere en stabil fMLP gradient. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Samtidig overvågning af flere kemotaksiassays med HL60-celler. (A (B) Ordning viser rejse vejlængde og morfologi spores HL60 celler. (C) Kvantificering af kemotaksi som total vejlængde, hastighed, retningsbestemmelse, og rundhed. Middelværdi ± standardafvigelse er vist; n = 10, 12, eller 11 for ingen gradient, fMLP gradient uden CID755673 behandling, og MLP behandling med CID755673 behandling, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3. GPCR-medieret robust membran translokation af pKD1 som svar på ensartet anvendelse fMLP stimuli. (A) Multichannel overvågning af pKD1-GFP (grønt), kemoattraktant (1 uM fMLP blandet med 0,1 ug / ml fluorescerende farvestof Alexa 594, rød) og DIC (differential interferens kontrast) at identificere de vedhængende HL60-celler i en brønd i en 4well kammer overtrukket med 0,2% gelatine i RPMI 1640 medium. Scale bar = 10 um. (B) Montage viser, at ensartet fMLP (rød) inducerer robust membran translokation af pKD1-GFP (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figure 4. Førende lokalisering af pKD1 i chemotaxing HL60-celler. (A) Channel dataopsamling konfiguration letter visualiseringen af fMLP gradient og spatiotemporale dynamik pKD1. I A - C, HL60-celler forbigående udtrykt GFP-mærkede pKD1; at visualisere fMLP gradient genereret fra en mikropipette (DIC), 100 nM fMLP (rød) blev blandet med 0,1 ug / ml fluorescerende farvestof Alexa 594. (B) Beriget lokalisering af pKD1 ved den forreste kant af chemotaxing celle. Scale bar = 10 um. (C) Flettede billeder viser, at pKD1 lokaliseres på bagsiden af den forreste kant i HL60-celler. Green viser pKD1 cellulære lokalisering, og DIC-billede viser den udragende område af forkanten. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse viser vi to eksempler på kemotaksiassays: første, samtidig overvågning af flere kemotaksiassays af cellen mobilitet analyseindretningen; og for det andet, visualisering af kemoattraktant gradient og spatiotemporale dynamik signalering begivenheder i de samme celler i realtid.

Celle mobilitet analyse indretning til flere samtidige kemotaksiassays

I den foreliggende undersøgelse, indførte vi en detaljeret protokol til at udføre flere samtidige kemotaksiassays bruger celle mobilitet analyseindretning. Denne enhed giver brugeren mulighed for at observere cellulære kemotaksi adfærd med en 10X objektiv i konventionel lyse-felt observation. På grund af de diffusionstætte dominerende karakteristika fluidstrømmen, cellen mobilitet analyse enhed genererer meget forudsigelige, stabile gradienter og tillader op til seks kemotaksiassays der skal udføres samtidigt. De kritiske trin i protokollen erat opnå pålidelige gradienter og tilpasse cellerne på terrassen linje. Brugeren skal nøje følge producentens anvisninger for indehaveren samling og injektion af kemoattraktanter og celler. Detaljerede instruktioner er også tilgængelige online. Sammenlignet med alternative kemotaksisplader metoder 11-13,15, denne enhed forbedrer pålideligheden og effektiviteten af kemotaksiassays betydeligt. Fire størrelser af celle mobilitet analyseindretning chip i størrelser på 4, 5, 6, og 8 um er tilgængelige til at rumme forskellige typer og størrelser af celler. Vi fandt, at en 4 eller 5 um celle mobilitet analyseindretning chip er egnet til HL60 og D. discoideum-celler, der er omkring 10-15 um i diameter. , En begrænsning er imidlertid, at denne enhed er ikke egnet til alle typer af celler. Vi havde ringe succes ved hjælp af cellen mobilitet analyseindretningen kemotaksiassay med Raw267.4 celler. Årsagen kan være, at Raw267.4 celler migrerer for langsomt. Den tid, der kræves til effektiv chemotaxis af Raw267.4 celler kan være meget længere end den tid en gradient vedligeholdes af enheden. I stedet en transwell migration assay arbejdede godt for Raw267.4 celler 9. En anden begrænsning er, at fluorescerende observation ikke er mulig med den aktuelle enhed. En fremtidige retning er at overvåge fluorescerende billeddannelse med højere forstørrelse. Dette er muligt med den forbedrede celle mobilitet analyseindretning, som er udstyret med fluorescerende detektion og en 100X objektivlinse. Desuden er antallet af samtidige assays også steget til 12. Alle disse forbedringer lette forbedret gennemløb af kemotaksiassays og observation af subcellulære dynamik i migrerende celler.

