Summary
Здесь мы представляем флуорофора на основе метод визуализации для выявления жизнеспособности клеток на непрозрачной титана эшафот, а также для обнаружения проблески примесей строительных лесов. Этот протокол устранение неполадок недостаток визуализации клетка-клетка или клетка-металл взаимодействий на непрозрачных каркасах.
Introduction
Хроническая боль в спине является многофакторным заболеванием. Интерес к минимально инвазивной вариант лечения для остеохондроза вырос с 1950-х годов. До сегодняшнего дня, мульти-сегментарный слияние позвоночника является наиболее широко используется лечение. Так как этот метод часто приводит к ограничениям в подвижности пораженного сегмента 1,2, стал широкий интерес разведке артропластики эпохи. Значительные достижения в полной замены диска и ядра замены стала хорошей альтернативой для лечения хронической боли в спине 1. Несмотря на огромный прогресс, ни один из методов не прошли клинические испытания. Менее жесткие имплантаты ядро представляют собой многообещающую альтернативу полной замены диска, при условии , что кольцевое Фиброзное цела 3,4. Тем не менее, в настоящее время представляют ядро имплантаты на рынке часто связаны с осложнениями, как изменения в теле позвонка, вывих, вертикальная потеря высоты диска и тон отсутствие необходимой соответствующей механической жесткостью 5. Для преодоления существующих недостатков, нового ядра имплантата из трикотажного проводов титана была успешно разработана 6. Благодаря уникальной трикотажной структуре, это недавно разработанный эшафот показал выдающиеся биомеханические характеристики, например, демпфирующие функции размер пор, загрузка емкости и надежности 7. С целью проверить биосовместимость этого нового ядра имплантата, изображены жесткие ограничения в (оптических) методов анализа, приписанных к непрозрачной природе имплантата.
Для того , чтобы протестировать биосовместимость, взаимодействие клеток-металл играет важную роль 8-10. Взаимодействие между клетками и эшафот необходимо для стабилизации и, следовательно, для более эффективной интеграции имплантата в хост-системе. Тем не менее, по мере увеличения глубины врастание может изменить механические свойства строительных лесов. С целью инвеtigate обеспечивает ли поверхность леска основу для прикрепления клеток, пролиферации и дифференцировки или влияет ли металл жизнеспособность клеток, важно устранить общую хорошо известную проблему визуализации клеток / в непрозрачные и непрозрачных каркасах. Для того, чтобы преодолеть это ограничение несколько флуоресцентных были изучены методы, основанные. Компании предоставляют широкий спектр флуорофоров для визуализации живых клеток, клеточных отсеков, или даже специфических клеточных состояний 11. Флуорофоры для этого эксперимента были выбраны с помощью онлайн-инструмента спектрального зрителя для того, чтобы наилучшим образом соответствовать нашим флуоресцентного микроскопа.
Разработанная стратегия для анализа клейкого поведения клеток в / в непрозрачном трикотажного титана эшафот включает в себя следующее: 1) люминесцентная (зеленый флуоресцентный белок / GFP) мечение osteochondro-клеток-предшественников, чтобы отслеживать клеток на подмости, 2) измерение жизнеспособности (митоchondrial активность) клеток, и 3) визуализации клеток-клетка и клетка-материал взаимодействия внутри строительные леса. Процедура имеет преимущество в том, что она может быть легко перенесены на другие адгезивные клетки и прочие непрозрачные или непрозрачной помост. Кроме того, жизнеспособность и врастание модель можно контролировать в течение нескольких дней, при этом он может быть использован с ограниченным количеством каркасного материала или клеток.
Настоящее исследование демонстрирует успешное использование нашего текущего протокола для измерения жизнеспособности клеток и визуализации в-модель роста клеток osteochondro-предшественников в / в непрозрачном трикотажного титана эшафот. Кроме того, разработанные протоколы могут быть использованы для того, чтобы определить примеси, строительных лесов и проверки протоколов очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Увековечена стромальных клеток-предшественников человеческого мезенхимальные клетки (SCP-1) использовали для экспериментов. Клетки SCP-1 были предоставлены профессором Маттиасом Schieker 12.
1. Расширение SCP-1 клеток
- До начала работы с клетками SCP-1, правильно чистить рабочую зону (обозначенный биозащитой I) с 70% этанолом (v / v) в перчатках.
- В шкафу очищенную биологической безопасности подготовить соответствующий объем клеточной культуральной среды путем смешивания необходимых компонентов , как указано в таблице 1. Для того чтобы сохранить стерильность базальной среды, добавляют добавки , путем пропускания через стерильные фильтры с размером пор 0,22 мкм.
- Для предотвращения загрязнения, подготовки среднего по меньшей мере 24 ч перед использованием. Для того , чтобы проверить его стерильность, инкубировать 1 мл среды в культуральный планшет без клеток в стандартной клеточной культуры инкубатор: 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 и 90% влажности. После24 часа в сутки, проверьте среда микроскопически с использованием увеличения, по меньшей мере, 200Х.
- Поддержание SCP-1 клеток в стандартной клеточной культуры инкубатор с поддерживающей условием: 37 ° C, 5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности.
- Для поддержания и расширения, роста клеток в SCP-1, пока они не достигают 80-90% слитности. В течение этого периода времени культуры, изменить среду каждые 2-3 дня. При достижении 80-90% слияния, разделения клеток SCP-1 (в общем случае соотношение 1: 2) к следующему прохода для расширения или пластины для экспериментов (как показано).
- Для расщепления клеток ПУО-1, подогреть культуральной среды при 37 ° С и оттаивают трипсин / ЭДТА с использованием водяной бани при температуре 37 ° C.
- Полностью аспирата из культуральной среды 80-90% слившихся клеток и выбросить его в контейнер для отходов.
- Вымойте клетки по крайней мере дважды с ДЗФР (фосфатом Дульбекко буферном растворе без магния и кальция, рН 7,2).
- Пипетировать соответствующий объемDPBS на клетки (5 ДЗФР мл для T75 культуры колбу и 12 мл для культуральной колбе Т175).
- Отберите DPBS тщательно и выбросить его в контейнер для отходов.
- Пипетировать соответствующий объем 0,25% трипсин / ЭДТА на клетки (1 мл ДЗФР для Т75 культуральный флакон и 2 мл для T175 культуральный флакон) и инкубировали в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С в стандартной для культивирования клеток инкубаторе с 5 % СО 2, 20% O 2 и 90% влажности.
- Выбить клетки, нажав на судно и убедитесь, что все клетки отделяют от культуральной пластмассы (трипсином) путем наблюдения плавающих клеток под микроскопом.
- Инактивировать реакцию трипсина путем добавления 10 мл культуральной среды. Смешайте трипсина и клетки с тщательно среды повторным пипетированием.
- Передачи клеточной суспензии в реакционную трубку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл культурысредний.
- Граф клеток методом трипанового синего, как описано в протоколе 2.
- Семенной клетки в зависимости от эксперимента.
2. Подсчет SCP-1 клеток
- Выполните количество жизнеспособных клеток (трипанового синий метод исключения) ресуспензированной клеток с использованием гемоцитометра.
- До подсчета клеток, очистить гемоцитометра с использованием водопроводной воды. Сухие компоненты гемоцитометра с помощью безворсовой ткани. Собирают его увлажнением покровного стекла и прижимая ее обратно на два стеклянных бегунов на каждой стороне области счета. Убедитесь в том, что ньютоновские кольца видны на стекле бегунов (рисунок 1).
- Возьмите 10 мкл ресуспендировали клетки и смешивают с 10 мкл 0,1% раствора трипанового синего, чтобы получить коэффициент разбавления 2.
- Нагрузка 10 мкл общего образца на предварительно очищенную и собранной гемоцитометра камеры.
- Подсчитайте количество живой (белый / прозрачный) клеток и мертвых(синий ядра) клетки на 4x4 квадратов (рис 1B).
- Подсчитайте общее количество клеток после данной формулы:
3. GFP Трансфекция SCP-1 клеток
Примечание: Для того чтобы наблюдать рост SCP-1 клеток, и в трикотажном титана помост в течение определенного периода культивирования мы маркировали клетки с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Избыточная экспрессия GFP достигается путем инфекции с частицами аденовирусов, кодирующих GFP. Репликация некомпетентным (-Э1 / -E3) частиц аденовирусные кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), были использованы для инфицирования клеток SCP-1. Вирусные частицы были получены из проф Стивен Dooley 13 путем сбора супернатанта культуры рекомбинантного аденовируса (Ad5-GFP) , трансфецированных клетках HEK293T (биологической безопасности лаборатории II). Три повторяется замораживания (-80 ° C) и оттепели (37 ° С в водяной бане) циклов гарантировал, что нет, онK293T клетки остаются жизнеспособными для производства новых вирусных частиц. С помощью этого аденовируса семенного фонда может эффективно инфицировать клетки в SCP-1, не производя новых вирусных частиц. Таким образом, инфицированные клетки могут быть обработаны в I. Lab биологической безопасности
- Ресуспендируют клетки-мишени (клетки SCP-1) с плотностью посева 50000 клеток / мл в культуральной среде. Пипетировать 2 мл на лунку в 6-луночного планшета для культуры ткани с.
- Инкубируют при 37 ° C в стандартном инкубаторе для клеточных культур; 5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности, до клеток SCP-1 достигают слитности 70-80%.
Примечание: сплошности зависит от плотности посева клеток. Для выше указанных условиях, клетки SCP-1 достигают слитности 70-80% в 1,5-2 дней. - На сплошности 70-80%, без аспирационных культуральной среды вносят по 100 мкл аденовируса семенного материала на 1 мл культуральной среды.
- Определить диапазон концентраций индивидуально в зависимости от количества вирусных частиц в каждом вируса С.Е.ред Массоподготовка. В этом случае эффективность инфекция является слишком низкой, очищать и концентрировать вирусные частицы с использованием различных коммерчески доступных наборов.
- Инкубируют в течение часа в стандартной для культивирования клеток инкубаторе при температуре 37 ° С (5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности).
- Удалите питательную среду, содержащую вирус семенной фонд и собрать его для утилизации. Добавить свежую культуральную среду 2 мл на лунку 6-луночного культурального пластины для восполнения.
- Убедитесь, что перед удалением, вирусная частица, содержащая среду автоклавируют.
- Оценка внутриклеточной экспрессии GFP (эффективность инфекции) через 24 ч после инфекции с помощью флуоресцентного микроскопа с GFP LED набор куб / фильтра.
- Обратите внимание на морфологии клеток (рисунок 2). Клетки отвязывания от культуры пластика может дать ложные положительные результаты.
4. Очистка трикотажное титана Строительные леса
- пкружева до 5 каркасах в реакционную пробирку емкостью 50 мл.
- Промыть помост (толщиной 6-7 мм) три раза с 30 мл дистиллированной деионизированной воды в течение 20 мин при комнатной температуре, с использованием условий, ротор (8 XG).
- Заменить дистиллированную-деионизированной воде с 30 мл 1% (вес / объем) Тритон-Х-100 раствор (растворенного в дистиллированной деионизированной воде), а затем моют подмости один раз в течение 20 мин при комнатной температуре, с использованием условий, ротор (8 XG) ,
- Отменить решение Тритон-Х-100 с последующим промыванием 30 мл дистиллированной деионизированной водой дважды (5 мин каждый при комнатной температуре) поддерживались условия ротор (8 XG).
- Заменить дистиллированной деионизированной воды. Ополосните каркасах последовательно реагента 99 класса% ацетона, 99% изопропанола и 99% этанола (30 мл каждого) в течение 2 х 5 мин каждый в ультразвуковой ванне (~ 50 Гц, 50 Вт, 220-240).
- Перестирывать три раза с 30 мл дистиллированной деионизированной воды в течение 5 мин, поддерживая ультразвуковой ванны постоянного лечения.
- Поместите scaffoLDS на безворсовой ткани для того, чтобы высохнуть на воздухе в течение ночи при комнатной температуре.
- Автоклава помост в течение 15 мин при температуре 121 ° С с 15 фунтов на квадратный дюйм.
- Подтвердите протокол для очистки путем косвенного флуоресценции, как описано в протоколе 5.
5. визуализации Строительные леса Структуры по косвенному флюоресценции
Примечание: Настоящий протокол описывает визуализацию каркасных структур методом непрямой флуоресценции с помощью флуорофора сульфородамина B, который дает ярко-красную флуоресценцию при ех / эм длине волны 565/586 нм. Тем не менее, флуорофор может быть изменен, чтобы лучше соответствовать при заданных параметрах микроскопа или возможной автофлуоресценции эшафота.
- Приготовьте раствор сульфородамина B окрашивания (0,04%) в 1% -ной уксусной кислотой и хранят при комнатной температуре с защитой от света.
- Возьмите 24-луночного планшета для культуры ткани и погружают в очищаемую эшафот в 500 мкл раствора для окрашивания сульфородамина B путем размещения его InsIde скважину с помощью щипцов.
- Захват негативные образы эшафот с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Снимайте с ЗП LED куб / набор фильтров с длиной волны возбуждения 531/40 нм и длине волны эмиссии 593/40 нм. В качестве альтернативы выбрать адекватное возбуждения и излучения длиной волны с помощью флуоресцентного спектрального зрителя 20. Сульфородамина B имеет свой пик возбуждения при 578 нм и его пик эмиссии при 593 нм.
- Для того , чтобы визуализировать структуру эшафот, снимать при более низких увеличениях, например, 4X или 10X (Рисунок 3). Используя эти картины, определить характеристики, например, размер пор и форму с помощью ImageJ.
- Для обнаружения примесей строительных лесов, снимать при более высоких увеличениях, например, 20X или 40X, учитывая , что это будет ограничивать глубину анализа. Убедитесь в том, что частицы грязи / вещества не видели (см репрезентативные результаты; рисЮр 3).
6. In Vitro Биосовместимость Анализ
- Предварительно нагреть культуральной среды при 37 ° С в водяной бане.
- Возьмите 24-луночного планшета для культуры ткани и с помощью пинцета, поместите чистые и стерилизованные каркасы в каждом тесте хорошо асептически. Продолжается работа по предварительно очищенную биологической безопасности кабинета в I!
- Замачивание / инкубировать подмости с культуральной средой в течение 15 мин (500 мкл на лунку 24-луночного тканевого культурального планшета), для того, чтобы удалить воздух из внутренней части помоста.
- В то же время, ресуспендируют 500000 Ad-GFP-инфицированных SCP1 клеток в 1 мл культуральной среды.
- Через 15 мин каркасного замачивания, аспирация среды полностью от эшафота.
- Для посева клеток на эшафоте, внесите 100 мкл клеточной суспензии тщательно на эшафоте (который расположен в пластине 24-луночного) поверхности. Поддержание минимального объема клеточной суспензии, в то время как посевом клеток, таким образом, чтобы гарантировать, среда не течет Oут из эшафота.
- Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° C в стандартном инкубаторе для клеточных культур (5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности).
- Добавить 500 мкл культуральной среды больше и инкубировать в течение 24 ч в стандартной клеточной культуры инкубатор (37 ° С, 5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности).
- Оценить картину примыкания клеток и распространения клеток на поверхности строительных лесов с использованием флуоресцентного микроскопа.
- Снимайте с GFP LED куб / набор фильтров с длиной волны возбуждения 470/22 нм и длине волны эмиссии 510/42 нм. В качестве альтернативы выбрать адекватный возбуждения и длины волны излучения с помощью флуоресцентного спектрального зрителя. GFP имеет пик возбуждения при длине волны 488 нм и его пик эмиссии при 507 нм.
- Для того , чтобы визуализировать приверженности клеток фотографии захвата модели на более низких увеличениях, например, 4X или 10X (Рисунок 4). Для того, чтобы наблюдать за распространения клеток более высокую МАГличение (по крайней мере, 100X) требуется - ограничение глубины фокусировки.
- Для дальнейшей оценки распространения клеток на поверхности строительных лесов, зафиксировать клетки с 4% -ным формалином и продолжить традиционной флуоресцентной окраски клеточных структур, например, актиновых филаментов (фаллоидином). Тем не менее, адаптировать время инкубации и флуоресцентное мечение антител, чтобы соответствовать индивидуальные особенности строительных лесов, например, время диффузии или автофлуоресценции 14.
- На следующий день, изменение культуральной среды для удаления не прилипшие клетки.
- Вычислить процент адгезивных клеток на эшафоте путем резазурин измерения преобразования, как описано в протоколе 7.
Рисунок 5: Хронология анализа в пробирке (A) Экспериментальная установка для металлизации ячеек.. (В Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Измерение 7. ресазурин преобразования
Примечание: Анализ преобразования ресазурин используется для измерения активности митохондрий и, таким образом, косвенно пролиферации клеток. Снижение ресазурина к ресоруфина генерирует флуоресцентный сигнал, который основан на митохондриальной активности , связанной с количества жизнеспособных клеток (рис 7А).
- Полностью аспирацию культуральной среды из клеток в SCP-1 и выбросить его в контейнер для отходов.
- Вымойте клеток с SCP-1 раз с ДЗФР, чтобы удалить отдельные клетки. Добавить 500 DPBS мкл на лунку 24-луночного планшета для культуры ткани, содержащей клетки SCP-1 на эшафоте.
- Накройте клетки с требуемым утрар а ф стерильного резазурин рабочий раствор (0,25% резазурин в культуральной среде) и инкубируют при 37 ° С в стандартной клеточной культуры инкубатор (5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности) в течение 30 мин.
- Запишите, что; Время инкубации зависит от типа клеток и плотности клеток. Она может варьироваться в пределах от 10 мин до 6 ч. Оптимизированное время инкубации клеток для SCP-1 составляет 30 мин.
- В качестве фонового контроля, включают в себя по крайней мере один хорошо с рабочим раствором резазурин но без клеток, которые инкубируют при 37 ° С в стандартной клеточной культуры инкубатор (5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности) в течение того же количество времени.
- Передача 100 мкл супернатанта из кондиционером каждую лунку планшета для культуры ткани 24-луночного в 96-микропланештным планшете.
