Summary
Vi præsenterer her en fluorofor baseret imaging teknik til at detektere cellelevedygtighed på et ikke-transparent titanium stillads samt at detektere glimt af stilladset urenheder. Denne protokol fejlfinding af den ulempe afbildning celle-celle eller celle-metal interaktioner på uigennemsigtige stilladser.
Introduction
Kroniske rygsmerter er en multifaktoriel sygdom. Interessen for en minimalt invasiv løsning for den degenerative disc sygdom behandling er vokset siden 1950'erne. Indtil i dag, multi-segmental fusion af rygsøjlen er den mest udbredte behandling. Da denne fremgangsmåde ofte fører til begrænsninger i mobiliteten af det påvirkede segment 1,2, udforskning af artroplastik æra blev en bred interesse. Væsentlige fremskridt i alt disk udskiftning og kerne udskiftning er blevet et godt alternativ til behandling af kroniske rygsmerter 1. Trods de enorme fremskridt, har ingen af de metoder blevet klinisk evalueret. De mindre stive nucleus implantater udgør et lovende alternativ til total udskiftning af bremseskive, forudsat at fibrøse ring er intakt 3,4. Imidlertid er de for tiden foreliggende nucleus implantater på markedet ofte forbundet med komplikationer som ændringer i hvirvellegemet, dislokation, lodrette højde tab af skiven og than mangler nødvendige tilhørende mekanisk stivhed 5. For at overvinde de nuværende ulemper, har en hidtil ukendt kerne implantat lavet af strikkede titanium ledninger blevet udviklet 6. På grund af den unikke strikkede struktur, har denne nyudviklede stillads vist fornemme biomekaniske egenskaber, f.eks dæmpning funktion, porestørrelse, lastning kapacitet og pålidelighed 7. Med sigte på at teste biokompatibilitet af denne hidtil ukendte kerne implantat, afbildet alvorlige begrænsninger i de (optiske) analyseteknikker tilskrives den uigennemsigtige natur af implantatet.
For at teste biokompatibilitet, celle-metal interaktion spiller en fremtrædende rolle 8-10. En interaktion mellem cellerne og stilladset er nødvendig for stabilisering og dermed for bedre implantat integration i værtssystemet. Dog kan en stigende indvækst dybde ændre de mekaniske egenskaber af stilladset. Med sigte på at undersøtigate om stilladset overflade tilvejebringer en base for cellevedhæftning, proliferation og differentiering, eller om metallet påvirker cellelevedygtighed, er det vigtigt at foretage fejlfinding af fælles velkendt problem med billeddannelse celler på / i ikke-transparente og uigennemsigtige stilladser. For at overvinde denne begrænsning flere fluorescerende blev baserede teknikker udforsket. Virksomheder giver en bred vifte af fluoroforer at visualisere levende celler, cellulære rum, eller endda specifikke cellulære stater 11. Fluoroforer for dette eksperiment blev valgt ved hjælp af online-værktøjet spektral seeren med henblik på bedst passer til vores fluorescerende mikroskop.
Den udviklede strategi for analysen af den vedhængende celler adfærd på / i uigennemsigtige strikket titan stillads omfatter følgende: 1) fluorescerende (grønt fluorescerende protein / GFP) mærkning af de osteochondro-progenitorceller for at tillade sporing af cellerne på stillads, 2) måling af levedygtigheden (mitochondrial aktivitet) af cellerne, og 3) visualisering celle-celle- og celle-materiale interaktioner inden stilladset. Proceduren har den fordel, at det let kan overføres til andre adhærente celler og andre ikke-transparent eller uigennemsigtig stillads. Endvidere kan levedygtighed og indvækst mønster overvåges over flere dage, således den kan bruges med begrænsede mængder af stillads materiale eller celler.
Den foreliggende undersøgelse viser den vellykkede anvendelse af vores aktuelle protokol til måling af cellelevedygtighed og visualisere i-vækstmønster osteochondro-progenitorceller på / i uigennemsigtige strikket titan stillads. Desuden kan de udviklede protokoller anvendes for at bestemme stilladset urenheder og kontrollere rengøring protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: immortaliseret human mesenchymal stromale precursorceller (SCP-1 celler) blev anvendt til forsøgene. SCP-1 celler blev leveret af professor Matthias Schieker 12.
1. Udvidelse af SCP-1-celler
- Forud for arbejdet med SCP-1 celler, korrekt rengøre arbejdsområdet (betegnet biosikkerhed kabinet I) med 70% ethanol (v / v) iført handsker.
- I den rensede biosikkerhed kabinet forberede et passende volumen cellekulturmedium ved at blande de nødvendige komponenter som angivet i tabel 1. For at opretholde steriliteten af det basale medium, tilsættes kosttilskud ved at passere gennem sterile filtre med en porestørrelse på 0,22 um.
- For at undgå kontaminering forberedes medium mindst 24 timer før brug. For at teste dens sterilitet, inkuberes 1 ml medium i en cellekultur plade uden celler i standard cellekultur inkubator: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% luftfugtighed. Efter24 timer, check medium mikroskopisk ved hjælp af en forstørrelse på mindst 200X.
- Oprethold SCP-1-celler i en standard cellekultur inkubator med støttende betingelse: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% luftfugtighed.
- For vedligeholdelse og udbygning, dyrke SCP-1 celler, indtil de når 80-90% sammenflydning. I løbet af denne tidsperiode kultur, ændre medium hver 2-3 dage. Efter at have nået 80-90% sammenflydning, split SCP-1-celler (generelt en 1: 2-forhold) til den næste passage for ekspansion eller plade til forsøgene (som angivet).
- Til opdeling af SCP-1-celler, opvarmes dyrkningsmediet ved 37 ° C og optøs trypsin / EDTA anvendelse af et vandbad ved 37 ° C.
- Helt aspirere dyrkningsmediet fra 80-90% konfluerende celler og smid den i en affaldsbeholder.
- Vask cellerne mindst to gange med DPBS (Dulbeccos phosphatbufrede saltvand uden magnesium og calcium, pH 7,2).
- Pipette en passende mængdeDPBS på cellerne (5 ml DPBS for en T75 dyrkningskolbe og 12 ml til en T175 dyrkningskolbe).
- Aspirer DPBS omhyggeligt og kassér den i en affaldsbeholder.
- Pipettere et passende volumen 0,25% trypsin / EDTA på cellerne (1 ml DPBS for en T75 dyrkningskolbe og 2 ml til en T175 dyrkningskolbe) og inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator med 5 % CO2, 20% O2 og 90% luftfugtighed.
- Løsne cellerne ved at trykke beholderen og sikre alle celler frigøres fra kulturen plast (trypsinbehandling) ved at observere de flydende celler under mikroskopet.
- Inaktivere trypsin reaktionen ved tilsætning af 10 ml dyrkningsmedium. Bland trypsin og celler med mediet omhyggeligt ved gentagen pipettering.
- Overfør cellesuspensionen i et reagensglas og centrifugeres ved 600 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml kulturmedium.
- Tæl cellerne ved trypanblåt udelukkelse fremgangsmåde som beskrevet i protokol 2.
- Frø cellerne afhængigt af eksperimentelle design.
2. Tælling af SCP-1-celler
- Udfør en levedygtig celletælling (trypanblåt ekskluderingsmetode) af de resuspenderede celler ved anvendelse af et hæmocytometer.
- Forud for celletal, rengøre hæmocytometeret bruge vand fra hanen. Tør hæmocytometeret komponenter ved hjælp af en fnugfri væv. Samle det ved at befugte dækglasset og trykke den omvendt på de to glas løbere på hver side af optællingen område. Sørg for, at newtonske ringe ses på glas løbere (Figur 1).
- Tage 10 pi af de resuspenderede celler og blandes med 10 pi 0,1% trypanblåt-opløsning til opnåelse af en fortyndingsfaktor på 2.
- Load 10 pi af den samlede stikprøve på forhånd renset og samlet hæmocytometer kammer.
- Tæl antallet af levende (hvid / gennemsigtig celler) og døde(blå kerner) celler på 4x4 kvadrater (se figur 1 B).
- Beregn det totale antal celler efter den givne formel:
3. GFP Transfektion af SCP-1-celler
BEMÆRK: For at observere SCP-1 cellevækst på og ind i den strikkede titanium stillads over en vis dyrkningsperiode markerede vi cellerne med grønt fluorescerende protein (GFP). Overekspression af GFP opnås ved infektion med adenoviruspartikler koder for GFP. Replikationsinkompetent (-E1 / -E3) adenoviruspartikler koder for grønt fluorescerende protein (GFP) blev anvendt til at inficere SCP-1-celler. Viruspartiklerne blev opnået fra Prof. Steven Dooley 13 ved at indsamle kultursupernatant af rekombinant adenovirus (Ad5-GFP) transficerede HEK293T celler (biosikkerhed lab II). Tre gentagne fryse (-80 ° C) og optøning (37 ° C i vandbad) cyklusser sikres, at ingen HEK293T celler forbliver levedygtige til at producere nye viruspartikler. Brug af denne adenovirus stamkultur kan effektivt inficere SCP-1-celler uden at frembringe nye viruspartikler. Således kan de inficerede celler håndteres i et biosikkerhed Lab I.
- Resuspender målcellerne (SCP-1 celler) med en seeding tæthed på 50.000 celler / ml i dyrkningsmedium. Pipetter 2 ml per brønd i en 6-brønds vævskulturplade.
- Der inkuberes ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator; 5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed, indtil SCP-1-celler nå en konfluens på 70-80%.
BEMÆRK: konfluens afhænger udsåningstæthed af cellerne. For ovenfor angivne betingelser, SCP-1-celler nå en konfluens på 70-80% i 1,5-2 dage. - Ved en sammenflydning på 70-80%, uden at aspirere dyrkningsmediet tilsættes 100 pi af adenovirus froeunderlag per 1 ml dyrkningsmedium.
- Bestem koncentrationsområdet individuelt afhængigt af mængden af viruspartikler i hvert virus seed lager forberedelse. I tilfælde af at infektionen effektivitet er for lav, oprense og koncentrere viruspartikler under anvendelse af forskellige kommercielt tilgængelige kits.
- Der inkuberes i en time i standard cellekultur inkubator ved 37 ° C (5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed).
- Fjern dyrkningsmedium indeholdende virus stamkultur og indsamle det til bortskaffelse. Tilføj frisk dyrkningsmedium 2 ml per brønd af en 6-brønds-kultur-plade til at genopbygge.
- Sørg for at der forud for bortskaffelse, er virus partikel medium autoklaveres.
- Evaluere den intracellulære GFP-ekspression (infektionseffektivitet) 24 timer efter infektionen under anvendelse af et fluorescensmikroskop med et GFP LED kube / filtersæt.
- Observere cellemorfologien (figur 2). Celler aftagning fra kulturen plast kan give falske positive resultater.
4. Rensning af Strikkede Titanium Stilladser
- Psnøre til 5 skeletter i et 50 ml reagensglas.
- Vask stilladset (6-7 mm tykkelse) tre gange med 30 ml destilleret-demineraliseret vand i 20 minutter ved stuetemperatur, under anvendelse af rotor betingelser (8 XG).
- Erstatte destilleret-demineraliseret vand med 30 ml 1% (vægt / volumen) Triton-X-100-opløsning (opløst i destilleret-demineraliseret vand) og derefter vaske stilladser gang i 20 minutter ved stuetemperatur, under anvendelse af rotor betingelser (8 xg) .
- Kassér Triton-X-100-opløsning efterfulgt af vask med 30 ml destilleret-demineraliseret vand to gange (5 minutter hver ved stuetemperatur) opretholdelse rotor betingelser (8 XG).