Høj transfektionseffektivitet af HL60-celler til at udtrykke fluorescerende protein-tagget protein

HL60-celler er en aktivt dividere leukæmicellelinie og vokse i suspension. Som tidligere rapporteret 18-20, HL60-celler er resistente over for gene overførsel. Både lipid og elektroporation genoverførsel er blevet testet, og højere transfektionseffektivitet blev opnået med elektroporering, som beskrevet detaljeret i afsnit 4. Opnåelse høj levedygtighed efter elektroporering er kritisk for opnåelse af høj transfektionseffektivitet på grund af de alvorlige skader, der følger af elektroporering. Efterfølgende grundig og skånsom celle håndtering kræves, især efter elektroporering. Alle medier skal være forvarmet og forsigtigt tilsat til cellerne i eventuelle skridt efter elektroporation. Det er også afgørende at minimere eksponeringstiden af ​​celler til elektroporation reagens. For at undgå celledød, efter elektroporering, RPMI 1640 elektroporering recovery medium skal lægges til cellerne straks. Vi fandt, at 20% FBS i retableringsmedie giver en meget højere celle recovery rate end 10% FBS. Efter elektroporering, inkubation i RPMI 1640 elektroporering recovery medium i 30 min er kritisk for større levedygtighed og transfektioneffektivitet. For yderligere at øge transfektionseffektiviteten anvendte vi også 4 ug plasmid-DNA pr transfektion, hvilket er næsten det dobbelte mængde plasmid anbefalet af producenten.

Der er to store begrænsninger på elektroporation transfektion: den transiency af proteinekspression og celleantallet grænse (2 x 10 6 celler pr transfektion). I udifferentierede celler, ekspression påvises kun i de første par celledelinger, idet vektor-plasmidet fortyndes til det halve efter hver celledeling. For Den differentierede HL60 celler overlever ikke mere end 48 timer. Som følge heraf forsøgene kræver friske transfektioner 6 timer før forsøget. Celleantallet for én elektroporering opfylder blot minimumskravet for eventuelle biokemiske assays. Med henblik på gentagen brug eller store mængder, anbefales det kraftigt, at en udifferentieret HL60-cellelinje etableres som stabilt udtrykker proteinet af interesse whiCH er blevet mærket med et fluorescerende protein ved en viral vektor, hvis en viral vektor er tilgængelige eller kan konstrueres.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium GlutaMAX Life technologies 61870-036
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scietific 11360-070
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
1 M HEPES sterile solution, pH 7.3 Quality Biological Inc. A611-J848-06
Penicillin streptomycin solution Fisher Scientific 15140122
NucleofectorTM 2b Lonza AAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes Lonza VCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass Nalge Nunc International Inc 155383
2% Gelatin solution Sigma-Aldrich G1393
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) Life technologies 14025-076
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3803
Single well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155361
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155383
Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-10438
fMLP Sigma -Aldrich F3506-5MG
Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mm Corning 2855-22
EZ-TAXIScan Effector Cell Institute, Inc. MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm) Effector Cell Institute, Inc. EZT-F01-5
1701RN 10 μl syringe Hamilton 80030
Femtotips II Injection tips Eppendorf 5242956003
Femtotips II Eppendorf 930000043
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.  Eppendorf 5188900056
DIAS software Solltech Inc.
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309 (2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

Tags

Cellular Biology Neutrofil kemotaksi G-protein-koblede receptorer (GPCR) G-proteiner signaltransduktion cellemigration
Imaging G-protein-koblet receptor-medieret Kemotaksi og dens signaleringshændelser i Neutrofil-lignende HL60-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G… More

Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54511, doi:10.3791/54511 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter