Summary
Aqui nós apresentamos uma técnica de imagem fluoróforo base para detectar a viabilidade celular em um andaime de titânio não-transparente, bem como para detectar vislumbres das impurezas de andaime. Este protocolo soluciona o problema de imagiologia de interacções célula-célula ou célula-metal em andaimes não transparentes.
Introduction
dor lombar crônica é uma doença multifatorial. O interesse em uma opção de tratamento minimamente invasivo para a doença degenerativa do disco tem crescido desde a década de 1950. Até hoje, a fusão de múltiplos segmentos da coluna vertebral é o tratamento mais amplamente utilizado. Desde então, este método muitas vezes leva a limitações na mobilidade do segmento acometido 1,2, exploração da era artroplastia tornou-se um grande interesse. Avanços significativos em substituição total substituição do disco e do núcleo tornou-se uma boa alternativa para o tratamento da dor lombar crônica 1. Apesar do enorme progresso, nenhum dos métodos foi clinicamente avaliada. Os implantes de núcleo menos rígidas representam uma alternativa promissora para a substituição total do disco, desde que o anel fibroso está intacta 3,4. No entanto, os presentes atualmente implantes núcleo no mercado são muitas vezes associada a complicações como alterações no corpo vertebral, deslocamento, perda de altura vertical do disco e tele falta de necessária rigidez mecânica associada 5. A fim de ultrapassar os inconvenientes actuais, um novo implante núcleo feito de fios de malha de titânio foi desenvolvido com êxito 6. Devido à estrutura única de malha, este andaime desenvolvido recentemente demonstrou características biomecânicas distintos, por exemplo, característica de amortecimento, dimensão do poro, a capacidade de carga e de fiabilidade 7. Com o objetivo de testar a biocompatibilidade desta novela implante núcleo, representado severas limitações nas técnicas de análise (óptico) atribuídos à natureza não-transparente do implante.
A fim de testar a biocompatibilidade, interacção célula-de metal desempenha um papel proeminente 8-10. Uma interacção entre as células e o andaime é necessária para a estabilização e, consequentemente, para uma melhor integração do implante dentro do sistema hospedeiro. No entanto, uma profundidade crescente crescimento interno pode alterar as propriedades mecânicas do andaime. Com o objetivo de investigar se a superfície de andaime fornece uma base para a fixação das células, proliferação e diferenciação ou se o metal afeta a viabilidade das células, é importante para solucionar o problema comum bem conhecida de imagiologia células na / em andaimes não-transparentes e opacas. A fim de superar esta limitação vários fluorescente foram exploradas técnicas baseadas. Empresas oferecem uma grande variedade de fluoróforos para visualizar as células vivas, compartimentos celulares, ou mesmo estados celulares específicos 11. Fluoróforos para esta experiência foram escolhidos com a ajuda da ferramenta de visualizador espectral on-line, a fim de melhor atender nosso microscópio fluorescente.
A estratégia desenvolvida para a análise do comportamento de células aderentes em / no andaime de titânio malha não transparente envolve o seguinte: 1) fluorescente (proteína fluorescente verde / GFP) rotulagem das células osteochondro-progenitoras para permitir o rastreamento das células na andaime, 2) a medição da viabilidade (Mitoactividade condral) das células, e 3) a visualização de célula-célula e as interacções das células-prima dentro do andaime. O procedimento tem a vantagem de que ele pode ser facilmente transferido para outras células aderentes e outras andaime não transparente ou opaca. Além disso, a viabilidade e crescimento interno do padrão pode ser monitorizada ao longo de vários dias, assim, ela pode ser usada com quantidades limitadas de material de andaime ou células.
O presente estudo demonstra o uso bem sucedido do nosso protocolo atual para medir a viabilidade celular e visualizar padrão no crescimento de células progenitoras osteochondro-on / no não-transparente scaffold titânio malha. Além disso, os protocolos desenvolvidos pode ser utilizado a fim de determinar as impurezas de andaime e para verificar os protocolos de limpeza.
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Protocol
NOTA: imortalizado células precursoras do estroma mesenquimal humana (células SCP-1) foram utilizadas para as experiências. As células SCP-1 foram fornecidas pelo Prof. Matthias Schieker 12.
1. Expansão da SCP-1 Células
- Antes de trabalhar com células as SCP-1, limpar corretamente a área de trabalho (designado biossegurança gabinete I) com luvas de 70% de etanol (v / v) usando.
- No armário de segurança biológica limpos preparar um volume adequado de meio de cultura celular por mistura dos componentes necessários, tal como indicado na Tabela 1. A fim de manter a esterilidade do meio de base, adicionar suplementos por passagem através de filtros estéreis com um tamanho de poro de 0,22 um.
- Para evitar a contaminação, preparar o meio, pelo menos, 24 horas antes do uso. A fim de testar a sua esterilidade, incubar 1 mL de meio numa placa de cultura de células, sem células na incubadora de cultura celular padrão: 37 ° C, 5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade. Depois de24 horas, verifique meio de microscópio utilizando uma ampliação de pelo menos 200X.
- Manter SCP-1 células numa incubadora de cultura de células padrão com a condição de suporte: 37 ° C, 5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade.
- Para a manutenção e expansão, crescem as células SCP-1 até atingirem 80-90% de confluência. Durante este período de tempo de cultura, mudança de meio cada 2-3 dias. Ao atingir 80-90% de confluência, divididas células SCP-1 (em geral uma proporção de 1: 2) para a próxima passagem para a expansão ou a placa para as experiências (como indicado).
- Para dividir as células SCP-1, aquecer o meio de cultura a 37 ° C e descongelar a tripsina / EDTA utilizando um banho de água a 37 ° C.
- Completamente aspirar o meio de cultura das células confluentes 80-90% e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
- Lavar as células, pelo menos, duas vezes com DPBS (fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina sem magnésio e cálcio, pH 7,2).
- Pipetar um volume apropriado deDPBS para as células (5 ml de DPBS para um balão de cultura T75 e 12 ml para um frasco de cultura T175).
- Aspirar DPBS com cuidado e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
- Pipetar um volume adequado de 0,25% de tripsina / EDTA sobre as células (1 mL de DPBS para um balão de cultura T75 e 2 ml para um frasco de cultura T175) e incubar durante 5-10 min a 37 ° C na incubadora de cultura celular padrão com 5 % de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade.
- Desalojar as células tocando no recipiente e assegurar que todas as células são separadas da cultura de plástico (tripsinização), observando as células flutuantes sob o microscópio.
- Inactivar a tripsina reacção por adição de 10 ml de meio de cultura. Misture a tripsina e células com o meio cuidadosamente por pipetagem repetida.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de reacção e centrifugar a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de culturamédio.
- Contar as células por método de exclusão Trypan Blue conforme descrito no protocolo 2.
- Semear as células, dependendo do delineamento experimental.
2. Contagem do SCP-1 Células
- Executar uma contagem de células viáveis (método de exclusão de azul de tripano) das células ressuspensas utilizando um hemocitómetro.
- Antes da contagem de células, limpar o hemocitómetro utilizando água da torneira. Seque os componentes hemocitômetro utilizando um tecido sem fiapos. Montá-lo humedecendo o vidro de cobertura e pressionando-o para inversamente os dois corredores de vidro de cada lado da área de contagem. Certifique-se de que os anéis newtonianos são vistas nos corredores de vidro (Figura 1).
- Tomar 10 ul das células ressuspensas e misturar-se com 10 ml de solução de azul de tripano a 0,1% para se obter um factor de diluição de 2.
- Carga de 10 ul da amostra total na câmara de hemocitómetro pré-limpos e montados.
- Contar o número de vivo (branco / células transparentes) e mortos(azul núcleos) células nas praças 4x4 (ver Figura 1B).
- Calcular o número total de células a seguir a fórmula dada:
3. GFP Transfecção de Células SCP-1
NOTA: A fim de observar o crescimento de células SCP-1 sobre e para o scaffold titânio malha ao longo de um determinado período de cultura que marcou as células com a proteína fluorescente verde (GFP). A sobre-expressão de GFP é conseguida pela infecção com partículas de adenovírus que codificam para GFP. Replicação incompetente (-E1 / -E3) partículas de adenovírus que codificam para a proteína verde fluorescente (GFP) foram utilizados para infectar células SCP-1. As partículas de vírus foram obtidos a partir de Prof. Steven Dooley 13 através da recolha de sobrenadante de cultura de adenovírus recombinante (Ad5-GFP) As células HEK293T transfectadas (Segurança Biológica laboratório II). Três repetidos de congelação (-80 ° C) e descongelação (37 ° C em banho de água) ciclos assegurado que nenhum HEcélulas K293T permanecer viável para a produção de novas partículas virais. Usando este estoque de sementes adenovírus pode infectar eficientemente as células SCP-1 sem produzir novas partículas virais. Assim, as células infectadas podem ser manuseados de Segurança Biológica I. Lab
- Ressuspender as células alvo (células SCP-1) com uma densidade de sementeira de 50.000 células / ml em meio de cultura. Pipetar 2 ml por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços.
- Incubar a 37 ° C na incubadora de cultura celular padrão; 5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade, até células SCP-1 atingir uma confluência de 70-80%.
NOTA: confluência depende da densidade de sementeira das células. As condições acima indicadas, as células SCP-1 atingir uma confluência de 70-80% em 1,5-2 dias. - A uma confluência de 70-80%, sem aspiração do meio de cultura adicionar 100 uL de stock de sementes adenovírus por 1 ml de meio de cultura.
- Determinar a gama de concentrações individualmente, dependendo da quantidade de partículas de vírus em cada vírus SEpreparação de massa ed. No caso de a eficiência de infecção é muito baixo, purificar e concentrar as partículas de vírus, utilizando vários kits disponíveis comercialmente.
- Incuba-se durante uma hora na incubadora de cultura celular padrão, a 37 ° C (5% CO2, 20% de O2 e 90% de humidade).
- Remova o meio de cultura contendo o estoque de sementes de vírus e recolhê-la para eliminação. Adicionar meio de cultura fresco 2 ml por poço de um de 6 poços de cultura de placa para reabastecer.
- Certifique-se que antes da eliminação, partícula do vírus contendo meio é autoclavado.
- Avaliar a expressão de GFP intracelular (eficiência de infecção) 24 h após a infecção usando um microscópio de fluorescência com uma GFP LED conjunto cubo / filtro.
- Observar a morfologia celular (Figura 2). Células destacados do plástico cultura pode dar resultados falsos positivos.
4. Lavagem de malha Scaffolds Titanium
- Prendas até 5 andaimes em um tubo de ensaio de 50 ml.
- Lavar o andaime (6-7 mm de espessura) com três vezes 30 ml de água destilada-desionizada durante 20 min à temperatura ambiente, utilizando condições de rotor (8 xg).
- Substituir a água destilada-desionizada, com 30 ml 1% (w / v) de Triton-X-100 a solução (dissolvido em água destilada-desionizada) e, em seguida, lavar os andaimes, uma vez durante 20 min a temperatura ambiente, usando condições de rotor (8 xg) .
- Descartar a solução de Triton-X-100, seguido por lavagem com 30 ml de água destilada-desionizada, duas vezes (5 minutos cada à temperatura ambiente) mantendo condições de rotor (8 xg).
- Substitua a água destilada-deionizada. Lavar sequencialmente andaimes com grau de reagente 99% de acetona, 99% de isopropanol e 99% de etanol (30 ml cada) durante 2 x 5 min cada em banho de ultra-sons (~ 50 Hz, a 50 W, 220-240 V).
- Lavar novamente três vezes com 30 ml de água destilada-desionizada, durante 5 min, mantendo-se a ultra-sons de banho de tratamento constante.
- Coloque o ScaffoLDS em um tecido que não solte fiapos, a fim de expor as secar durante a noite à temperatura ambiente.
- Autoclave a andaime durante 15 min a 121 ° C com 15 psi.
- Confirme o protocolo de limpeza por fluorescência indireta como descrito no protocolo 5.
5. Estruturas de imagem Andaime por fluorescência indireta
NOTA: O presente protocolo descreve a imagem das estruturas de andaime por fluorescência indireta usando o fluoróforo sulforhodamina B que dá uma fluorescência vermelha brilhante em um comprimento de onda ex / em de 565/586 nm. No entanto, o fluoróforo pode ser alterado para melhor ajuste, para determinadas configurações de microscópio ou possível auto-fluorescência do andaime.
- Preparar a solução sulforhodamina B coloração (0,04%) em ácido acético 1% e armazenar a temperatura ambiente ao abrigo da luz.
- Aqui uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e mergulhar o andaime feita em 500 ul da solução corante sulforrodamina B, colocando-insIDE bem usando uma pinça.
- Capturar as imagens negativas do andaime usando microscópio de fluorescência.
- Tire fotos com uma RFP LED cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 531/40 nm e um comprimento de onda de emissão de 593/40 nm. Alternativamente, escolher o comprimento de onda de excitação e emissão adequados com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência 20. Sulforodamina B tem o seu pico de excitação a 578 nm e o seu pico de emissão a 593 nm.
- A fim de visualizar a estrutura de andaime, tirar fotos em ampliações inferiores, por exemplo, 4X ou 10X (Figura 3). Usando estas imagens, determinar as características, por exemplo, o tamanho dos poros e forma com a ajuda do ImageJ.
- A fim de detectar impurezas de andaime, tirar fotos com ampliações superiores, por exemplo, 20X ou 40X, considerando que isso irá limitar a profundidade da análise. Certifique-se de que a sujeira partículas / substâncias não são vistos (ver resultados representativos; FigUre 3).
6. Ensaio In Vitro A biocompatibilidade
- Pré-aquecer o meio de cultura a 37 ° C num banho de água.
- Aqui uma placa de cultura de tecidos de 24 poços usando uma pinça e, colocar os suportes limpos e esterilizados em cada poço de teste assepticamente. Trabalhar sob a cabine de segurança biológica pré-limpeza I!
- Soak / incubar os andaimes com um meio de cultura durante cerca de 15 min (500 ul por poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços), a fim de remover o ar do interior do andaime.
- Enquanto isso, ressuspender 500.000 células SCP1 Ad-GFP-infectadas em 1 ml de meio de cultura.
- Após 15 minutos de imersão andaime, aspirar o meio completamente fora do andaime.
- Para semear as células no andaime, dispensar 100 ul de suspensão de células cuidadosamente no andaime (que é colocado na placa de 24 poços) de superfície. Manter um volume mínimo de suspensão celular durante a sementeira das células, de modo a garantir que não haja o meio fluiut do andaime.
- Incubam-se as células durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade).
- Adicionar mais 500 ul de meio de cultura e incuba-se durante 24 horas na incubadora de cultura celular padrão (37 ° C, 5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade).
- Avaliar o padrão de aderência e célula se espalhando na superfície do andaime usando um microscópio de fluorescência.
- Tire fotos com uma GFP LED cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 470/22 nm e um comprimento de onda de emissão de 510/42 nm. Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. GFP tem o seu pico de excitação a 488 nm e o seu pico de emissão a 507 nm.
- Para visualizar aderência celular captura de padrão de imagens em ampliações inferiores, por exemplo, 4X ou 10X (Figura 4). A fim de observar células espalhando uma revista de maiornification (pelo menos 100x) é necessária - limitar a profundidade de foco.
- Para avaliar ainda se espalhando na superfície do andaime celular, corrigir as células com 4% de formalina e prosseguir com coloração convencional de fluorescência das estruturas celulares, por exemplo, filamentos de actina (faloidina). No entanto, os tempos de incubação e adaptar marcação fluorescente dos anticorpos, a fim de ajustar as características de andaime individuais, por exemplo, tempos de difusão ou auto-fluorescência 14.
- No dia seguinte, mudar o meio de cultura para remover as células não-aderentes.
- Calcular a percentagem de células aderentes no cadafalso por resazurina medição de conversão, conforme descrito no protocolo 7.
Figura 5: O espaço temporal de ensaio in vitro (A) Instalação experimental para células plaqueamento.. (B Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
medição 7. Conversão resazurina
NOTA: Ensaio de conversão resazurina é usado para medir a atividade mitocondrial e proliferação celular, assim, indiretamente. Redução Resazurina a resorufina gera um sinal de fluorescência, que se baseia na actividade mitocondrial associada com o número de células viáveis (Figura 7A).
- Completamente aspirar o meio de cultura de células as SCP-1 e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
- Lavam-se as células SCP-1 uma vez com DPBS para remover as células destacadas. Adicionar 500 de DPBS ul por poço da placa de cultura de tecidos de 24 poços contendo células SCP-1 sobre o andaime.
- Cobrir as células com um am necessárioount solução de resazurina trabalho estéril (0,25% de resazurina em meio de cultura) e incubar a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade) durante 30 min.
- Fazer uma nota que; tempo de incubação depende do tipo de célula e a densidade de células. Ela pode variar entre 10 min e 6 h. tempo de incubação otimizado para células SCP-1 é de 30 min.
- Como um controlo de fundo, incluem, pelo menos, um bem com a solução de trabalho de resazurina, mas sem células, que foi incubada a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade) para a mesma quantidade de tempo.
- Transferir 100 ul de sobrenadante condicionado de cada poço da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades em uma placa de 96 microcavidades.
- Lavar as células restantes três vezes com 1 ml de DPBS durante 5 min à temperatura ambiente a fim de remover a solução de trabalho resazurina residual. Após a terceira lavagem adicionar meio de cultura tS os implantes com células SCP-1 (500 ul por poço da placa de cultura de tecidos de 24 poços) e continuar a incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de CO2, 20% de O2 e 90% de humidade) para outras medições curso de tempo.
- Certifique-se de configurar repetições neste passo (2-4), a fim de minimizar os erros de pipetagem.
- No entanto, colocar a placa de micropoços de 96 para o leitor de microplacas e medir a fluorescência da resorufina formado.
- A fim de reduzir o sinal de fundo, medir a fluorescência num comprimento de onda de excitação de 545 nm e um comprimento de onda de emissão de 585 nm.
- Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Resorufina tem o seu pico de excitação a 572 nm e o seu pico de emissão a 585 nm. A intensidade do sinal é dada uma média de 25 leituras individuais (25 flashes por poço).
- Medir a Fluorescence de resorufina formado em meio condicionado, utilizando uma óptica de fundo.
- Tome nota que, o ganho depende da quantidade média de resazurina convertida e pode variar entre 10 e 4.000. Ajustar o ganho para o leitor de microplacas indivíduo utilizado por pipetagem de uma curva padrão resorufina, de tal modo que o sinal fluorescente é inferior a 80% da intensidade máxima do sinal detectável (neste caso, 20000). O ganho otimizado para células SCP-1 é de 800.
- Subtrair o sinal de fundo (resazurina solução de trabalho sem células) a partir do sinal das amostras de ensaio.
- Dependendo da configuração experimental / propósito, prosseguir com novas medidas:
- Calcula-se a percentagem de viabilidade das células na andaime utilizando uma curva padrão. Fazer uma curva padrão, separadamente para cada linha celular utilizada.
- Analise crescimento / proliferação celular através da estimativa do aumento relativo na conversão resazurina em todo o tempo de cultura. Para este cálculo, definidoa conversão resazurina no dia 1 como referência. Recém preparar a solução de trabalho resazurina para este tipo de análise. Além disso, os tempos de incubação tem que ser igual entre as diferentes medições.
- Repita todo o protocolo de medida de conversão resazurina pelo menos três vezes para obter resultados consistentes.
8. Coloração vivo-morto
- Placa as células SCP1 no cadafalso com uma densidade de semeadura de 50.000 células / andaime e permitir que ela cresça no cadafalso mantendo as condições de cultura de células padrão (consulte o protocolo 1 e 2).
- Depois de 24-48 h, aspirar completamente o meio de cultura de células as SCP-1 e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
- Lavam-se as células SCP-1 uma vez com DPBS para remover as células destacadas. Adicionar 500 ul DPBS por poço da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Mancha SCP-1 utilizando fluoróforos (todos os três manchas ao mesmo tempo):
- De agora em diantemanter os andaimes no escuro, a fim de proteger o branqueamento fluoróforos de luz!
- Definir um tempo de incubação de 30 min a fim de permitir a distribuição igual em todo o andaime. Se a transferência para outros suportes, certifique-se de otimizar os tempos de incubação para se adequar às características de andaime individuais (tamanho dos poros, profundidade de andaime, etc.).
- A fim de detectar células viáveis no andaime, corar as células com calceína AM a uma concentração final de 2 ^ M (em meio de cultura).
- A fim de detectar todas as células no andaime, corar as células com Hoechst 33342 a uma concentração final de 0,002 mg / mL (em meio de cultura).
- A fim de detectar as células mortas, incubar o andaime com homodímero de etídio para uma concentração final de 4 | iM (em meio de cultura).
- Após o tempo de incubação, lavagem das células 3 vezes com DPBS (1 mL por cavidade) para cada 5 min à temperatura ambiente.
- Imediatamente tirar uma fotos usando um microscópio de fluorescência.
- Tire fotos da calceína (células vivas) com uma GFP LED conjunto cubo / filtro (excitação e emissão de comprimentos de onda de 470/22 nm e 510/42 nm, respectivamente). Alternativamente, escolher uma excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Calceína tem o seu pico de excitação a 488 nm e o seu pico de emissão a 507 nm. Nota: Certifique-se de não usar células transfectadas GFP para a coloração de fluorescência com calceína ou outras manchas verdes fluorescentes.
- Tire fotos da Hoechst 33342 com um LED DAPI cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 357/44 nm e um comprimento de onda de emissão de 447/60 nm. Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Hoechst 33342 tem a sua excitação de pico a 347 nm e o seu pico de emissão a 483 nm.
- Tirar fotos do homodímero de etídio com uma RFP LED cube set / filtro (excitação e comprimento de onda de emissão oF 531/40 nm e 593/40 nm, respectivamente). Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Homodímero de etídio tem o seu pico de excitação a 530 nm e o seu pico de emissão a 618 nm.
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Representative Results
Os resultados preliminares mostraram que o romance implante núcleo descrito não só tem boas características de amortecimento, mas também é biocompatível com células SCP-1. Durante o processo de produção do implante, ele entra em contato com substâncias fortes corrosivos e tóxicos (lubrificante, solução mordente, polimento electro). Com a ajuda de técnicas de coloração fluorescente indirecta fomos capazes de visualizar as impurezas restantes e consequentemente otimizar um protocolo de limpeza que mostra uma redução significativa da carga de substância no andaime. A Figura 3 mostra a eficiência de limpeza protocolo estabelecido.
O sucesso dos implantes utilizados para o tratamento de artroplastia é determinada por eventos que tem lugar na interface célula-material. A Figura 4 mostra as células ligadas no andaime, após 24 h de cultivo, tal como descrito na secção 6. Um protocolo significativa transeficiência infecção de células SCP-1 foi observado que pudemos imagem do padrão de crescimento de células precursoras do estroma mesenquimais no cadafalso (consulte a Figura 2). Visualização directa confirma a biocompatibilidade do andaime e também descreve o padrão de aderência na superfície do andaime (Figura 4). Coloração por fluorescência pode ser feito ainda mais a análise da interacção com células e espalhando sobre a superfície do andaime.
Os fluoróforos foram aplicadas com sucesso a fim de analisar a morte celular e a proliferação ao longo de um período de tempo sobre o andaime. Imagens-morto-coloração vivo exemplificam como coloração com êxito pode ser feito sobre o andaime para confirmar a percentagem de viabilidade das células durante um período de tempo. A Figura 6 mostra uma coloração nuclear azul (Hoechst 3342) em todas as células, vermelho marcado por fluorescência (etídio homodímero) células mortas e rotulagem verde para a incorporação de calceína-AM como a viabilidade marker. A calceina AM é convertido para calceína que exibe uma fluorescência verde brilhante na presença de iões de cálcio no citoplasma das células. Hoechst 33342 é a parede celular permeável e intercala no ADN celular. Desta forma, todas as células irão mostrar núcleos azul (ver Figura 6). Homodímero de etídio não é permeável da parede celular, assim, ele só irá intercalam no ADN de células mortas. Desta forma, as células mortas mostrará núcleos vermelhos. Além disso, a viabilidade celular e dobre aumento no número de células no andaime mais de uma semana foi quantificada por resazurina ensaio de conversão e representado graficamente (Figura 7).
Figura 1: Cell contar com um hemocitômetro (A) Configuração de um conjunto de câmara.. (B) Ilustração de câmaras de contagem; 4 x 4 câmara de contagem é usado para uma célula count. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. GFP eficiência de transfecção células SCP1 exibem uma forte fluorescência verde indicando eficiência de transfecção ad-GFP positivo. Barra de escala = 1.000 mm, uma ampliação de 4X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Sulforodamina B coloração captura de imagens negativas (A) Andaime antes da limpeza.. A seta indica a presença de substâncias tóxicas / corrosivos no andaime. (B) Andaime após o protocolo de limpeza. Barra de escala = 1.000 mm, uma ampliação de 4X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Padrão de aderência de células SCP1 no sinal de GFP indica andaime aderência celular e padrão de crescimento sobre a superfície do andaime de titânio de malha. Barra de escala = 1.000 mm, uma ampliação de 4X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Co coloração por fluorescência das células no andaime (.
