Summary
Visuelle kjemotakse analyser er viktig for en bedre forståelse av hvordan eukaryote celler styrer kjemotiltrekkende-mediert retnings celle migrasjon. Her beskriver vi detaljerte metoder for å: 1) real-time, høyoppløselig overvåking av flere chemotaxis analyser, og 2) samtidig visualisere kjemotiltrekkende gradient og tid og rom dynamikken i signaliserer hendelser i nøytrofil-lignende HL60 celler.
Introduction
Eukaryote celler sanse og bevege seg mot høyere konsentrasjon innenfor et kjemoattraktant gradient, en mobil prosess omtalt som chemotaxis. Chemotaxis spiller viktige roller i mange fysiologiske prosesser, for eksempel embryogenese 1, nevron mønster 2, metastasering av kreft celler 3, rekruttering av nøytrofile til nettsteder på betennelse 4, og utviklingen av modellorganisme Dictyostelium discoideum 5. Generelt eukaryote celler avføle chemoattractants ved hjelp av G-protein-koblede reseptorer 5. Inngrepet av chemoattractants med disse reseptorene fremmer dissosiasjonen av de heterotrimeric G-proteiner Gα og Gβγ, som i sin tur aktiverer nedstrøms signaltransduksjonsveier som til slutt regulerer den tid og rom organiseringen av aktin cytoskjelettet å drive cellemigrering 5-9.
Celle biologer har vært å utvikle og forbedre chemotaxer analyser for å undersøke hvordan G protein-koblet reseptor (GPCR) signal- medierer rettet celle migrasjon. Boyden kammer eller transwell migrasjon analysen ble utviklet i 1960 av Boyden 10. Analysen fungerer ved å opprette en gradient av kjemoattraktant forbindelser mellom to brønner som er adskilt av en mikroporøs membran. Sin enkelhet og brukervennlighet gjør den til den mest brukte chemotaxis analysen til dags dato. Imidlertid analysen ikke tillater migrering prosessen av cellene som skal gjøres synlige. Den Zigmond kammeret er den første visuelle microfluidic enhet som gjør klar avbildning av celle migrasjon på et dekkglass over en smal innsnevring mot en kilde kjemotiltrekkende 11. Dunn 12 og Insall 13 modifisert og forbedret høy oppløsning og langsiktig bildebehandling evne zigmond kammer chemotaxis analysen. På grunn av den svært forutsigbare, diffusjon-dominant karakteristikk av strømning, har MicroFluidics vært å tilby løsninger for neste generasjon avpå kjemotakse analyser som EZ-TAXIScan (en celle mobilitets analyse-enhet).
Med stabiliteten av gradienten sikret, kan enheten seks kjemotaksis analyser kan utføres samtidig (figur 1A). I motsetning til de retningsbestemte gradienter som genereres i de forskjellige kammer analysene ovenfor, nålen eller mikropipette assay utviklet av Guenther Gerisch genererer en gradient med en bevegelig kilde 14. I analysen blir kjemotiltrekkende frigjøres fra en bevegelig mikropipette for å generere en stabil gradient. Med denne nålen analysen, fant forskerne at ulike celler generere pseudopods med fundamentalt forskjellige egenskaper. Bruk av fluoriserende mikroskopi, var vi i stand til å visualisere gradient for å lette sin kvantitativ måling hele 15. I denne studien, beskriver vi detaljerte fremgangsmåter for fremstilling av kjemotaktisk HL60 (human promyelocytisk leukemi-celler), samtidig overvåkning av flere kjemotakse assays med celle mobilitet analyseringsenheten, og visualisering av GPCR-formidlede tid og rom dynamikken til signaliseringsmolekyler som protein kinase D1 i enkelt levende celler i respons til synlige, spatiotemporally styr kjemotiltrekkende stimuli. De avanserte bildemetoder kan anvendes til generelle kjemotaksis studier, og er spesielt egnet for pattedyrcellesystemer.
Protocol
1. Kultur og Differensiering av menneskelig nøytrofilmedierte som HL60 celler
- Forbered RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 kulturmedium som inneholder RPMI 1640 medium, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat og 25 mM HEPES (4- (2-hydroksyetyl) -1 -piperazineethanesulfonic acid). Varm RPMI 1640 kulturmedium til 37 ° C.
- Ved hjelp av et hemocytometer bestemme celletetthet på HL60-celler til å sørge for at cellene er i log-fase vekst stadium.
