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Bioengineering

गैर पारदर्शी scaffolds पर इमेजिंग सेल व्यवहार्यता - एक उपन्यास बुना हुआ टाइटेनियम प्रत्यारोपण के उदाहरण का उपयोग

Published: September 7, 2016 doi: 10.3791/54537
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 1,2, 1,2, 1, 1
1Siegfried Weller Institute for Trauma Research at the BG Trauma Center, Eberhard Karls Universität Tübingen, 2Department of Orthopaedics, BG Trauma-Center, 3Buck GmbH and Co.KG

Summary

यहाँ हम एक गैर पारदर्शी टाइटेनियम पाड़ पर सेल व्यवहार्यता का पता लगाने के साथ ही पाड़ अशुद्धियों की झलक का पता लगाने के लिए एक fluorophore आधारित इमेजिंग तकनीक मौजूद है। इस प्रोटोकॉल गैर पारदर्शी मचानों पर सेल सेल या सेल धातु बातचीत इमेजिंग का दोष troubleshoots।

Introduction

पुराने पीठ दर्द एक multifactorial रोग है। अपक्षयी डिस्क रोग के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव उपचार के विकल्प में दिलचस्पी 1950 के बाद से वृद्धि हुई है। आज तक, स्पाइनल कॉलम की बहु कमानी संलयन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपचार है। चूंकि, इस विधि अक्सर प्रभावित खंड 1,2 की गतिशीलता में सीमाओं की ओर जाता है, संधिसंधान युग के अन्वेषण के लिए एक व्यापक हित हो गया। कुल डिस्क प्रतिस्थापन और नाभिक प्रतिस्थापन में महत्वपूर्ण प्रगति पुराने पीठ दर्द 1 के इलाज के लिए एक अच्छा विकल्प बन गया है। विशाल प्रगति के बावजूद, तरीकों में से कोई चिकित्सकीय मूल्यांकन किया गया है। कम कठोर नाभिक प्रत्यारोपण, कुल डिस्क प्रतिस्थापन के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, बशर्ते कि तंतु वलय बरकरार 3,4 है। हालांकि, बाजार पर वर्तमान में मौजूद नाभिक प्रत्यारोपण अक्सर कशेरुका शरीर, अव्यवस्था, डिस्क और टी की खड़ी ऊंचाई घटाने में परिवर्तन जैसे जटिलताओं के साथ जुड़े रहे हैंवह आवश्यक संबद्ध यांत्रिक कठोरता 5 की कमी है। आदेश में मौजूदा खामियों को दूर करने के लिए, एक उपन्यास नाभिक प्रत्यारोपण बुना हुआ टाइटेनियम तारों से बना सफलतापूर्वक 6 विकसित किया गया है। अद्वितीय बुना हुआ संरचना के कारण, इस नव विकसित पाड़ प्रतिष्ठित बायोमैकेनिकल विशेषताओं, जैसे, भिगोना सुविधा, ताकना आकार, लदान क्षमता और विश्वसनीयता 7 दिखाया गया है। इस उपन्यास नाभिक प्रत्यारोपण के biocompatibility परीक्षण करने के लिए लक्ष्य, प्रत्यारोपण के गैर पारदर्शी स्वभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया (ऑप्टिकल) विश्लेषण तकनीक में गंभीर सीमाएं दर्शाया।

आदेश biocompatibility का परीक्षण करने के लिए, सेल धातु बातचीत एक प्रमुख भूमिका निभाता है 8-10। कोशिकाओं और पाड़ के बीच एक संवाद मेजबान सिस्टम के भीतर बेहतर प्रत्यारोपण एकीकरण के लिए स्थिरीकरण और इसलिए आवश्यक है। हालांकि, एक बढ़ती हुई अंतर्वृद्धि गहराई पाड़ के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन हो सकता है। जांच करने के लिए लक्ष्यtigate कि क्या पाड़ सतह सेल लगाव, प्रसार और भेदभाव या के लिए एक आधार प्रदान करता है धातु सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है या नहीं, यह गैर पारदर्शी और अपारदर्शी scaffolds में / पर कोशिकाओं इमेजिंग के आम प्रसिद्ध समस्या के निवारण के लिए महत्वपूर्ण है। आदेश में इस सीमा को कई फ्लोरोसेंट काबू पाने के लिए आधारित तकनीक का पता लगाया गया था। कंपनियों जीवित कोशिकाओं, सेलुलर डिब्बों, या यहां तक कि विशिष्ट सेलुलर राज्यों कल्पना करने के लिए 11 fluorophores की एक बड़ी रेंज प्रदान करते हैं। इस प्रयोग के लिए fluorophores क्रम में सबसे अच्छा हमारे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप फिट में ऑनलाइन उपकरण वर्णक्रम दर्शक की मदद से चुने गए हैं।

1) फ्लोरोसेंट (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन / GFP) osteochondro-पूर्वज कोशिकाओं की लेबलिंग पर कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति के लिए: गैर पारदर्शी बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ में / पर पक्षपाती कोशिकाओं के व्यवहार के विश्लेषण के लिए विकसित रणनीति का पालन करना शामिल पाड़, 2) व्यवहार्यता को मापने (Mitochondrial गतिविधि) कोशिकाओं की, और 3) visualizing सेल सेल और पाड़ के भीतर सेल-सामग्री बातचीत। प्रक्रिया लाभ यह है कि यह आसानी से अन्य पक्षपाती कोशिकाओं और अन्य गैर-पारदर्शी या अपारदर्शी पाड़ को हस्तांतरित किया जा सकता है। इसके अलावा, व्यवहार्यता और अंतर्वृद्धि पैटर्न कई दिनों में नजर रखी जा सकती है, इस प्रकार यह पाड़ सामग्री या कोशिकाओं की सीमित मात्रा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन के लिए हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के सफल प्रयोग सेल व्यवहार्यता को मापने और गैर-पारदर्शी बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ में में विकास / पर osteochondro-पूर्वज कोशिकाओं के पैटर्न कल्पना करने के लिए यह दर्शाता है। इसके अलावा, विकसित प्रोटोकॉल आदेश पाड़ दोष का निर्धारण करने और सफाई प्रोटोकॉल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: अमर मानव mesenchymal stromal अग्रदूत साबित कोशिकाओं (एससीपी -1 कोशिकाओं) प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया। एससीपी-1 कोशिकाओं प्रो मथायस Schieker 12 द्वारा प्रदान किया गया।

1. एससीपी -1 कोशिकाओं के विस्तार

  1. एससीपी -1 कोशिकाओं के साथ काम करने से पहले, ठीक से दस्ताने 70% इथेनॉल (वी / वी) पहनने के साथ कार्य क्षेत्र (नामित जैव सुरक्षा कैबिनेट मैं) को साफ।
  2. साफ जैव सुरक्षा कैबिनेट में के रूप में 1 टेबल में संकेत आवश्यक घटक के मिश्रण से सेल संस्कृति के माध्यम से एक उचित मात्रा तैयार करते हैं। क्रम में बेसल मध्यम के बाँझपन बनाए रखने के लिए, 0.22 माइक्रोन के एक छेद के आकार के साथ बाँझ फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा की खुराक जोड़ें।
    1. प्रदूषण को रोकने के लिए, उपयोग करने से पहले मध्यम कम से कम 24 मानव संसाधन तैयार करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता: आदेश में अपने बाँझपन का परीक्षण करने के लिए, मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के बिना एक सेल संस्कृति की थाली में 1 मिलीलीटर मध्यम सेते हैं। बाद24 घंटा, मध्यम microscopically कम से कम 200X के एक बढ़ाई का उपयोग कर जाँच करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता: सहायक शर्त के साथ एक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एससीपी-1 कोशिकाओं को बनाए रखें।
  4. रखरखाव और विस्तार के लिए, एससीपी -1 कोशिकाओं को विकसित जब तक वे 80-90% confluency तक पहुँचने। इस समय अवधि के दौरान संस्कृति, हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें। विस्तार या प्रयोगों के लिए थाली के लिए: (2 अनुपात सामान्य रूप में एक 1) अगले पारित होने के लिए (के रूप में संकेत दिया) 80-90% confluency तक पहुँचने पर, विभाजित एससीपी -1 कोशिकाओं।
  5. एससीपी-1 कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से गर्म और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान का उपयोग कर गल / trypsin EDTA।
  6. पूरी तरह से 80-90% मिला हुआ कोशिकाओं से संस्कृति के माध्यम aspirate और बर्बादी कंटेनर में यह त्यागें।
  7. (Dulbecco फास्फेट मैग्नीशियम और कैल्शियम के बिना खारा बफर, पीएच 7.2) DPBS के साथ कम से कम दो बार कोशिकाओं को धो लें।
    1. का एक उचित मात्रा पिपेटकोशिकाओं पर DPBS (एक T75 संस्कृति फ्लास्क के लिए 5 मिलीलीटर DPBS और एक T175 संस्कृति कुप्पी के लिए 12 एमएल)।
    2. महाप्राण DPBS ध्यान से और यह एक बेकार कंटेनर में त्यागें।
  8. कोशिकाओं पर 0.25% / trypsin EDTA का एक उचित मात्रा (एक T175 संस्कृति कुप्पी के लिए एक T75 संस्कृति फ्लास्क के लिए 1 मिलीलीटर DPBS और 2 मिलीलीटर) पिपेट और 5 के साथ मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए सेते % सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता।
  9. पोत दोहन से कोशिकाओं को बेदखल करने और यह सुनिश्चित सभी कोशिकाओं संस्कृति प्लास्टिक (trypsinization) खुर्दबीन के नीचे अस्थायी कोशिकाओं को देख कर से अलग कर रहे हैं।
  10. संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin प्रतिक्रिया निष्क्रिय। trypsin और दोहराया pipetting द्वारा ध्यान से मध्यम के साथ कोशिकाओं मिक्स।
  11. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर एक प्रतिक्रिया ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन स्थानांतरण।
  12. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 10 मिलीलीटर संस्कृति में सेल गोली resuspendमध्यम।
  13. प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में trypan नीले अपवर्जन विधि द्वारा कोशिकाओं की गणना।
  14. प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर कोशिकाओं बीज।

2. एससीपी-1 कोशिकाओं की गिनती

  1. एक hemocytometer का उपयोग resuspended कोशिकाओं के एक व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या (Trypan नीले अपवर्जन विधि) का प्रदर्शन।
  2. कोशिका गिनती करने से पहले, नल के पानी का उपयोग कर hemocytometer साफ। एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक का उपयोग hemocytometer घटकों सूखी। कांच कवर moistening और उनकी गिनती के क्षेत्र के प्रत्येक पक्ष पर दो गिलास धावकों पर यह व्युत्क्रमानुपाती दबाकर इसे इकट्ठा। सुनिश्चित करें कि न्यूटन के छल्ले कांच धावकों (चित्रा 1) पर देखा जाता है।
  3. resuspended कोशिकाओं के 10 μl ले लो और 2 के एक कमजोर पड़ने कारक प्राप्त करने के लिए 0.1% Trypan ब्लू समाधान के 10 μl के साथ मिश्रण।
  4. लोड पूर्व साफ और इकट्ठे hemocytometer कक्ष पर कुल नमूना के 10 μl।
  5. लाइव (सफेद / पारदर्शी कोशिकाओं) और मृतकों की संख्या की गणना(नीला नाभिक) 4x4 वर्गों पर कोशिकाओं (देखें चित्रा 1 बी)।
  6. सूत्र दिए गए निम्न कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना:
    आकृति 1

3. एससीपी-1 कोशिकाओं की GFP अभिकर्मक

नोट: आदेश पर और एक निश्चित अवधि संस्कृति हम हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ कोशिकाओं को चिह्नित के ऊपर बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ में एससीपी -1 सेल के विकास का निरीक्षण करने के लिए। GFP की overexpression adenovirus कणों GFP के लिए कोडिंग के साथ संक्रमण से हासिल की है। प्रतिकृति अक्षम (-E1 / -E3) adenovirus कणों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए कोडिंग एससीपी -1 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। वायरस कणों पुनः संयोजक एडीनोवायरस (AD5 GFP) ट्रांसफ़ेक्ट HEK293T कोशिकाओं (जैव सुरक्षा प्रयोगशाला द्वितीय) की संस्कृति सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करके प्रो स्टीवन डूले 13 से प्राप्त किया गया। तीन दोहराया फ्रीज (-80 डिग्री सेल्सियस) और पिघलना (नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस) चक्र है कि नहीं, वह यह सुनिश्चित कियाK293T कोशिकाओं नए वायरस कणों का उत्पादन करने के लिए व्यवहार्य रहते हैं। इस एडीनोवायरस बीज स्टॉक का उपयोग कुशलता से नए वायरस कणों का निर्माण बिना एससीपी -1 कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं। इस प्रकार, संक्रमित कोशिकाओं को एक जैव सुरक्षा लैब I में संभाला जा सकता है

  1. संस्कृति के माध्यम में 50,000 कोशिकाओं / एमएल के एक बोने घनत्व के साथ लक्ष्य कोशिकाओं (एससीपी -1 कोशिकाओं) Resuspend। पिपेट 2 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर।
  2. मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं; 5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता, एससीपी-1 कोशिकाओं तक 70-80% की एक confluency तक पहुँचने।
    नोट: confluency कोशिकाओं के बोने घनत्व पर निर्भर करता है। ऊपर कहा गया है की स्थिति के लिए, एससीपी-1 कोशिकाओं 1.5-2 दिनों में 70-80% की एक confluency तक पहुँचने।
  3. 70-80% की एक confluency, संस्कृति के माध्यम से संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर प्रति एडीनोवायरस बीज शेयर के 100 μl जोड़ने श्वास के बिना पर।
    1. एकाग्रता सीमा निर्धारित व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक वायरस se में वायरस कणों की मात्रा पर निर्भर करता हैएड शेयर तैयारी। मामले में संक्रमण दक्षता बहुत कम है, शुद्ध और विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग वायरस कणों ध्यान केंद्रित।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) पर मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एक घंटे के लिए सेते हैं।
  5. संस्कृति वायरस स्टॉक बीज युक्त मध्यम निकालें और निपटान के लिए इसे इकट्ठा। ताजा संस्कृति के माध्यम से 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट की भरपाई करने के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. सुनिश्चित करें कि निपटान करने से पहले, वायरस युक्त मध्यम कण autoclaved है सुनिश्चित करें।
  6. intracellular GFP अभिव्यक्ति (संक्रमण दक्षता) एक GFP एलईडी घन / फिल्टर सेट के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग संक्रमण के बाद 24 घंटे का मूल्यांकन।
    1. सेल आकृति विज्ञान (चित्रा 2) का निरीक्षण करें। संस्कृति प्लास्टिक से detaching प्रकोष्ठों झूठी सकारात्मक परिणाम दे सकते हैं।

4. बुना हुआ टाइटेनियम scaffolds की सफाई

  1. पीएक 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 5 scaffolds के लिए ऊपर फीता।
  2. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 30 मिलीलीटर आसुत-विआयनीकृत पानी के साथ पाड़ (6-7 मिमी मोटाई) तीन बार धोएं, रोटर की स्थिति (8 XG) का उपयोग कर।
  3. (डब्ल्यू / वी) ट्राइटन X-100 समाधान (आसुत-विआयनीकृत पानी में भंग) 30 मिलीलीटर 1% के साथ आसुत-विआयनीकृत पानी की जगह और फिर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए एक बार scaffolds धोने, रोटर शर्तों का उपयोग (8 XG) ।
  4. त्यागें ट्राइटन X-100 के समाधान में दो बार 30 मिलीलीटर आसुत-विआयनीकृत पानी से धोने के बाद (कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रत्येक) को बनाए रखने के रोटर की स्थिति (8 XG)।
  5. आसुत-विआयनीकृत पानी बदलें। एक अल्ट्रासोनिक स्नान में अभिकर्मक ग्रेड 99% एसीटोन, 99% isopropanol और 2 एक्स 5 मिनट के लिए 99% इथेनॉल (30 मिलीलीटर प्रत्येक) प्रत्येक के साथ scaffolds क्रमिक रूप से कुल्ला (~ 50 हर्ट्ज, 50 डब्ल्यू, वी 220-240)।
  6. फिर 5 मिनट के लिए 30 मिलीलीटर आसुत-विआयनीकृत पानी के साथ तीन बार धोएं, अल्ट्रासोनिक स्नान उपचार निरंतर रखे हुए हैं।
  7. scaffo रखेंक्रम में एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक पर एलडीएस कमरे के तापमान पर सूखी रात भर हवा।
  8. 15 साई के साथ 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पाड़ आटोक्लेव।
  9. प्रोटोकॉल 5 में वर्णित के रूप में अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति द्वारा सफाई प्रोटोकॉल की पुष्टि करें।

5. अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति द्वारा इमेजिंग पाड़ संरचनाएं

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति fluorophore sulforhodamine बी जो 565/586 एनएम के एक पूर्व / उन्हें तरंग दैर्ध्य में एक चमकदार लाल प्रतिदीप्ति देता का उपयोग करके पाड़ संरचनाओं की इमेजिंग का वर्णन है। हालांकि, fluorophore दिया माइक्रोस्कोप सेटिंग्स या पाड़ के संभावित ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए बेहतर फिट करने के लिए बदला जा सकता है।

  1. sulforhodamine बी धुंधला प्रकाश से कमरे के तापमान पर 1% एसिटिक एसिड और दुकान में समाधान (0.04%) के संरक्षण के साथ तैयार करें।
  2. 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट ले लो और यह रखकर इन के द्वारा sulforhodamine बी धुंधला समाधान के 500 μl में साफ पाड़ विसर्जितसंदंश अच्छी तरह से उपयोग आईडीई।
  3. पाड़ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर की नकारात्मक छवियों पर कब्जा।
    1. एक आरएफपी एलईडी घन / फिल्टर 531/40 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 593/40 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ सेट के साथ तस्वीरें ले लो। वैकल्पिक रूप से प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक 20 की मदद से पर्याप्त उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य चुनें। Sulforhodamine बी 578 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 593 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है।
    2. आदेश पाड़ संरचना की कल्पना करने के लिए, कम आवर्धन, जैसे, 4X या 10X (चित्रा 3) पर तस्वीरें ले लो। इन चित्रों का उपयोग करना, विशेषताओं, जैसे, ताकना आकार का निर्धारण और ImageJ की मदद से आकार।
    3. आदेश पाड़ दोष का पता लगाने के लिए, चित्रों उच्च आवर्धन पर, 20X या 40X ले जैसे विचार है कि इस विश्लेषण गहराई तक सीमित कर देगा। कि धूल कणों / पदार्थों नहीं देखा जाता है सुनिश्चित करें (प्रतिनिधि परिणाम देखने अंजीरUre 3)।

6. इन विट्रो biocompatibility परख

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से पूर्व गर्म पानी के स्नान में।
  2. 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट ले लो और संदंश का उपयोग कर, अच्छी तरह से aseptically प्रत्येक परीक्षा में साफ किया और निष्फल scaffolds जगह है। पूर्व साफ जैव सुरक्षा कैबिनेट मैं तहत काम करते हैं!
  3. सोख /, के बारे में 15 मिनट (24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl) के लिए एक संस्कृति के माध्यम से scaffolds सेते पाड़ के अंदर से हवा निकालने के लिए आदेश में।
  4. इस बीच, संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में 500,000 से विज्ञापन-GFP संक्रमित SCP1 कोशिकाओं resuspend।
  5. पाड़ भिगोने के 15 मिनट के बाद, पाड़ बंद पूरी तरह से मध्यम aspirate।
  6. पाड़ पर कोशिकाओं बोने के लिए, ध्यान से पाड़ सतह (जिसमें 24 अच्छी तरह से थाली में रखा जाता है) पर सेल निलंबन के 100 μl बांटना। सेल निलंबन की एक न्यूनतम मात्रा बनाए रखने कोशिकाओं बोने जबकि, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कोई मध्यम ओ बहतीपाड़ के केन्द्र शासित प्रदेशों।
  7. मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. 500 μl अधिक संस्कृति के माध्यम जोड़ें और मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) के लिए सेते हैं।
  9. सेल पालन पैटर्न और सेल पाड़ सतह एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने पर फैल रहा मूल्यांकन।
    1. एक GFP एलईडी घन / फिल्टर 470/22 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 510/42 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ सेट के साथ तस्वीरें ले लो। वैकल्पिक रूप से पर्याप्त उत्तेजना और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक की मदद से उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। GFP 488 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 507 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है।
    2. आदेश आवर्धन कम है, जैसे, 4X या 10X (चित्रा 4) में सेल पालन पैटर्न पर कब्जा चित्रों कल्पना करने के लिए। आदेश में एक उच्च पत्रिका के प्रसार सेल का निरीक्षण करने के लिएnification (कम से कम 100x) की जरूरत है - ध्यान गहराई सीमित।
  10. आगे सेल पाड़ की सतह पर फैल रहा मूल्यांकन के लिए, 4% formalin के साथ कोशिकाओं को ठीक करने और सेलुलर संरचनाओं के पारंपरिक प्रतिदीप्ति धुंधला हो जाना, जैसे, एक्टिन तंतु (Phalloidin) के साथ आगे बढ़ें। हालांकि, के लिए अलग-अलग पाड़ विशेषताओं, जैसे, प्रसार बार या ऑटो प्रतिदीप्ति 14 फिट करने के लिए ऊष्मायन बार और एंटीबॉडी के फ्लोरोसेंट लेबलिंग लिए अनुकूल है।
  11. अगले दिन, गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए संस्कृति के माध्यम से बदल जाते हैं।
  12. प्रोटोकॉल 7 में वर्णित के रूप में रूपांतरण माप resazurin द्वारा पाड़ पर पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना।

चित्रा 5
चित्रा 5: इन विट्रो परख की समय रेखा (ए) चढ़ाना कोशिकाओं के लिए प्रयोगात्मक स्थापना।। (बी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. Resazurin रूपांतरण माप

ध्यान दें: Resazurin रूपांतरण परख है और इस तरह परोक्ष रूप से सेल प्रसार mitochondrial गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। Resorufin को Resazurin कमी एक फ्लोरोसेंट संकेत है, जो mitochondrial व्यवहार्य सेल नंबर (चित्रा 7A) के साथ जुड़े गतिविधि पर आधारित है उत्पन्न करता है।

  1. पूरी तरह से एससीपी -1 कोशिकाओं से संस्कृति के माध्यम aspirate और बर्बादी कंटेनर में यह त्यागें।
  2. अलग कोशिकाओं को हटाने के लिए DPBS के साथ एक बार एससीपी -1 कोशिकाओं को धो लें। 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पाड़ पर एससीपी -1 कोशिकाओं से युक्त थाली के प्रति अच्छी तरह से 500 μl DPBS जोड़ें।
  3. एक आवश्यक AM साथ कोशिकाओं को कवरबाँझ resazurin काम कर समाधान (संस्कृति माध्यम में 0.25% resazurin) और ount 30 मिनट के लिए मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    1. एक ध्यान दें कि बनाओ; ऊष्मायन समय सेल प्रकार और सेल घनत्व पर निर्भर करता है। यह 10 मिनट और 6 घंटा के बीच भिन्न हो सकते हैं। एससीपी-1 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित ऊष्मायन समय 30 मिनट है।
  4. एक पृष्ठभूमि के नियंत्रण के रूप में, कम से कम resazurin काम कर समाधान के साथ अच्छी तरह से लेकिन कोशिकाओं के बिना एक, कि मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated है उसी के लिए (5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) में शामिल समय की राशि।
  5. स्थानांतरण 100 μl एक 96 microwell थाली में 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला वातानुकूलित।
  6. शेष कोशिकाओं अवशिष्ट resazurin काम कर समाधान निकालने के लिए आदेश में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर DPBS के साथ तीन बार धोएं। तीसरे धोने के बाद संस्कृति के माध्यम से टी जोड़नेओ एससीपी -1 कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण (24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 500 μl) और मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 20% 2 हे और 90% आर्द्रता) में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी आगे समय के पाठ्यक्रम के मापन के लिए।
    1. आदेश pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए इस कदम (2-4) पर प्रतिकृति स्थापित करने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. इस बीच में, microplate रीडर में 96 microwell प्लेट जगह है और गठन resorufin के प्रतिदीप्ति उपाय।
    1. आदेश पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, 545 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 585 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति उपाय।
    2. वैकल्पिक रूप से पर्याप्त उत्तेजना और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक की मदद से उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। Resorufin 572 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 585 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है। दिए गए संकेत तीव्रता 25 व्यक्ति रीडिंग (अच्छी तरह से प्रति 25 चमक) के एक औसत है।
  8. स्त्राव उपायवातानुकूलित माध्यम में गठित resorufin की escence, एक नीचे ऑप्टिक इस्तेमाल करते हैं।
    1. एक ध्यान दें कि, लाभ औसत राशि resazurin का बदला है और 10 और 4000 के बीच भिन्न हो सकते हैं पर निर्भर करता है। एक resorufin मानक वक्र pipetting, ऐसा है कि फ्लोरोसेंट संकेत (इस मामले में 20,000) अधिकतम संकेत तीव्रता पहचाने जाने के 80% से कम है द्वारा इस्तेमाल के लिए अलग-अलग microplate पाठक को लाभ समायोजित करें। एससीपी-1 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित लाभ 800 है।
  9. पृष्ठभूमि संकेत घटाना नमूने परीक्षण के संकेत से (कोशिकाओं के बिना समाधान के लिए काम कर resazurin)।
  10. प्रयोगात्मक सेटअप / उद्देश्य पर निर्भर करता है, आगे कदम के साथ आगे बढ़ना:
  11. पाड़ एक मानक वक्र के प्रयोग पर कोशिकाओं की व्यवहार्यता के प्रतिशत की गणना। प्रत्येक कोशिका इस्तेमाल लाइन के लिए अलग से एक व्यक्ति मानक वक्र बनाओ।
  12. खेती के समय के दौरान resazurin रूपांतरण में रिश्तेदार वृद्धि का आकलन करके सेल के विकास / प्रसार का विश्लेषण। इस गणना के लिए, सेटसंदर्भ के रूप में दिन 1 पर resazurin रूपांतरण। हौसले विश्लेषण के इस तरह के लिए resazurin काम कर समाधान तैयार है। इसके अलावा, ऊष्मायन बार अलग अलग माप के बीच बराबर होना चाहिए।
  13. resazurin रूपांतरण माप की पूरी प्रोटोकॉल दोहराएँ कम से कम तीन बार अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए।

8. लाइव मृत धुंधला

  1. 50,000 कोशिकाओं / पाड़ की एक बोने घनत्व के साथ पाड़ पर थाली SCP1 कोशिकाओं और यह पाड़ मानक सेल संस्कृति शर्तों रखने पर विकसित करने की अनुमति (1 प्रोटोकॉल को देखें और 2)।
  2. 24-48 के बाद मानव संसाधन पूरी तरह से एससीपी -1 कोशिकाओं से संस्कृति के माध्यम aspirate और बर्बादी कंटेनर में यह त्यागें।
  3. अलग कोशिकाओं को हटाने के लिए DPBS के साथ एक बार एससीपी -1 कोशिकाओं को धो लें। 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl DPBS जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. दाग एससीपी -1 fluorophores का उपयोग कर (एक ही समय में सभी तीन दाग):
    1. अब सेआदेश में दिन के उजाले से fluorophores विरंजन की रक्षा के लिए अंधेरे में scaffolds रहो!
    2. आदेश पाड़ भर में समान वितरण अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए एक ऊष्मायन समय निर्धारित करें। यदि अन्य मचानों को स्थानांतरित करने, व्यक्तिगत पाड़ विशेषताओं (ताकना आकार, पाड़ गहराई, आदि) फिट करने के लिए ऊष्मायन बार अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. आदेश, पाड़ पर व्यवहार्य कोशिकाओं का पता लगाने 2 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता (संस्कृति माध्यम में) पर calcein AM साथ कोशिकाओं दाग में।
    4. आदेश पाड़ पर सभी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, 0.002 माइक्रोग्राम / μl (संस्कृति माध्यम में) की एक अंतिम एकाग्रता में Hoechst 33342 के साथ कोशिकाओं दाग।
    5. आदेश में मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, 4 सुक्ष्ममापी (संस्कृति माध्यम में) की एक अंतिम एकाग्रता में ethidium homodimer साथ पाड़ सेते हैं।
  5. ऊष्मायन समय के बाद, कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए कोशिकाओं DPBS के साथ 3 बार (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर) धो लें।
  6. इसके तत्काल बाद तस्वीर लेने के लिएएक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके।
    1. (क्रमश: 470/22 एनएम और 510/42 एनएम, की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) एक GFP एलईडी घन / फिल्टर सेट के साथ (जीवित कोशिकाओं) calcein की तस्वीरें ले लो। वैकल्पिक रूप से एक पर्याप्त उत्तेजना और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक की मदद से उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। Calcein 488 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 507 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है। नोट: सुनिश्चित Calcein या अन्य हरी फ्लोरोसेंट धब्बे के साथ प्रतिदीप्ति धुंधला के लिए GFP ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए नहीं।
    2. एक DAPI एलईडी घन / फिल्टर 357/44 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 447/60 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ सेट के साथ 33342 Hoechst की तस्वीरें ले लो। वैकल्पिक रूप से पर्याप्त उत्तेजना और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक की मदद से उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। Hoechst 33342 347 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 483 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है।
    3. एक आरएफपी एलईडी घन / फिल्टर सेट (उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य ओ के साथ ethidium homodimer की तस्वीरें ले लोएफ 531/40 एनएम और 593/40 एनएम, क्रमशः)। वैकल्पिक रूप से पर्याप्त उत्तेजना और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक की मदद से उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य चुनें। Ethidium homodimer 530 एनएम पर अपने चरम उत्तेजना और 618 एनएम पर अपने चरम उत्सर्जन है।

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Representative Results

प्रारंभिक परिणामों से पता चला है कि वर्णित उपन्यास नाभिक प्रत्यारोपण न केवल अच्छा भिगोना सुविधाओं की है, लेकिन यह भी एससीपी -1 कोशिकाओं के साथ biocompatible है। प्रत्यारोपण के उत्पादन की प्रक्रिया के दौरान, यह मजबूत संक्षारक और विषाक्त पदार्थों (स्नेहक, चुभता, विद्युत चमकाने समाधान) के साथ संपर्क में आता है। अप्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट धुंधला तकनीक की मदद से हम शेष दोष कल्पना और फलस्वरूप एक सफाई पाड़ पर पदार्थ लोड में महत्वपूर्ण कमी दिखा प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने में सक्षम थे। चित्रा 3 की स्थापना की सफाई प्रोटोकॉल की क्षमता को दर्शाता है।

संधिसंधान उपचार घटनाओं है कि सेल सामग्री इंटरफेस में जगह लेता है द्वारा निर्धारित किया जाता है के लिए इस्तेमाल किया प्रत्यारोपण की सफलता। चित्रा 4 प्रोटोकॉल अनुभाग 6. एक महत्वपूर्ण ट्रांस में वर्णित के रूप में, कोशिकाओं चढ़ाना के 24 घंटे के बाद पाड़ पर संलग्न चलताएससीपी -1 कोशिकाओं के fection दक्षता हम पाड़ (चित्रा 2 देखें) पर छवि mesenchymal stromal अग्रदूत कोशिकाओं के विकास पैटर्न सकता के रूप में मनाया गया। प्रत्यक्ष दृश्य पाड़ के biocompatibility की पुष्टि करता है और यह भी पाड़ की सतह पर पालन पैटर्न (चित्रा 4) को दर्शाया गया है। प्रतिदीप्ति धुंधला और पाड़ की सतह पर प्रसार के साथ सेल बातचीत की जांच करने के लिए आगे किया जा सकता है।

Fluorophores सफलतापूर्वक आदेश पाड़ पर समय की अवधि में कोशिका मृत्यु और प्रसार की जांच करने में लागू किया गया। लाइव मृत धुंधला छवियों उदाहरण देना कैसे धुंधला सफलतापूर्वक पाड़ समय की अवधि में कोशिकाओं का प्रतिशत व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए पर किया जा सकता है। चित्रा 6 नीले परमाणु धुंधला पता चलता है (Hoechst 3342) सभी कोशिकाओं में, लाल fluorescently लेबल (ethidium homodimer) मृत कोशिकाओं, और व्यवहार्यता माँ के रूप में calcein-AM के समावेश के लिए हरी लेबलिंगrker। Calcein AM calcein जो कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में कैल्शियम आयनों की उपस्थिति में एक चमकीले हरे रंग की रोशनी प्रदर्शन करने के लिए बदल जाती है। Hoechst 33342 कोशिका दीवार पारगम्य और सेलुलर डीएनए में intercalates है। इस तरह सभी कोशिकाओं नीले नाभिक (चित्रा 6 देखें) दिखाएगा। Ethidium homodimer, सेल दीवार पारगम्य नहीं है, इस प्रकार यह केवल intercalate मृत कोशिकाओं के डीएनए में। इस तरह, मृत कोशिकाओं लाल नाभिक में दिखाई देंगे। इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता और एक सप्ताह से अधिक पाड़ पर सेल संख्या में वृद्धि गुना रूपांतरण परख resazurin द्वारा मात्रा और रेखांकन का प्रतिनिधित्व (चित्रा 7) किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: सेल एक hemocytometer के साथ गिनती (ए) एक कक्ष विधानसभा का सेटअप।। (बी) के मतगणना कक्षों का चित्रण; 4 x 4 मतगणना कक्ष के एक सेल cou के लिए प्रयोग किया जाता हैNT। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। GFP अभिकर्मक दक्षता SCP1 कोशिकाओं को एक मजबूत हरी प्रतिदीप्ति सकारात्मक विज्ञापन-GFP- अभिकर्मक दक्षता का संकेत दिखा रहे हैं। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन, 4x बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Sulforhodamine बी धुंधला नकारात्मक छवियों पर कब्जा (ए) साफ करने से पहले पाड़।। तीर पाड़ पर विषाक्त / संक्षारक पदार्थों की उपस्थिति का संकेत है। (बी) सफाई प्रोटोकॉल के बाद पाड़। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन, 4x बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। पाड़ GFP संकेत पर SCP1 कोशिकाओं का पालन पैटर्न बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ की सतह पर सेल पालन और विकास पैटर्न को इंगित करता है। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन, 4x बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: पाड़ पर कोशिकाओं के सह प्रतिदीप्ति धुंधला (। (बी) Calcein-AM cytoplasmic धुंधला (हरा)। (सी) तीर ethidium homodimer -1 दाग (लाल) के तेज होने के कारण मृत सेल की उपस्थिति इंगित करता है। (डी) मर्ज किए गए छवि से पता चलता है। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन, 4x बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: Resazurin रूपांतरण परख (ए) बायोकेमिकल कमी redox डाई (resazurin) के एक अंत उत्पाद (resorufin) जो प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है और वर्णमिति परिवर्तन की प्रक्रिया में प्रतिक्रिया।। (ख) जब कोशिकाओं 0.75 मिलीग्राम / सेमी ³ घनत्व पाड़ पर चढ़ाया गया Mitochondrial गतिविधि मापा गया था। डेटा का उपयोग कर FL एकत्र किया गया थाuorescence आधारित माप उपकरण। निर्धारित समय अंक (एक्स अक्ष) पर 590 एनएम (शाफ़्ट) में प्रतिदीप्ति तीव्रता मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता माप (पूर्व = 540 एनएम, एम = 590 एनएम) का एक परिणाम के रूप में दिखाया गया है। सांख्यिकीय महत्व दो तरह से एनोवा और मतलब की मानक त्रुटि (SEM) का उपयोग कर एक त्रुटि सलाखों के रूप में दिखाया गया है निर्धारित किया गया था। पाड़ भौतिक गुणों को देखते हुए, जैसे, ताकना आकार और यांत्रिक गुणों (जैसे, भिगोना सुविधा) एक साथ, 0.75 मिलीग्राम / सेमी ³ घनत्व पाड़ biocompatibility लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया था। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

मीडिया घटकों एकाग्रता
बेसल αMEM मीडिया (%) 90
सीरम (%) 10
पेन / Strep (%) 1

तालिका 1: सेल संस्कृति (αMEM) मीडिया रचना।

मुसीबत कारण उपाय
गैर पारदर्शी पाड़ पर सेल व्यवहार्यता इमेजिंग पाड़ विरूपण के बिना मर्मज्ञ से प्रकाश को रोकता है सेल के आकलन के लिए fluorophore आधारित इमेजिंग तकनीक का प्रयोग करें।
प्रतिदीप्ति तीव्रता के हस्तक्षेप ऑटो प्रतिदीप्ति, पृष्ठभूमि संकेत fluorophores पर ध्यान दे और विशेष पाड़ गुणों के आधार पर उचित उपयोग करें।
एक संस्कृति की अवधि में पाड़ पर सेल व्यवहार्यता आकलन आरएक लंबे समय के साथ epeated माप विज्ञापन-GFP-वायरस कणों के साथ कोशिकाओं transfect।
गैर पारदर्शी पाड़ पर सेल कार्यक्षमता आकलन प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक केवल सेल पैटर्न विश्लेषण के प्रसार की अनुमति देता है। इमेजिंग तकनीक के साथ एक संयोजन में रूपांतरण परख (मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता माप) resazurin प्रदर्शन करना।

तालिका 2: सारांश तालिका: गैर पारदर्शी पाड़ पर सेल व्यवहार्यता इमेजिंग समस्या निवारण।

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Discussion

पाड़ सतह विवो में आसपास के ऊतकों जिससे प्रत्यारोपण कार्यात्मक स्थायित्व का निर्धारण करने के साथ अपनी बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, पाड़ की जैव अनुकूलता इन विट्रो assays कोशिकाओं का उपयोग (SCP1 सेल लाइन), जब मचानों पर चढ़ाया द्वारा अध्ययन किया है।

माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि पतली और ऑप्टिकली पारदर्शी scaffolds के साथ अच्छी तरह से कार्य खराब biocompatibility अध्ययन करने के लिए गैर-पारदर्शी scaffolds के लिए उपयुक्त हैं। इसका मुख्य कारण गैर पारदर्शी scaffolds महत्वपूर्ण विरूपण 15 बिना मर्मज्ञ से प्रकाश को रोकने के लिए है। आंशिक रूप से इन समस्याओं को दूर करने के लिए हम इसके साथ विभिन्न fluorophores का उपयोग कर बुना हुआ scaffolds टाइटेनियम से बना में / पर सेल के आकलन के लिए एक विधि की स्थापना।

आदेश बुनाई टाइटेनियम तारों की तह के द्वारा पीछा सक्षम करने के लिए, सामग्री मजबूत संक्षारक और विषाक्त पदार्थों (स्नेहक, चुभता, विद्युत के साथ संपर्क में आता हैसमाधान) है, जो पाड़ के biocompatibility को बदल सकता है अगर निशान पाड़ पर / में रहने -polishing। एक विकसित अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल की मदद (प्रोटोकॉल 5) के साथ हम पाड़ संरचना की कल्पना कर सकता है। इसके अलावा, पाड़ विशेषताओं, जैसे, सामग्री मोटाई, व्यक्तिगत ध्यान में लीन होना आकार और आकृति, या संयोजी घनत्व, ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। एक उच्च बढ़ाया epifluorescence सूक्ष्म छवि पाड़ में और साथ ही पाड़ की सतह पर दोष visualizing की अनुमति दी। चित्रा 3B इस प्रकार सफलतापूर्वक विकसित की सफाई प्रोटोकॉल की पुष्टि परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है। यह अप्रत्यक्ष धुंधला प्रोटोकॉल के सिद्धांत को आसानी से अन्य गैर पारदर्शी मचानों को reproduced किया जा सकता है, को ध्यान में अलग-अलग पाड़ गुण ले रही है, उदाहरण के लिए, आकार और इसी प्रसार जो ऊष्मायन समय को प्रभावित करता है ताकना। इसके अलावा, पाड़ और सूक्ष्म सेटिंग्स की ऑटो प्रतिदीप्ति फ्लोरिडा के चुनाव को प्रभावित करता हैuorophores इस्तेमाल किया। ऑनलाइन उपकरण प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक पर्याप्त fluorophores चयन करने में मदद कर सकते हैं।

सेल धातु बातचीत पाड़ पर कोशिकाओं के पालन के पैटर्न का विश्लेषण करके परोक्ष रूप से जांच की गई है। प्रोटोकॉल 6 कैसे कोशिकाओं इन विट्रो में नजर रखी जा सकती है, तो एक GFP अभिकर्मक रणनीति का उपयोग करके संस्कृति प्रणालियों में गैर पारदर्शी मचानों पर चढ़ाया की पद्धति का वर्णन है। इन विट्रो assays के प्रारंभिक परिणामों के आधार पर, यह भविष्यवाणी की गई है कि इस तरह की संरचना, सूक्ष्म स्थलाकृति और खुरदरापन 16 के रूप में सतह के गुणों पालन स्थापित करने और लक्ष्य कोशिकाओं के प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। टाइटेनियम की जा रही एक biomaterial इस प्रकार सेल लगाव (चित्रा 4 देखें) के लिए आधार प्रदान करने के लिए एक सब्सट्रेट टेम्पलेट के रूप में कार्य किया जा सकता है।

प्रत्यारोपण सतह स्थलाकृति सेल व्यवहार को प्रभावित करने के लिए 16 सूचित किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, हम सेल के विकास का विश्लेषण किया /फैल रहा है और व्यवहार्यता मात्रात्मक व्यवहार्यता माप के साथ संयोजन में प्रतिदीप्ति धुंधला तकनीक का उपयोग कर। विश्लेषण प्रकोष्ठ प्रतिशत व्यवहार्यता में सूक्ष्म परिवर्तन और पाड़ सामग्री के आधार पर फैल रहा पता चला। हालांकि, रूपांतरण परख (mitochondrial गतिविधि) resazurin द्वारा मात्रात्मक मूल्यांकन सेल कार्यक्षमता, काफी पाड़ सामग्री से प्रभावित नहीं था। रूपांतरण resazurin द्वारा mitochondrial गतिविधि की माप लाभ यह है कि यह विषाक्त सेल नहीं किया जाता है और इस तरह एक लंबे संस्कृति अवधि में बार-बार किया जा सकता है। विशेष देखभाल जब अवशिष्ट resazurin काम समाधान बंद धोने, इसलिए करने के लिए पृष्ठभूमि संकेत (झूठी सकारात्मक परिणाम) जमा नहीं लिया जाना है। इन फायदों के बावजूद, resazurin रूपांतरण परख सेल पाड़ पर फैल रहा है पर कोई जानकारी नहीं देंगे। GFP संक्रमित कोशिकाओं इसलिए एक लंबे संस्कृति अवधि में लगाया जा सकता है (GFP संकेत पर 14 दिनों के लिए निरंतर बनी), जिससे रों कल्पना करने के लिए सक्षम करने के लिएपाड़ की सतह पर pecific विकास पैटर्न। पाड़ में गहरी कोशिकाओं के दृश्य अभी भी पाड़ सामग्री द्वारा सीमित है और इस तरह के प्रत्यारोपण के विच्छेदन की आवश्यकता होगी है। इन दो तकनीकों के संयोजन बड़ा लाभ यह है कि यह आसानी से अन्य प्रकार की कोशिकाओं को हस्तांतरित किया जा सकता है, पर विचार ऊष्मायन समय ब्याज की सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए हो सकता है कि है। हालाँकि, ध्यान जब अन्य गैर पारदर्शी scaffolds, उदाहरण के लिए इस विधि के हस्तांतरण लिया जाना है, मज्जा आधारित scaffolds जो आम तौर पर एक मजबूत हरी ऑटो प्रतिदीप्ति 17 दिखा रहे हैं। इस मामले में अन्य फ्लोरोसेंट टैग का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए ऊपर कहा गया है दो विधियों के संयोजन के कई फायदे (2 टेबल देखें)।