- Промыть оставшиеся клетки трижды 1 н ДЗФР мл в течение 5 мин при комнатной температуре с целью удаления остаточного рабочего раствора резазурин. После третьей промывки добавляют культуральную среду тO имплантаты с клетками SCP-1 (500 мкл на лунку планшета для культуры ткани 24-луночный) и продолжают инкубацию при 37 ° С в стандартной клеточной культуры инкубатор (5% СО 2, 20% O 2 и 90% влажности) для дальнейших измерений курса времени.
- Убедитесь в том, чтобы настроить повторах на этом этапе (2-4) для того, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования.
- В то же время, поместите 96-Микропланшетный в ридере для микропланшетов и измеряют флуоресценцию образовавшегося ресоруфина.
- Для того, чтобы уменьшить фоновый сигнал, измерения флуоресценции при длине волны возбуждения 545 нм и длине волны эмиссии 585 нм.
- В качестве альтернативы выбрать адекватный возбуждения и длины волны излучения с помощью флуоресцентного спектрального зрителя. Резоруфином имеет свой пик возбуждения при 572 нм и его пик эмиссии при 585 нм. Данная интенсивность сигнала составляет в среднем 25 индивидуальных показаний (25 вспышек на лунку).
- Измерьте Fluorценции образованного ресоруфина в кондиционированной среде, используя нижнюю оптику.
- Запомните, что, выигрыш зависит от среднего количества резазурин конвертированы и может варьироваться в пределах от 10 до 4000. Регулировка коэффициента усиления к индивидуальным микропланшет-ридером, используемый пипеткой резоруфином стандартной кривой, таким образом, что флуоресцентный сигнал ниже 80% от максимальной интенсивности сигнала обнаруживаемой (в данном случае 20000). Оптимизированная для усиления клеток SCP-1 составляет 800.
- Вычитание фоновый сигнал (ресазурина рабочего раствора без клеток) из сигнала испытываемых образцов.
- В зависимости от экспериментальной установки / цели, продолжить дальнейшие шаги:
- Рассчитывают процент жизнеспособности клеток на эшафоте с использованием стандартной кривой. Сделать индивидуальный стандартную кривую отдельно для каждой клеточной линии.
- Анализ роста клеток / пролиферацию клеток путем оценки относительного увеличения конверсии резазурин на протяжении всего времени культивирования. Для этого расчета, установитепреобразование ресазурина на 1-й день в качестве ссылки. Свеже приготовления рабочего раствора резазурин для такого анализа. Кроме того, периоды инкубации должны быть равны между различными измерениями.
- Повторите весь протокол измерения конверсии резазурин по крайней мере, три раза, чтобы получить достоверные результаты.
8. Live-мертвый Окрашивание
- Пластина клетки SCP1 на эшафот с плотностью посева 50000 клеток / эшафот и позволить ему расти на эшафоте, сохраняя стандартные условия культивирования клеток (см протокола 1 и 2).
- После 24-48 ч полностью аспирацию культуральной среды из клеток в SCP-1 и выбросить его в контейнер для отходов.
- Вымойте клеток с SCP-1 раз с ДЗФР, чтобы удалить отдельные клетки. Добавить 500 мкл DPBS на лунку 24-луночного планшета для культуры ткани и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пятно SCP-1 с использованием флуорофоров (все три пятна одновременно):
- Впредьдержать строительные леса в темноте, чтобы защитить отбелки флуорофоров от дневного света!
- Установите время инкубации до 30 мин, с тем чтобы обеспечить равномерное распределение по всему помост. Если передача на другие каркасы, убедитесь , чтобы оптимизировать время инкубации , чтобы соответствовать индивидуальные характеристики строительных лесов (размер пор, глубина строительных лесов и т.д.).
- Для того чтобы обнаружить жизнеспособные клетки на помост, окрашивает клетки с кальцеиновой утра при конечной концентрации 2 мкМ (в культуральной среде).
- Для того, чтобы обнаружить все клетки на помост, окрашивает клетки с Hoechst 33342 до конечной концентрации 0,002 мкг / мкл (в культуральной среде).
- Для того чтобы обнаружить мертвые клетки, инкубирование леску этидия гомодимере в конечной концентрации 4 мкМ (в культуральной среде).
- После периода инкубации, промыть клетки 3 раза ДЗФР (1 мл на лунку) в течение каждых 5 мин при комнатной температуре.
- Сразу сфотографироватьс помощью флуоресцентного микроскопа.