- Erstatte destilleret-demineraliseret vand. Skyl scaffolds sekventielt med reagenskvalitet 99% acetone, 99% isopropanol og 99% ethanol (30 ml hver) i 2 x 5 minutter hver i ultralydsbad (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Udvaskes igen tre gange med 30 ml destilleret-demineraliseret vand i 5 minutter, holde ultralydsbad behandling konstant.
- Placer scaffoninger på en fnugfri væv for at lufttørre natten over ved stuetemperatur.
- Autoklaver stilladset i 15 minutter ved 121 ° C med 15 psi.
- Bekræft rengøringsprotokol ved indirekte fluorescens, som beskrevet i protokol 5.
5. Imaging Scaffold Structures ved indirekte Fluorescens
BEMÆRK: Den nuværende protokol beskriver billeddannelse af stillads strukturer ved indirekte fluorescens hjælp fluorophoren sulforhodamin B, som giver en klar rød fluorescens ved en ex / em bølgelængde på 565/586 nm. Imidlertid kan fluoroforen ændres til bedre egnet til givne mikroskop indstillinger eller mulig autofluorescens af stilladset.
- Forbered sulforhodamin B farveopløsning (0,04%) i 1% eddikesyre og opbevares ved stuetemperatur med beskyttelse mod lys.
- Tag en 24-brønds vævskulturplade og nedsænkes renset stillads i 500 pi af sulforhodamin B farvningsopløsning ved at placere det insIdé de godt ved hjælp af pincet.
- Fange de negative billeder af stilladset anvendelse af fluorescens mikroskop.
- Tag billeder med en RFP LED kube / filter sæt med en excitationsbølgelængde på 531/40 nm og en emissionsbølgelængde på 593/40 nm. Alternativt vælger den passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescensen spektrale seeren 20. Sulforhodamin B har sit højdepunkt excitation ved 578 nm og sit højdepunkt emission ved 593 nm.
- For at visualisere stillads struktur, tage billeder ved lavere forstørrelser, f.eks 4X eller 10X (figur 3). Ved hjælp af disse billeder, bestemme karakteristika, fx pore- størrelse og form ved hjælp af ImageJ.
- For at kunne detektere stillads urenheder, tage billeder ved højere forstørrelser, f.eks 20X eller 40X, i betragtning af at dette vil begrænse analysen dybde. Sørg for, at snavs partikler / stoffer er ikke set (se repræsentative resultater, figure 3).
6. In vitro Biokompatibilitet Assay
- Pre-varme dyrkningsmediet ved 37 ° C i et vandbad.
- Tag en 24-brønds vævskulturplade og med pincet, placere de rensede og steriliserede stilladser i hver brønd aseptisk. Arbejdet under pre-rengjort biosikkerhed kabinet jeg!
- Soak / inkuber stilladser med et dyrkningsmedium til omkring 15 min (500 pi per brønd af en 24-brønds vævskulturplade), for at fjerne luft fra indersiden af stilladset.
- I mellemtiden, resuspender 500.000 Ad-GFP-inficerede SCP1 celler i 1 ml dyrkningsmedium.
- Efter 15 minutter af stillads iblødsætning, aspireres mediet helt væk fra stilladset.
- For podning af cellerne på stilladset dispenseres 100 pi cellesuspension forsigtigt på stilladset (som er placeret i 24-brønds plade) overflade. Oprethold et minimum volumen af cellesuspension mens såning cellerne, så for at sikre ingen strømmer out af stilladset.
- Inkubér cellerne i 30 minutter ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed).
- Der tilsættes 500 pi mere dyrkningsmedium og inkuberes i 24 timer i standard cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed).
- Evaluere celleadhærens mønster og cellespredning på stilladset overflade ved anvendelse af et fluorescensmikroskop.