पाड़ विशेषताओं, जैसे, पाड़ के अंदर आकार पराक्रम जाल कोशिकाओं ताकना। पर्याप्त नहीं पोषक तत्वों की आपूर्ति कर रहे हैं, तो इन कोशिकाओं को मरने के लिए और proteases कि चारों ओर से सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है छिपानाआईएनजी कोशिकाओं / ऊतक। हम एक फ्लोरोसेंट आधारित धुंधला प्रोटोकॉल है कि में और बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ पर रहते हैं और मृत कोशिकाओं कल्पना करने में सक्षम है अनुकूलित करने में सक्षम थे। अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति धुंधला प्रोटोकॉल के लिए इसी प्रकार, इस धुंधला प्रोटोकॉल के सिद्धांत को आसानी से अन्य गैर पारदर्शी scaffolds के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है। ऐसा करते समय, अलग-अलग पाड़ गुण, जैसे, ताकना आकार और इसी प्रसार के साथ ही संभव ऑटो प्रतिदीप्ति, सूक्ष्म सेटिंग के रूप में वे ऊष्मायन समय और इस्तेमाल fluorophores के चुनाव को प्रभावित कर सकता है ध्यान में रखा जाना है। यहाँ, फिर ऑनलाइन उपकरण प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक पर्याप्त fluorophores चयन करने में मदद कर सकते हैं।

सारांश में, इन विट्रो परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रस्तावित बुना हुआ टाइटेनियम नाभिक प्रत्यारोपण मॉडल एक जैविक प्रोफ़ाइल है। इस सामग्री पर mesenchymal stromal अग्रदूत साबित कोशिकाओं (एससीपी-1 कोशिकाओं) की प्रारंभिक लगाव चलता है कि इस टाइटेनियम मिश्र धातु प्रत्यारोपण मटेरियाएल biocompatible है। हालांकि हम अलग स्थलाकृतिक मापदंडों के सहयोग से विश्लेषण नहीं किया है, पाड़ सतह संशोधन भेदभाव 18 के रूप में के रूप में अच्छी सेल पालन प्रसार में वृद्धि हो सकती है। पाड़ और कोशिकाओं के बीच अधिकतम अनुकूलता आसपास के ऊतकों में बेहतर प्रत्यारोपण एकीकरण की संभावना बढ़ाने के लिए और इसलिए उपचार के बाद 19 विवो लंबी उम्र में सुधार। ऊपर कहा गया परीक्षण सेटअप का उपयोग को मापने और पाड़ सतह संशोधनों से प्रेरित का जैविक प्रदर्शन में सुधार की कल्पना करने के लिए संभावना को खोलता है। असंशोधित प्रत्यारोपण डिजाइन पर बायोएक्टिव सतह के साथ scaffolds के वरीयता आस्टियो-chondrogenic एकीकरण के मामले में बेहतर प्रदर्शन 20 चलता है। इस अध्ययन से आगे बुना हुआ टाइटेनियम प्रत्यारोपण जहां अपने यांत्रिक संपत्ति और bioactivity 6.7 सूचित किया गया है पर अन्य रिपोर्टों द्वारा बढ़ाया है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनकी कोई प्रतियोगी रुचि नहीं है। काम का कोई भाग गया या प्रकाशन के लिए विचार के अंतर्गत वर्तमान में है या कहीं और प्रकाशित किया गया है।

Acknowledgments

परियोजना आंशिक रूप से Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums फर Wirtschaft अंड Energie -KF3010902AJ4 द्वारा वित्त पोषित है। प्रकाशन शुल्क बीजी आघात अस्पताल Tübingen, जर्मनी द्वारा कवर किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask Greiner Bio-One GmbH *
* 24 well plates Greiner Bio-One GmbH CELLSTAR 662 160
* 48 well plates Corning Incorporated USA 3548
* 6 well plates Falcon 353046
* T25 Greiner Bio-One GmbH 690 175
* T75 Greiner Bio-One GmbH 658 175
Acetic acid, purum ≥ 99.0% Carl Roth 3738.4
Acetone Carl Roth 5025.1
Axioplan-2  Carl Zeiss, Germany
Biological safety cabinets Thermo Scientific safe 2020
Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) Sigma 17783
Cell Culture Incubtator Binder, Tuttlingen, Germany 9040-0078
Filter unit (0.22 µm) Millipore, IRL SLGP033RS
Centrifuges 5810 R And 5417 R Thermo Fisher Scientific, NY Megafuge 40R
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth 4720.2
Dulbecco’s PBS without Ca & Mg Sigma H15-002
Ethanol 99%  SAV liquid prod. GmBH 475956
Ethidium homodimer Sigma 46043
EVOS Fluorescence imaging system Life technologies AMF4300
Fetal Bovine Serum (FCS) Gibco 10270-106
Hemocytometer Hausser Scientific, PA, USA
Hoechst 33342 Sigma 14533-100MG
Knitted titanium nucleus implant Buck co & KG,Germany
MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside Sigma E15-832
Omega microplate Reader BMG Labtech,Germany FLUOstar Omega
Penicillin/Streptomycin Sigma P11-010
Resazurin sodium salt Sigma 199303-1G
Sulforhodamine B sodium salt Sigma S1402-1G
Test tube rotator Labinco B.V.,The Netherlands Model LD-76
TRIS (hydroxymethyl) aminomethan Carl Roth AE15.1
Triton Carl Roth 3051.2
Trypan Blue 0.5% Carl Roth CN76.1
Trypsin/EDTA Sigma L11-004

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References

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Tendulkar, G., Grau, P., Ziegler, P., Buck, Sr., A., Buck, Jr., A., Badke, A., Kaps, H. P., Ehnert, S., Nussler, A. K. Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds — Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant. J. Vis. Exp. (115), e54537, doi:10.3791/54537 (2016).

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