Figura 7: Ensaio de conversão Resazurina (A) reacção de redução bioquímica de corante redox (resazurina) em um produto final (resorufina) que emite fluorescência e sofre alterações colorimétricas.. (B) actividade mitocondrial foi medido quando as células foram plaqueadas no andaime densidade de 0,75 mg / cm. Os dados foram coletados por meio de fluorescência aparelho de medição baseado. A intensidade de fluorescência a 590 nm (eixo Y) em pontos de tempo definidos (eixo X) é descrito como um resultado da medição quantitativa da viabilidade celular (ex = 540 nm, Em = 590 nm). A significância estatística foi determinada utilizando ANOVA e o erro padrão da média (SEM) é mostrado como uma barra de erro. Considerando as propriedades físicas de andaime, por exemplo, o tamanho dos poros e propriedades mecânicas (por exemplo, o recurso de amortecimento) juntos, andaime densidade de 0,75 mg / cm³ foi utilizada para a caracterização de biocompatibilidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| componentes de mídia | Concentração |
| meio basal aMEM (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabela 1: cultura celular composição (aMEM) de mídia.
| Problema | Causa | Solução |
| imaging viabilidade celular no andaime não-transparente | Andaime impede que a luz penetre sem distorção | Use a técnica de imagiologia com base fluoróforo para avaliação celular. |
| A interferência de intensidade de fluorescência | Auto fluorescência, o sinal de fundo | Preste atenção aos fluoróforos e uso apropriado baseado em propriedades particulares de andaime. |
| avaliação da viabilidade celular no andaime ao longo de um período de cultura | Rmedições epeated durante um longo tempo | Transfectar as células com partículas de ad-GFP-vírus. |
| avaliação de funcionalidade celular no andaime não transparente | técnica de imagem de fluorescência permite apenas células espalhando análise do padrão. | Execute resazurina ensaio de conversão (medição da viabilidade celular quantitativa) em uma combinação com a técnica de imagem. |
Quadro 2: Resumo: solução de problemas da imagem viabilidade celular no andaime não transparente.
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Discussion
A superfície andaime desempenha um papel importante na sua interacção com o tecido circundante in vivo, determinando assim implantes durabilidade funcional. Assim, a bio-compatibilidade do andaime é estudada por ensaios in vitro utilizando células (linha de células SCP1), quando plaqueadas sobre os andaimes.
técnicas de microscopia que funcionam bem com andaimes finas e opticamente transparentes são pouco adequados para andaimes não transparentes para estudar a biocompatibilidade. Isto é principalmente porque os andaimes não transparentes evitar que a luz penetre sem distorção significativa 15. Para superar parcialmente esses problemas Aqui se estabelecer um método para a avaliação de células on / in scaffolds titânio feitas de malha usando vários fluoróforos.
A fim de permitir tricô seguido por dobragem dos fios de titânio, o material entrar em contacto com substâncias corrosivos e tóxicos fortes (lubrificante, mordente, electrosolução), o que pode alterar a biocompatibilidade do andaime, se os traços permanecem em / no cadafalso -polishing. Com a ajuda de um protocolo indireta de fluorescência desenvolvido (protocolo 5) que pudéssemos visualizar a estrutura de andaime. Além disso, as características de andaimes, por exemplo, a espessura do material, o tamanho dos poros e a forma, ou a densidade conjuntivo, foram analisados utilizando o ImageJ. Um epifluorescência superior ampliada imagem microscópica permitiu visualizar impurezas no andaime, bem como sobre a superfície do andaime. A Figura 3B representa, assim, o resultado de confirmação do protocolo de limpeza desenvolvido com sucesso. O princípio deste protocolo de coloração indirecta pode ser facilmente reproduzido a outros andaimes não transparentes, tendo em consideração as propriedades de andaime individuais, por exemplo, o tamanho do poro e a difusão correspondente que afecta o tempo de incubação. Além disso, auto-fluorescência das configurações de andaime e microscópicas afeta a escolha de fluorophores utilizado. O visualizador online espectral ferramenta de fluorescência pode ajudar a escolher os fluoróforos adequados.
interacção célula-metal foi examinada indirectamente através da análise do padrão de aderência de células no andaime. Protocolo 6 descreve a metodologia de como as células pode ser monitorizada in vitro se semeadas em andaimes não transparentes em sistemas de cultura, utilizando uma estratégia de transf ecção de GFP. Com base em resultados preliminares de ensaios in vitro, tem sido previsto que as propriedades de superfície, tais como a composição, a micro-rugosidade da topografia e 16 pode desempenhar um papel importante no estabelecimento de adesão e propagação de células alvo. Titânio ser um biomaterial, assim, pode estar a actuar como um molde de substrato para fornecer base para a fixação das células (ver Figura 4).