- Сфотографируйте кальцеина (живые клетки) с GFP LED множества куб / фильтр (возбуждения и испускания волны 470/22 нм и 510/42 нм, соответственно). В качестве альтернативы выбрать адекватный возбуждения и длины волны излучения с помощью флуоресцентного спектрального зрителя. Кальцеин имеет свой пик возбуждения при длине волны 488 нм и его пик эмиссии при 507 нм. Примечание: Убедитесь в том, чтобы не использовать GFP трансфицированных клеток для флуоресцентной окраски с кальцеина или других зеленых флуоресцентных пятен.
- Сфотографируйте Hoechst 33342 с DAPI LED куб / набор фильтров с длиной волны возбуждения 357/44 нм и длине волны эмиссии 447/60 нм. В качестве альтернативы выбрать адекватный возбуждения и длины волны излучения с помощью флуоресцентного спектрального зрителя. Hoechst 33342 имеет свой пик возбуждения при 347 нм и его пик эмиссии при 483 нм.
- Сфотографируйте этидия гомодимере с RFP LED куб / набор фильтров (возбуждения и длины волны эмиссии OF 531/40 нм и 593/40 нм, соответственно). В качестве альтернативы выбрать адекватный возбуждения и длины волны излучения с помощью флуоресцентного спектрального зрителя. Этидий гомодимер имеет свой пик возбуждения при 530 нм и его пик эмиссии при 618 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Предварительные результаты показали, что описанный новый ядро имплантата не только имеет хорошие характеристики затуханию, а также является биологически совместимым с клетками SCP-1. Во время производственного процесса имплантата, он вступает в контакт с сильными коррозионных и токсичных веществ (смазки, морилки, электро-полировка раствора). С помощью косвенных методов флуоресцентной окраски мы смогли визуализировать оставшиеся примеси и , следовательно , оптимизировать протокол чистки , показывая значительное снижение нагрузки вещества на эшафоте. На рисунке 3 показана эффективность установленного протокола очистки.
Успех имплантатов , используемых для лечения артропластики определяется событиями, происходит на клеточном материала интерфейса. На рисунке 4 показаны клетки , прикрепленные на помост после 24 ч гальванотехники, как это описано в разделе протокола 6. Существенным трансЭффективность фекции клеток SCP-1 наблюдали , как мы могли бы образ модель роста мезенхимальных стромальных клеток - предшественников на эшафоте (см рисунок 2). Прямая визуализация подтверждает биосовместимости эшафот , а также изображает картину примыкания на поверхности строительных лесов (рисунок 4). Флуоресцентная окрашивание можно сделать дополнительно для изучения взаимодействия клеток с распространением и на поверхности строительных лесов.
Флуорофоры были успешно применены для того, чтобы исследовать гибель клеток и пролиферации в течение определенного периода времени на строительные леса. Живой умершей окрашивает изображения служат примером , как окрашивание может быть успешно сделано на помост , чтобы подтвердить процент жизнеспособности клеток в течение определенного периода времени. На рисунке 6 показан синий окрашивание ядер (Hoechst 3342) во всех клетках, красный флуоресцентно меченных (этидий гомодимер) мертвые клетки, и зеленая маркировка для включения кальцеин-АМ как жизнеспособность маRKer. Кальцеин А.М. преобразуется в кальцеина, который проявляет ярко-зеленую флуоресценцию в присутствии ионов кальция в цитоплазме клеток. Hoechst 33342 является клеточная стенка проницаема и встраивается в клеточную ДНК. Таким образом , все клетки будут показывать синий ядра (см рисунок 6). Этидий гомодимер не клеточной стенки проницаемыми, таким образом, это будет только интеркалят в ДНК мертвых клеток. Таким образом, мертвые клетки будут показывать красные ядра. Кроме того, жизнеспособность клеток и кратное увеличение числа клеток на эшафоте за неделю количественно с помощью анализа резазурин конверсии и представлены в графическом виде (рисунок 7).
Рисунок 1: Cell подсчета с помощью гемоцитометра (A) Настройка узла камеры.. (B) Иллюстрация подсчета камер; 4 х 4 Счетная камера используется для клеток Couнт. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: GFP эффективность трансфекции клетки SCP1 демонстрируют сильную зеленую флуоресценцию , указывающий положительный результат рекламы GFP- эффективность трансфекции. Шкала бар = 1000 мкм, 4X увеличение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: сульфородамина B Окрашивание отрицательные образы захвата (A) Эшафот перед очисткой.. Стрелка указывает на наличие токсичных / коррозионных веществ на эшафот. (Б) Эшафот после протокола очистки. Шкала бар = 1000 мкм, 4X увеличение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Строгое соблюдение структура клеток SCP1 на GFP сигнала подмости указывает сцепление клеток и характер роста на поверхности трикотажного титана помост. Шкала бар = 1000 мкм, 4X увеличение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Co-флуоресцентного окрашивающего клеток на эшафот (.