MERK: Cellene er vanligvis i loggen fase på den tredje dagen etter passaging. Tettheten av log-faseceller er vanligvis 6-8 x 10 5 celler / ml. Cellen tetthet som kreves for å starte en ny kultur er ca 1,5 x 10 5 celler / ml.
NB: For eksempel, for en 10 ml ny kultur i en T-75 flat kolbe, hvis celletetthet på log-faseceller er 6 x 10 5 celler / ml, deretter 2,5 ml log-fase celler (6 x 10 5 ) fortynnes til 1,5 x 10 5 celler / ml i 10 ml ny kultur. For å gjøre et sluttvolum på 10 ml kultur, 7,5 ml RPMI 1640-dyrkningsmedium tilsatt. - Plasser det beregnede volum av varm RPMI 1640 dyrkningsmedium inn i en flat kolbe. For en T-75 flat kolbe kultur, det totale volum av cellekulturen er 10 ml.
- Legg det beregnede volumet av log-fase vekst HL60 celler i flat kolben for å oppnå en celletetthet på 1,5 x 10 5 celler / ml.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
MERK: dobling tid HL60 er nesten 24 timer. - Passasje cellene med RPMI 1640 dyrkningsmedium hver 2-3 dager. Det er viktig at celletettheten av HL60-cellene aldri overstiger 1,5 x 10 6 celler / ml, og cellepassasjen varer lenger enn 2 måneder.
- Differensiere HL60 celler 5 dager før forsøkene.
MERK: RPMI 1640 medium differensiering inneholder RPMI 1640 medium, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvat, 25 mM HEpes, og 1,3% dimetylsulfoksid (DMSO). Med andre ord, det er 1,3% DMSO i RPMI 1640 kulturmedium.- For å skille HL60-celler, forvarme den RPMI 1640 kulturmedium til 37 ° C. Tilsett varm RPMI 1640 dyrkningsmedium inn i en flat kolbe.
- For en endelig 10 ml HL60 differensiering kultur, tilsett 130 ul DMSO direkte til RPMI 1640-dyrkningsmedium på den flate kolben mens virvler i kolben, slik at DMSO raskt fortynnes med RPMI 1640 dyrkningsmedium.
- Legge til log-fase HL60-celler til en sluttcelletetthet på 1,5 x 10 5 celler / ml i et avsluttende 10 ml RPMI 1640 medium differensiering. Culture de HL60-celler i RPMI 1640 medium differensiering ved 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO2 i 5 dager.
2. Coating Cover glassoverflaten på 4well Chamber
- Ta flasken på 2% gelatin stamløsning fra kjøleskapet, rengjøre den med 70% etanol, og legg den i panseret. Take 1 ml 2% gelatin stamoppløsning og returnerer den gjenværende gelatinstamløsning til kjøleskapet umiddelbart.
- Tillat den gelatinoppløsning til fullstendig flytende ved 37 ° C og pipettere det grundig. Fortynn 2% gelatin stamløsning med 9 ml forvarmet 1x Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS) buffer til en sluttkonsentrasjon på 0,2% gelatin.
- Tilsett 0,5 ml eller 2 ml 0,2% gelatin i HBSS til de to midterste brønner i et 4-brønns kammer eller et 1-brønns kammer med et dekkglass i bunnen, henholdsvis. Vippe platene i flere retninger slik at væsken dekker hele overflatearealet.
- Plassere platene i en 37 ° C inkubator. Platene vil være klar til bruk i en time. De kan brukes i inntil 5 dager. Like før såing celler, fjerner gelatinløsning fra 4-brønn eller en brønns kamre.
3. Chemotaxis Assay Bruke Cell Mobility Analysis Device
- Forbered og varm RPMI 1640 sulter medium, som er RPMImedium inneholdende 0,1 mM natriumpyruvat (valgfritt) og 25 mM HEPES.
- Fremstille 100 ul av 100 nM fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanin) i RPMI 1640 medium sultne.
- Fremstille 3 ml av 1% bovint serumalbumin (BSA) / RPMI 1640 medium som inneholder 1% BSA i RPMI 1640 medium sulter og 10 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium.
- Belegge et 22 mm kvadratisk dekkglass og en 5 um cellemobilitet analyseringsenheten brikke med nylaget 1% BSA / RPMI 1640 medium i 1 time ved RT.
- Monter Holder med følgende prosedyre:
- Plasser holderen base med spakene i vertikal stilling slik at hendlene kan vippe mot brukeren. Anvende 70% etanol-løsning til overflaten av det 41 mm glass. Tørk forsiktig overflatene med en tørke, tar seg ikke å klø dem.
- Sett 41 mm glass i holderen basen. Sett BSA-belagte 22 mm firkantet dekkglass på toppen av 41 mm glass i holderen basen.
MERK: Den belagte plassen coverslip mellom 41 mm glass og brikken gjør det mulig for kjemotakse til å oppstå på undergrunnen av beleggoverflaten. - Sett O-ringen (liten) inn i bunnen av skiven huset, og montere skiven huset i holderen basen med den elliptiske hullet på baksiden. Trekk indre plan av holderen basen forover til vannrett stilling for å låse skiven huset i stilling.
- Blås støv fra det indre av wafer bolig med en luft støvkost. Tilsett 4 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium inn i skiven huset.
- Monter BSA-belagte cellemobilitet analyseringsenheten brikke i sentrum av skiven huset med den strukturelle ansiktet nedad i kontakt med glasset.
MERK: det brikken må settes inn med posisjonerings merket (hullet i toppen av chip) på baksiden. - Påføre gummipakningen til bunnen av skiven klemmen ved hjelp av de to fremspring på gummipakningen inn i hullene.
- Monter O-ring (stor) påtoppen av skiven huset. Montere skiven klemme med sensoren hull på baksiden. Trekk den ytre spaken på hus-bunndelen forover til vannrett stilling for å låse skiven klemmen på plass.
- Etter montering av holderen, plasser bunnen av holderen på lyset boksen for å bekrefte at det ikke er luftbobler i brønnene. Hvis det oppdages luftbobler, fjerne dem ved hjelp av den medfølgende plastsprøyte utstyrt med et utvalg lasting tips.
- Ta av dekselet og sette enheten på plate på toppen av cellen mobilitet analyse enhet enhet. Fest sensoren blokken til innehaveren.
- Forbered HL60 celler for Chemotaxis analyse:
- Beregn celletettheten av differensierte HL60-celler med et hemocytometer. Etter 5 dager med differensiering, er celletettheten i området rundt 1,0 x 10 6 celler / ml.
- Beregn sluttvolum på HL60 celler ved en sluttcelletetthet på 2 x 10 6 celler / ml. For eksempel, hvis celletettheten avdifferensierte HL60-celler er 1,0 x 10 6 celler / ml, deretter 10 ml av differensierte HL60-celler blir resuspendert med 5 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium for å nå 2 x 10 6 celler / ml.
- Sentrifuger differensiert HL60 celler 200 x g i 5 min ved RT. Fjern supernatanten og resuspender cellene med det beregnede volum av 0,1% BSA / RPMI 1640 medium ved trinn 3.6.2) til en endelig celletetthet på 2 x 10 6 celler / ml.
- Start opp cellen mobilitet analyse enhet enhet og PC for bildeopptak. Koble enheten til PC-en. Slå på cellen mobilitet analyse enhet. Slå på PC-en.
- Start opp Cell Mobility Analysis Device Software.
- Observer 5 kontrollpaneler: kamera, varmeapparat, skyting, memo, og kamerabilder.
- På kamerabildet kontrollpanelet, bruk "Horizontal line" eller "Vertikal linje" for å justere holderen / vis posisjon i sanntid for å sentrere kamera i kamerabildet panel.
- På kameraet kontrollpanel velger CH1 til CH6 å flytte kameraet til den definerte kanalen. For å sentrere visnings felt av en kanal, klikk på "Move L" eller "Flytt R" for å justere X-koordinat av kameraet og sentrere kameraets posisjon horisontalt.
- Juster Y-koordinat av kameraet ved å vri den posisjonen bryteren på frontpanelet av cellen mobilitet analyse enhet enheten vertikalt justere bildet for å sentrere skjermen.
- På ovnen kontrollpanelet, sett "holder temp" til 37,0 ° C og "plate temp" til 39 ° C. Klikk "Heat" for å starte oppvarming. Også klikke "holder" for å kontrollere temperaturen ved hjelp av termisk sensor koblet til holderen.
- På skyting panel, skriv "15 sec" at "Intervall" og "30 min" på "Time" for intervallene og varigheten av chemotaxis analysen. Sjekk "varmeapparatet på slutten av skytingen" av sikkerhetsmessige grunner. Utpeke en destination for de lagrede bildene.
- På memo panel, inngangs spesifikk av forsøkene, for eksempel cellelinje som brukes, hvorvidt behandling ble brukt, og konsentrasjonen av chemo-lokke brukt.
- Bekreft midtstilling av alle kanalene som vil bli brukt i forsøkene, og gjenta justeringen for alle kanaler hvis nødvendig.
- Sprøyt og Juster Celler som følger:
- Fjern buffer fra holderen, og ta ut 8 pl av buffer fra den tredje brønnen fra toppen for hver kanal.
- Bruke en sprøyte til å injisere 2 ul av celler inn i den andre brønnen i samme kanal samtidig overvåkning av skjermen i sanntid for å kontrollere celle nummer og flyte under injeksjon. Etter at cellene er pent justert, umiddelbart legge til 8 mL buffer tilbake. Gjenta samme prosedyre for de andre kanalene (Figur 1b).
- Tilsett 2 ml buffer tilbake til innehaveren, og tilsett 1 mL 100 nM fMLP til den tredje brønnen fra toppen. Begynn bilde oppkjøpet og lagre dataene. Analysere dataene som oppnås ved hjelp av bilde tracing programvare 9 (figur 2).
4. Transfeksjon med Electroporation
- Skille HL60 celler 5 dager før forsøket som beskrevet i punkt 1. Coat 4-brønn eller en-brønn kamre som beskrevet i punkt 2.
- Fremstille og varm RPMI 1640 elektroporering utvinning medium, som inneholder RPMI 1640 medium, 20% (v / v) FBS, 0,1 mM natriumpyruvat og 25 mM HEPES, til 37 ° C.
- Rett før du starter transfeksjon eksperimentet, legge til enten 300 mikroliter eller 3 ml RPMI 1640 dyrkingsmedium i brønnene av de pre-belagte 4-brønn eller en-brønns kamre, henholdsvis.
- Inkuber kamrene i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Bruk disse kamrene umiddelbart eller butikk i kuvøse for fremtidig bruk (to uker).
- Telle celletettheten av den differensierte HL60 celler med en hemocytometer.
MERK: celletetthet når ofte ca 1,0 x 10 6 celler / ml. Celletetthet større enn 3,0 x 10 6 celler / ml vanligvis gir uønsket transfeksjonseffektivitet. Som HL60 celler er suspensjonsceller, er det ikke nødvendig resuspensjon. - Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min ved RT. Fjern supernatanten og resuspender 2 x 10 6 HL60-celler i 100 ul transfeksjon reagens.
- Tilsett 4 ug av GFP-PKD1 plasmid 9 inn i 100 ul blanding av celler og transfeksjonsteknikker reagenser og bland forsiktig og grundig. Tilsett blandingen i kyvetten gitt.
- Velg produsentens forhåndsinnstilte program for human leukocytt cellelinje og utfører electroporation.
MERK: Ytterligere informasjon er tilgjengelig fra produsentens hjemmeside. - Etter elektroporering, umiddelbart og tilsett forvarmet 500 mL RPMI 6140 electroporation gjenopprettingsmedium til cellene, ogforsiktig overføre celler fra kyvetten til et 1,6 ml rør med plastpipetter gitt.
- Cellene inkuberes i 30 minutter i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Frø 100 pl eller 500 pl av celler i en brønn av en 4-brønn eller et 1-brønn kammer, henholdsvis.
- Legg RPMI 1640 kulturmedium til en sluttvolum på 1 ml eller 4 ml til den samme brønn av en 4-brønn eller et 1-brønn kammer, henholdsvis. Cellene inkuberes i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 3 timer. Forvarm RPMI 1640 sulter medium til 37 ° C.
- Ved hjelp av en 1 ml pipette, fjern forsiktig 0,8 ml eller 3 ml RPMI 1640 dyrkningsmedium fra brønnen av et 4-brønns kammer eller et 1-brønn kammer, henholdsvis. Vær forsiktig og unngå å suge bort man følger HL60 celler.
MERK: HL60 celler vokse og er differensiert i suspensjon media. Etter å ha blitt differensiert eller med visse behandlinger, HL60 celler holder seg til underlaget belagt med polylysin, kollagen, gelatin, eller fibronectin. - Legg 0,8 ml eller 3 ml RPMI 1640 sultende medium i brønnen av et 4-brønn eller 1-brønn kammer, henholdsvis. Vent en time.
MERK: På dette punktet cellene er klar for bildebehandling eksperimenter 9.
5. Overvåking GPCR-mediert membran translokasjon av PKD1 av flerkanalslyd Fluorescent Mikros
- Forbered en frisk blanding av 100 nM fMLP og 1 mikrogram / ml Alexa 594 i RPMI 1640 sulter medium som stimuli.
MERK: blanding av fMLP og Alexa 594 behov for å være rykende fersk for å sikre maksimal effekt. - Mount en 4-brønn kammer sådd med celler i løpet av en 40X olje linse.
- Sett Fluorescent mikroskop i multikanal-konfigurasjon som følger:
- Sett den grønne utslipp kanal (500-530 nm) for GFP-merket PKD1, rød utslipp kanal (580-620 nm) for kjemotiltrekkende fMLP (Alexa 594), og overført lys kanal for å identifisere man følger HL60 celler.
- Start "live" oppkjøp ogoptimaliserer oppsamlings betingelsene for de tre kanaler:
- Finjuster mellom intensitet og laser makt for alle tre kanaler for å minimere photobleach for en lengre periode med bildebehandling.
- Hvis det er nødvendig, i gjennomsnitt hver 2 til 4 rammer for å redusere bakgrunnsstøy-forholdet for bedre kvalitet på bildene. Bruk en 1 sek intervall.
- Søk etter holde celler som uttrykker sterk PKD1-GFP i visningen av GFP og DIC (differensial interferens kontrast) kanal. Hvis man følger cellene er morfologisk flat og ikke flytte seg raskt.
- Etter å identifisere man følger HL60 celler som sterkt uttrykte GFP-PKD1, optimalisere anskaffelses tilstand ved å senke laser makt mens økende detektoren gevinst for hver kanal for å redusere photobleach for langsiktig imaging (figur 3A).
- Ta opp 100 mL av fMLP / Alexa 594 løsning med en 200 mL pipetter og sett til side. Velg "time-lapse erverv" og sette intervallene til2 sek og antall bilder for å skaffe til 100.
Merk: intervaller og antall bilder for å skaffe avhenge av formålet med eksperimenter. 1-2 sek intervaller og 100 rammer blir ofte brukt for bildebehandling eksperimenter, som i figur 3. For langsomt migrerende celler, lengre intervaller er nødvendig for langvarig avbildning. I motsetning til dette, for hurtig migrerende celler, er kortere intervaller som kreves for å observere den kontinuerlige detaljene i cellemigrering. - Forsiktig ta av lokket av et 4-brønns kammer slik at posisjonen av kammeret ikke blir endret. Begynn oppkjøpet umiddelbart og få 3-5 bilder av ustimulerte celler mens posisjonere 200 mL pipetter direkte over cellene ved hjelp av flekk av laserlys som en veiledning.
- Pipetter fMLP / Alexa 594 blandingen over cellene som avbildes med en rask og jevn flyt og fullføre komplett sett av time-lapse oppkjøpet. Navn og lagre data som vil bli utsatt for ytterligere dataanalyse. 6. Imaging Chemotaxing Celler i Synlige og kontrollerbar Chemo-tiltrekkende Stimuli
- Ved hjelp av en 10 mL micropipetter og injeksjon tips, tilbakefylling en mikropipette med 30 pl nylagde blanding av fMLP og Alexa594.
- Fest mikropipette til en mikropipette holder montert på toppen av en objektbord og koble røret til trykktilførselsenhet, en anordning som gir et konstant trykk for å frigjøre fMLP / Alexa594 oppløsning fra mikropipette for å generere en jevn gradient.
- Slå på trykktilførselen og sett kompensasjon trykk (Pc) til 70 hPa.
- Montere en 1-brønnen Chambered dekk sådd med HL60 celler som uttrykker PKD1-GFP over en 40X olje objektiv på et konfokalmikroskop eller tilsvarende fluorescerende mikroskop.
- Sett oppkjøp i kanalmodus i følgende konfigurasjon: grønne kanalen (500-530 nm) for GFP-merket PKD1; røde kanalen (580-620 nm) for kjemotiltrekkende fMLP (Alexa594); og transatte lys kanal for å identifisere man følger HL60 celler.
- Start "live" kjøp og optimalisere anskaffelsesbetingelser for de tre kanaler: justere intensiteten for hver kanal for kvantitativ analyse av bildedata; finjustere mellom intensitet og laser makt for alle tre kanaler for å få bilder med den beste kvaliteten og redusere foto-blekemiddel. Hvis det er nødvendig, i gjennomsnitt hver 2 til 4 rammer for bedre bildekvalitet. Vi bruker vanligvis en 1 sek intervall.
- Start "live" oppkjøp og søk etter holde celler som uttrykker sterk PKD1-GFP i visningen av GFP og overført lys kanaler. Ved hjelp av lys-feltet optikk, senter mikropipette i sentrum synsfeltet (figur 4A) for å visualisere fMLP gradient og man følger HL60 celler som uttrykker PKD1-GFP.
- Velg time-lapse erverv og sette intervallene til 2 sek intervaller og antall rammer for å skaffe til 100.
MERK: Etter å samle hver time-lapse serie, navn og lagre data som vil bli utsatt for ytterligere dataanalyse.
Representative Results
Samtidig avbildning av chemotaxis av flere HL60 celler ved hjelp av celle mobilitet analyse enhet
Basert på prinsippet av MicroFluidics 16, har produsenten gitt simulerte profiler av gradienter: en gradient er generert i løpet av 1 min, stabilisert innen 5 min, og opprettholdt i løpet av 2 timer. Den svært forutsigbare profiler av stabile gradienter som genereres av MicroFluidics tillater flere kjemotakse analyser som skal utføres samtidig. I denne studien ble det observert tre samtidige Chemotaxis analyser (figur 2A og Film 1). Vi fant at HL60-celler startet chemotaxing umiddelbart etter at kjemotiltrekkende ble injisert inn i brønnen for kjemoattraktant, og holdt chemotaxing i en rett bane for de følgende 60 min, i samsvar med simuleringsresultater for gradient stabilitet. Følge kjørebanen og morfologiav cellene som gjør det mulig for kvantitative målinger og påfølgende sammenligning av kjemotaksen oppførsel ved hjelp av en kjemotakse indeks som omfatter de totale veilengde, hastighet, retningen, og rundhet av cellene (figur 2B). Total banelengde er summen av lengdene av linjesegmentene som forbinder centroids i banen. Hastighet oppnås ved å dividere den totale veilengde av tiden. Retnings måles oppover og er definert som: (Y-koordinaten til enden av banen minus Y-koordinaten av begynnelsen) dividert med total banelengde. Dette gir 1,0 for et objekt som beveger seg rett oppover. Rundhet av cellen er et mål (i prosent) av hvor effektivt en gitt mengde av omkretsen omslutter området. En sirkel har det største område for en gitt omkrets og har en rundhet parameter på 100%. En rett linje omslutter ingen område og har en rundhet parameter fra 0%. Vi viser kvantitativt målt kjemotaksien oppførsel som beskrevet av de valgte chemotaxis parametere(Figur 2C).
Overvåking PKD subcellulære lokalisering i HL60 celler under en spatiotemporally synlig og kontrollerbar fMLP stimulans
Det er en stor teknisk forhånd for å søke fluorescensmerkede og kontrollerbar kjemotiltrekkende stimulering til et eksperimentelt system. Historisk sett har vi brukt enten homogen (også kalt uniform) stimulering eller gradient stimulering for å observere celle respons og atferd. Men "blind" stimulering ikke bare gir ingen spatiotemporal informasjon om hvordan stimulans når cellene, men kaster også tvil om noen "unormale" observasjoner av celle respons på stimulering, rett og slett fordi vi ikke ser stimulans. Vi har tidligere vist at fluorescerende fargestoff (Alexa594) kan påføres med kjemotiltrekkende for å etablere et lineært forhold mellom kjemotiltrekkende konsentrasjon og monitored fluorescerende fargestoff intensitet 15. Med en overtakelse konfigurasjon av grønt fluorescerende protein (GFP), en rød emisjon av fluorescerende fargestoff (Alexa594), og overført lys, er vi i stand til å overvåke man følger celler, anvendelsen av stimulus, og den celle respons på stimuli (figur 3A). Protein kinase D er en familie av serin / treonin kinaser som spiller viktige roller i rettet celle migrasjon 9,17. Som svar på en ensartet måte fMLP (rød) stimulering, HL60 celler megle en robust membran translokasjon av GFP-merket protein kinase D1 (grønn) (figur 3B og Movie 2). I en fMLP gradient (red) (figur 4A), HL60 celler aktivt rekruttere PKD1 til forkanten (figur 4B og Movie 3). En nær sammenligning av subcellulære lokalisering av GFP i utstikket av forkanten indikerer at PKD1 lokaliserer på baksiden av forkanten (Figur 4C).
Figur 1. Celle bevegelighet analyseringsenheten tillater opptil 6 samtidige kjemotaksis assays. (A) Reaksjonsskjema viser utformingen av en celle mobilitetsanalyseringsenheten chip for samtidig overvåking av 6 uavhengige kjemotakse analyser. Røde viser kjemotiltrekkende tilsatt til brønnene. (B) Innføring av HL60 celler til brønnene i cellene mens kjemotiltrekkende diffunderer å etablere en jevn fMLP gradient. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Samtidig overvåking av flere chemotaxis analyser med HL60 celler. (A (B) Scheme viser reise veilengden og morfologi spores HL60 celler. (C) Kvantifisering av chemotaxis som total veilengde, hastighet, retningen, og rundhet. Mean ± SD er vist; n = 10, 12, eller 11 for ingen gradient, fMLP gradient uten CID755673 behandling, og fMLP behandling med CID755673 behandling hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. GPCR-formidlede robust membrantranslokasjon av PKD1 som reaksjon på en ensartet måte fMLP stimuli (A) multikanal overvåking av PKD1-GFP (grønt), kjemotiltrekkende. (1 uM fMLP blandet med 0,1 ug / ml fluorescerende fargestoff Alexa 594, rød) og DIC (differensiell interferens kontrast) for å identifisere de fester seg HL60-celler i en brønn i en 4well kammer belagt med 0,2% gelatin i RPMI 1640 medium. Scale bar = 10 mikrometer. (B) Montage viser at jevnt påført fMLP (rød) induserer robust membran translokasjon av PKD1-GFP (grønt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure 4. Ledende lokalisering av PKD1 i chemotaxing HL60 celler. (A) Kanalkonfigurasjonsmodus Oppkjøpet muliggjør visualisering av fMLP gradient og tid og rom dynamikken i PKD1. I A - C, HL60 celler forbigående uttrykt GFP-merket PKD1; å visualisere den fMLP-gradient som genereres fra en mikropipette (DIC), 100 nM fMLP (rød) ble blandet med 0,1 ug / ml fluorescerende fargestoff Alexa 594. (B) Beriket lokalisering av PKD1 ved den fremre kant av chemotaxing cellen. Scale bar = 10 mikrometer. (C) fusjonerte bildene viser at PKD1 lokaliserer på baksiden av de ledende innenfor HL60 celler. Grønn viser PKD1 cellulær lokalisering, og DIC bildet viser den utstikkende delen av ledende. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I den foreliggende undersøkelse, viser vi to eksempler på kjemotaksi assays: For det første, samtidig overvåking av flere chemotaxis analyser av cellemobilitet analyseringsenheten; og andre, visualisering av kjemoattraktant gradient og tid og rom dynamikken i signaliserer hendelser i de samme cellene i sanntid.