- Tag billeder med en GFP LED kube / filter sæt med en excitationsbølgelængde på 470/22 nm og en emissionsbølgelængde på 510/42 nm. Alternativt vælger den passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescens spektral seeren. GFP har sit højdepunkt excitation ved 488 nm og sit højdepunkt emission ved 507 nm.
- For at visualisere celleadhærens capture mønster billeder ved lavere forstørrelser, f.eks 4X eller 10X (figur 4). For at observere cellespredning en højere magnification (mindst 100X) er nødvendig - at begrænse fokus dybde.
- For yderligere at evaluere celle spredning på skafottet overflade, fikseres cellerne med 4% formalin og fortsætte med konventionel fluorescens farvning af cellulære strukturer, f.eks actinfilamenter (Phalloidin). Men tilpasse inkubationstider og fluorescerende mærkning af antistofferne for at passe de individuelle stillads egenskaber, fx diffusionstider eller autofluorescens 14.
- Den næste dag, ændre dyrkningsmediet til fjernelse af ikke-adhærerende celler.
- Beregn procentdelen af adhærerende celler på stilladset ved resazurin konvertering måling som beskrevet i protokol 7.
Figur 5: Tidslinje for in vitro assay (A) Eksperimentel opsætning til plating celler.. (B Klik her for at se en større version af dette tal.
7. Resazurin Konvertering måling
BEMÆRK: Resazurin konvertering assay anvendes til måling af mitokondrielle aktivitet og dermed indirekte celleproliferation. Resazurin reduktion til resorufin frembringer et fluorescerende signal, som er baseret på det mitokondrielle aktivitet associeret med levedygtige celleantal (figur 7A).
- Aspirér kulturmediet fra SCP-1-celler og kassere det ned i en affaldsbeholder.
- Vask de SCP-1-celler en gang med DPBS for at fjerne løsnede celler. Der tilsættes 500 pi DPBS pr brønd i 24-brønds vævskulturplade indeholdende SCP-1-celler på stilladset.
- Dæk cellerne med en påkrævet amount steril resazurin arbejdsopløsning (0,25% resazurin i dyrkningsmedium) og inkuberes ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed) i 30 min.
- Notér det; Inkubationstiden afhænger af celletypen og celledensitet. Det kan variere mellem 10 minutter og 6 timer. Optimeret inkubationstid for SCP-1-celler er 30 min.
- Som baggrund kontrol, omfatter mindst en brønd med resazurin arbejdsopløsning men uden celler, der inkuberes ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed) i den samme mængde tid.
- Overfør 100 ul konditionerede supernatant fra hver brønd i 24-brønds vævskulturplade i en 96-plade med mikrobrønde.
- Vask de resterende celler tre gange med 1 ml DPBS i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne resterende resazurin arbejdsopløsning. Efter den tredje vask tilføje dyrkningsmedium to implantaterne med SCP-1-celler (500 pi per brønd af 24-brønds vævskulturplade) og fortsætte inkubation ved 37 ° C i standard cellekultur inkubator (5% CO2, 20% O2 og 90% fugtighed) for yderligere tidsforløb målinger.
- Sørg for at oprette gentagelser på dette trin (2-4) for at minimere pipetteringsfejl.
- I mellemtiden placere 96-mikrobrøndsplade ind mikropladelæseren og måle fluorescensen af det dannede resorufin.
- For at reducere baggrundssignal, måle fluorescens ved en excitationsbølgelængde på 545 nm og en emissionsbølgelængde på 585 nm.
- Alternativt vælger den passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescens spektral seeren. Resorufin har sit højdepunkt excitation ved 572 nm og sit højdepunkt emission ved 585 nm. Den givne signalintensitet er et gennemsnit af 25 individuelle målinger (25 blink pr brønd).
- Mål fluorescence af dannet resorufin i konditioneret medium efter bottom optik.