Рисунок 7: Анализ преобразования ресазурина (А) Биохимические реакции восстановления окислительно - восстановительного красителя (резазурин) в конечный продукт (резоруфином) , который излучает флуоресценцию и претерпевает колориметрические изменения.. (В) митохондриальная активность измеряли , когда клетки высевают на плотность 0,75 мг / см³ строительные леса. Данные были собраны с помощью флuorescence на основе измерительного прибора. Интенсивность флуоресценции при 590 нм (ось у) в определенные моменты времени (ось х) изображается как результат количественного измерения жизнеспособности клеток (Ex = 540 нм, Em = 590 нм). Статистическая значимость была определена с использованием двухсторонней ANOVA и стандартная ошибка среднего (SEM) показан в качестве погрешностями. Учитывая эшафот физические свойства, например, размер пор и механические свойства (например, демпфирование функция) вместе, 0,75 мг / см³ эшафот плотность была использована для определения характеристик биосовместимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| компоненты носителя | концентрация |
| Базальный αMEM СМИ (%) | 90 |
| Сыворотка (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Таблица 1: Клеточные культуры (αMEM) Медиа состав.
| проблема | причина | Решение |
| Жизнеспособность клеток изображений на непрозрачный эшафот | Эшафот предотвращает свет от проникновения без искажений | Используйте метод визуализации на основе флуорофора для оценки клеток. |
| Интерференция интенсивности флуоресценции | Auto флуоресценция, фоновый сигнал | Обратите внимание на флуорофоров и использовать соответствующие на основе конкретных свойств строительных лесов. |
| Оценка жизнеспособности клеток на помост в течение периода культивирования | рepeated измерения в течение длительного времени | Трансфекцию клетки с ад-GFP-вирусных частиц. |
| оценка функциональных клеток на непрозрачной эшафот | метод флуоресцентной томографии позволяет только распространения клеток анализ паттернов. | Выполните ресазурина анализ конверсии (количественное измерение жизнеспособности клеток) в сочетании с техникой формирования изображений. |
Таблица 2: Сводная таблица: устранение неполадок визуализации жизнеспособности клеток на непрозрачной эшафот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поверхность строительных лесов играет важную роль в его взаимодействии с окружающими тканями в естественных условиях , тем самым определяя имплантанты функциональную долговечность. Таким образом, био-совместимость помост изучен с помощью анализов в пробирке с использованием клеток (клеточных линий SCP1), при посеве на каркасах.
методы микроскопии, которые хорошо функционируют с тонкими и оптически прозрачных каркасах плохо подходят для непрозрачных подмостей для изучения биосовместимости. Это происходит главным образом потому , что непрозрачные каркасы предотвратить свет от проникновения без существенных искажений 15. Чтобы частично преодолеть эти проблемы мы при этом установить способ оценки клеточного / в трикотажной титана сделаны каркасах с использованием различных флуорофоров.
Для того чтобы вязание с последующим сгибанием из титановых проволок, материал вступает в контакт с сильными коррозионных и токсичных веществ (смазка, морилки, электро-polishing раствор), который может изменить биосовместимость эшафоте, если следы остаются в / на эшафоте. С помощью развитого протокола непрямого флуоресценции (протокол 5) мы могли бы визуализировать структуру строительных лесов. Кроме того, каркасные характеристики, например, толщина материала, индивидуальный размер пор и формы, или соединительно плотности, были проанализированы с использованием ImageJ. Чем выше увеличенная эпифлуоресцентной микроскопическое изображение позволила визуализировать примеси в эшафоте, а также на поверхности строительных лесов. Рисунок 3b , таким образом , представляет собой подтверждающую результат успешно разработанного протокола очистки. Принцип этого косвенного протокола окрашивания может быть легко воспроизведен с другими непрозрачными каркасах, с учетом индивидуальных свойств строительных лесов, например, размер пор и соответствующую диффузию , которая влияет на время инкубации. Кроме того, авто-флуоресценция на эшафот и микроскопических параметров влияет на выбор флuorophores используется. Онлайн инструмент флуоресценции Спектральный зритель может помочь выбрать адекватные флуорофоры.
взаимодействие Cell-металл был рассмотрен косвенным путем анализа картины адгезии клеток на эшафоте. Протокол № 6 описывает методику , как клетки можно наблюдать в пробирке , если высевают на непрозрачных подмостей в системах культивирования с использованием стратегии GFP трансфекции. На основе предварительных результатов анализов в лабораторных условиях , было предсказано , что поверхностные свойства , такие как состав, микротопографии и шероховатости 16 может играть важную роль в установлении соблюдения и распространения клеток - мишеней. Титановый будучи биоматериал , таким образом , могли бы действовать в качестве матрицы подложки , чтобы обеспечить основу для прикрепления клеток (см рисунок 4).