Celle mobilitet analyse anordning for flere samtidige kjemotaksi assays
I denne studien, innførte vi en detaljert protokoll for å utføre flere samtidige Chemotaxis analyser ved hjelp av en celle mobilitet analyse enhet. Denne enheten tillater brukeren å observere cellulære kjemotaksishemmende atferd med en 10X objektiv i vanlig lys-feltet observasjon. På grunn av diffusjon-dominerende egenskapene til fluidstrømmen, frembringer cellen mobilitet analyseringsenheten svært forutsigbare og stabile gradienter og tillater opp til seks kjemotakse analyser som skal utføres samtidig. De kritiske trinnene i protokollenå få pålitelige gradienter og å justere cellene på terrassen linjen. Brukeren bør strengt følge produsentens instruksjoner for innehaveren montering og injeksjon av chemoattractants og celler. Detaljerte instruksjoner er også tilgjengelig på nettet. Sammenlignet med alternative metoder kjemotaksis 11-13,15, forbedrer denne enheten i betydelig grad påliteligheten og effektiviteten av kjemotakse analyser. Fire størrelser av cellemobilitet analyseringsenheten chip i størrelser på 4, 5, 6, og 8 um er tilgjengelige for å imøtekomme ulike typer og størrelser av celler. Vi har funnet at en 4 eller 5 um cellemobilitet analyseringsenheten brikken er egnet for HL60 og D. discoideum celler, som er omtrent 10-15 pm i diameter. Imidlertid er en begrensning at denne anordningen er ikke egnet for alle typer celler. Vi hadde lite suksess med mobil mobilitet analyse enhet chemotaxis analysen med Raw267.4 celler. Årsaken kan være at Raw267.4 celler migrerer for sakte. Den tid som kreves for effektiv chemotaxis av Raw267.4 celler kan være mye lenger enn den tiden en gradient blir vedlikeholdt av enheten. I stedet, en transwell migrasjon analysen jobbet godt for Raw267.4 celler 9. En annen begrensning er at fluoriserende observasjon er ikke mulig med den aktuelle enheten. En fremtidig retning er å overvåke fluorescerende avbildning med høyere forstørrelse. Dette er mulig med den forbedrede cellemobilitet analyseringsenheten, som er utstyrt med fluorescerende påvisning og en 100X objektivlinse. I tillegg er antallet samtidige assays også øket til 12. Alle disse forbedringene lette den forbedrede gjennomstrømningen av kjemotaksis analyser og observasjon av subcellulære dynamikk i migrerende celler.
Høy transfeksjonseffektivitet av HL60-celler til å uttrykke fluorescerende protein-protein merket
HL60-celler er en aktivt delende leukemicellelinje og vokse i suspensjon. Som tidligere rapportert 18-20, HL60-celler som er resistente mot gene overføring. Både lipid og elektroporasjon genoverføring er testet, og høyere transfeksjonseffektiviteten ble oppnådd med elektroporering, som beskrevet i detalj i seksjon 4. Skaffe høy levedyktighet etter elektroporasjon er kritisk for å oppnå høy transfeksjonseffektivitet på grunn av den alvorlige skade som stammer fra elektroporering. Deretter blir grundig og skånsom celle i søpla, spesielt etter electroporation. Alle medier må være forvarmet og forsiktig lagt til cellene i noen skritt etter electroporation. Det er også viktig å minimalisere eksponeringstiden av celler til elektroporering reagens. For å unngå celledød, etter elektroporering, RPMI 1640 elektroporering utvinning middel skal tilsettes til cellene umiddelbart. Vi fant at 20% FBS i utvinning medium gir en mye høyere celle utvinningsgrad enn 10% FBS. Etter elektroporering, er kritisk for økt levedyktighet og transfeksjon inkubering i RPMI 1640 medium electroporation gjenvinning i 30 mineffektivitet. For ytterligere å øke transfeksjonseffektiviteten, vi også brukt 4 ug plasmid-DNA pr transfeksjon, som er nesten to ganger mengden av plasmid som anbefales av produsenten.
Det er to viktige begrensninger på elektroporering transfeksjon: den transiency av protein ekspresjon og celletallet Grense (2 x 10 6 celler pr transfeksjon). I udifferensierte celler, er uttrykket påvises bare i løpet av den første par av celledelinger, ettersom vektorplasmidet fortynnes med halvparten etter hver celledeling. For differensiert HL60 celler overlever ikke mer enn 48 timer. Som et resultat, må en hvilken som helst eksperiment ferske trans 6 timer før forsøket. Cellen nummer for en electroporation møter bare minstekravet for eventuelle biokjemiske analyser. For hensikten med repeterende bruk eller store mengder, er det sterkt anbefalt at en udifferensiert HL60 cellelinje etableres som stabilt uttrykker proteinet av interesse WHIch har blitt merket med en fluorescerende protein av en viral vektor, hvis en viral vektor er tilgjengelig, eller kan konstrueres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1 M HEPES sterile solution, pH 7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
| Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
| NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
| AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
| Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| 2% Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
| Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
| fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
| Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
| EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
| EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
| 1701RN 10 μl syringe | Hamilton | 80030 | |
| Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
| TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
| DIAS software | Solltech Inc. | ||
| LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |
References
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
- Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Zigmond, S. H.
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
- Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
- Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N.
- Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309 (2010).
- Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
- Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
- Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).
- Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).