Topografia da superfície do implante foi relatado para influenciar o comportamento das células 16. No presente estudo, analisamos o crescimento de células /espalhando e viabilidade usando técnicas de coloração de fluorescência em combinação com as medições de viabilidade quantitativos. A análise revelou sutil variação em percentagem de células viabilidade e espalhando dependendo do material de andaime. No entanto, a funcionalidade celular avaliada quantitativamente por resazurina ensaio de conversão (atividade mitocondrial), não foi significativamente afetada pelo material andaime. A medição da actividade mitocondrial por resazurina conversão tem a vantagem de que não é tóxico e, assim, a célula pode ser realizado repetidamente durante um período de cultura de comprimento. Um cuidado especial deve ser tomado ao lavar off solução de trabalho resazurina residual, de modo a não acumular sinal de fundo (resultados falsos positivos). Apesar destas vantagens, o ensaio de conversão resazurina não vai dar qualquer informação sobre a célula se espalhando no cadafalso. As células GFP infectado, portanto, pode ser rastreado por um longo período de cultura (sinal de GFP permaneceu constante por mais de 14 dias), permitindo assim visualizar spadrão de crescimento ESPECÍFICAS na superfície do andaime. A visualização das células mais profundas no andaime é ainda limitado pelo material de andaime e, assim, requer a dissecção do implante. A combinação destas duas técnicas tem a grande vantagem de que pode ser facilmente transferido para outros tipos de células, considerando que o tempo de incubação pode ter de ser adaptado ao tipo de células de interesse. No entanto, o cuidado deve ser tomado ao transferir esse método para outros andaimes não transparentes, por exemplo, o colágeno andaimes que geralmente apresentam uma forte auto-fluorescência verde 17 base. Neste caso podem ser utilizados outros marcadores fluorescentes. A combinação dos acima indicados dois métodos, por conseguinte, tem várias vantagens (ver Tabela 2).
Características de andaime, por exemplo, tamanho dos poros células poderiam armadilha dentro do andaime. Se não o suficiente nutrientes são fornecidos, estas células podem morrer e secretar proteases que afetam a viabilidade celular da bordaduraing células / tecido. Fomos capazes de adaptar uma fluorescente com base protocolo de coloração que é capaz de visualizar as células vivas e mortas e no andaime de titânio malha. Semelhante ao protocolo de coloração por fluorescência indirecta, o princípio do presente protocolo de coloração pode ser facilmente transferido para outros andaimes não transparentes. Enquanto isso, as propriedades de andaime individuais, por exemplo, o tamanho de poro e de difusão correspondente, bem como possível auto-fluorescência, configuração microscópica tem que ser tomado em consideração visto que pode afectar o tempo de incubação e a escolha dos fluoróforos utilizado. Aqui, mais uma vez o espectador em linha espectral ferramenta de fluorescência pode ajudar a escolher os fluoróforos adequados.
Em resumo, os resultados in vitro indicam que o modelo de núcleo do implante de titânio malha proposto tem um perfil biológico. A fixação inicial de células precursoras mesenquimais do estroma (células SCP-1) sobre este material sugere que este titânio materia implante de ligaL é biocompatível. Embora não tenhamos analisado associação de diferentes parâmetros topográficos, modificação da superfície do andaime pode aumentar a proliferação aderência celular, bem como a diferenciação 18. Óptima compatibilidade entre células e andaime aumentar a probabilidade de uma melhor integração do implante para o tecido circundante e assim a melhoria na longevidade vivo após o tratamento 19. Utilizando a configuração acima referido teste abre a possibilidade de medir e visualizar as melhorias no desempenho biológico do andaime induzida por modificações de superfície. A preferência de andaimes com a superfície bioativa sobre implante desenhos não modificados sugere a melhor performance de 20 em termos de integração osteo-condrogênica. Este estudo é reforçada por outros relatórios sobre o implante de titânio malha onde a sua propriedade mecânica e bioatividade foram relatados 6,7.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. Nenhuma parte do trabalho foi ou está atualmente sob consideração para publicação ou que tenha sido publicado anteriormente.
Acknowledgments
Projeto é parcialmente financiado pelo Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. A taxa de publicação foi coberta pelo trauma do hospital BG Tübingen, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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