Имплантат рельеф поверхности, как сообщается, влияют на поведение 16 клеток. В настоящем исследовании мы проанализировали рост клеток /распространение и жизнеспособность с использованием методов флуоресцентного окрашивающего в сочетании с количественными измерениями жизнеспособность. Анализ показал, тонкие вариации клеток процента жизнеспособности и распространения в зависимости от строительных лесов материала. Тем не менее, функциональность клеток оценивали количественно с помощью анализа резазурин конверсии (митохондриальная активность), существенно не влияет на эшафот материала. Измерение митохондриальной активности резазурин преобразование имеет то преимущество, что оно не токсично и клетка, таким образом, может выполняться многократно в течение длительного периода культивирования. Особое внимание должно быть принято при смывания рабочего раствора остаточного резазурин, поэтому не накапливают фоновый сигнал (ложные положительные результаты). Несмотря на эти преимущества, анализ конверсии ресазурин не будет давать какую-либо информацию о клетке распространяется на эшафоте. В GFP инфицированных клеток, следовательно, могут быть отслежены в течение длительного периода культуры (сигнал GFP, оставалась неизменной в течение более 14 дней), что позволяет визуализировать Specific модель роста на поверхности строительных лесов. Визуализация клеток в более глубоких помост еще ограничена каркасный материал и, таким образом, требует рассечения имплантата. Сочетание этих двух методов имеет основное преимущество, что оно может быть легко перенесены на другие типы клеток, принимая во внимание, что время инкубации, возможно, должны быть адаптированы к типу клеток, представляющих интерес. Тем не менее, внимание должно быть принято при передаче этого метода на другие непрозрачные каркасах, например, коллаген на основе строительных лесов , которые обычно имеют сильную зеленую автофлуоресценции 17. В этом случае могут быть использованы и другие флуоресцентных меток. Сочетание вышеуказанных двух способов , следовательно , имеет несколько преимуществ (см таблицу 2).
Строительные леса характеристики, например, размер пор мощь ловушки клетки внутри эшафот. Если не хватает питательных веществ поставляются, эти клетки могут умереть и секретируют протеазы, которые влияют на жизнеспособность клеток объемного звучанияИНГ клеток / ткани. Мы смогли адаптировать флуоресцентного окрашивающего на основе протокола, который способен визуализировать живых и мертвых клеток в и на трикотажном титана помост. По аналогии с непрямым протоколом флуоресцентного окрашивающего, принцип этого окрашивания протокола могут быть легко перенесены на другие непрозрачные каркасах. Делая это, отдельные свойства матриксов, например, размер пор и соответствующий диффузионный, а также возможно автофлуоресценции, микроскопический установка должны быть приняты во внимание , поскольку они могут влиять на время инкубации и выбор флуорофоров используемого. Здесь снова интерактивный инструмент флуоресценции Спектральный зритель может помочь выбрать адекватные флуорофоры.
Таким образом, результаты в пробирке показывают , что предлагаемый трикотажное титана модель ядра имплантата имеет биологический профиль. Первоначальное присоединение клеток-предшественников мезенхимальных стромальных (SCP-1 клетки) на этом материале, позволяет предположить, что этот сплав титана имплантат Materiaл биосовместимым. Несмотря на то, что мы не анализировали ассоциацию различных топографических параметров, модификация поверхности строительных лесов может усилить пролиферацию клеток примыкания, а также дифференциации 18. Оптимальная совместимость между помоста и клетки повышают вероятность улучшения интеграции имплантата в окружающие ткани и таким образом улучшается в естественных условиях продолжительность жизни после лечения 19. С помощью сформулированной выше испытательной установки открывает возможность для измерения и визуализации улучшений в биологической производительности эшафота, индуцированной модификации поверхности. Предпочтение каркасах с биоактивным поверхности над неизмененной имплантатах конструкций предлагает более высокую производительность 20 с точки зрения костно-хондрогенный интеграции. Это исследование дополнительно усиливается другими отчетами о вязаной титана имплантата , где его механические свойства и биоактивность было зарегистрировано 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Никакая часть работы не было и в настоящее время находится на рассмотрении для публикации или были опубликованы в другом месте.
Acknowledgments
Проект частично финансируется Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) де Bundesministeriums für Wirtschaft унд Energie -KF3010902AJ4. Пошлина за публикацию была покрыта травматологическом больницы BG Тюбинген, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