- Notér, at gevinsten afhænger af den gennemsnitlige mængde resazurin konverteres og kan variere mellem 10 og 4000. Justere forstærkningen til den enkelte mikropladelæser anvendes ved pipettering en resorufin standardkurve, således at det fluorescerende signal er under 80% af den maksimale signalintensitet påviseligt (i dette tilfælde 20.000). Den optimerede forstærkning for SCP-1 celler er 800.
- Træk baggrunden signal (resazurin arbejde løsning uden celler) fra signal af prøver.
- Afhængig af forsøgsopstillingen / formål, fortsætte med yderligere trin:
- Beregn procentdelen af levedygtigheden af cellerne på stilladset anvendelse af en standardkurve. Lav en individuel standardkurve separat for hver cellelinje anvendes.
- Analyser cellevækst / proliferation ved at estimere den relative stigning i resazurin omdannelse hele dyrkningen tid. Til denne beregning, sætden resazurin konvertering på dag 1 som reference. Frisk forberede resazurin arbejder løsning for denne form for analyse. Endvidere inkubationstider skal være lig mellem de forskellige målinger.
- Gentag hele protokollen af resazurin konvertering måling mindst tre gange for at få ensartede resultater.
8. Levende-dead farvning
- Plate de SCP1 celler på stilladset med en seeding tæthed på 50.000 celler / stillads og tillader den at vokse på stilladset holde faste celledyrkningsbetingelser (se protokol 1 og 2).
- Efter 24-48 timers helt aspirere dyrkningsmediet fra SCP-1 celler og smid den i en affaldsbeholder.
- Vask de SCP-1-celler en gang med DPBS for at fjerne løsnede celler. Tilføj 500 pi DPBS pr brønd i 24-brønds vævskulturplade og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Stain SCP-1 under anvendelse af fluoroforer (alle tre pletter på samme tid):
- Fra nu afholde stilladser i mørke for at beskytte fluoroforer blegning fra dagslys!
- Indstil en inkubationstid til 30 minutter for at muliggøre ensartet fordeling i hele stilladset. Hvis overførsel til andre stilladser, så sørg for at optimere inkubationstiderne til at passe de individuelle stillads karakteristika (porestørrelse, stillads dybde, etc.).
- For at detektere levedygtige celler på stilladset, farvning af cellerne med calcein AM i en slutkoncentration på 2 uM (i dyrkningsmedium).
- For at detektere alle celler på stilladset, farvning af cellerne med Hoechst 33342 i en slutkoncentration på 0,002 pg / pl (i dyrkningsmedium).
- For at detektere døde celler, inkuberes stilladset med ethidiumhomodimer ved en slutkoncentration på 4 um (i dyrkningsmedium).
- Efter inkubationstiden vaskes cellerne 3 gange med DPBS (1 ml pr brønd) i hver 5 minutter ved stuetemperatur.
- Umiddelbart tage billedes ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
- Tag billeder af calcein (levende celler) med en GFP LED kube / filter sæt (excitation og emission bølgelængde på 470/22 nm og 510/42 nm). Alternativt vælger en passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescens spektral seeren. Calcein har sit højdepunkt excitation ved 488 nm og sit højdepunkt emission ved 507 nm. Bemærk: Sørg for ikke at bruge GFP transfekterede celler til fluorescens farvning med Calcein eller andre grønne fluorescerende pletter.
- Tag billeder af Hoechst 33342 med et DAPI LED kube / filter sæt med en excitationsbølgelængde på 357/44 nm og en emissionsbølgelængde på 447/60 nm. Alternativt vælger den passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescens spektral seeren. Hoechst 33342 har sit højdepunkt excitation ved 347 nm og sit højdepunkt emission ved 483 nm.
- Tag billeder af ethidiumhomodimer med en RFP LED kube / filter sæt (excitation og emission bølgelængde of 531/40 nm og 593/40 nm). Alternativt vælger den passende excitations- og emissionsbølgelængden med hjælp af fluorescens spektral seeren. Ethidiumhomodimer har sit højdepunkt excitation ved 530 nm og sit højdepunkt emission ved 618 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foreløbige resultater viste, at den beskrevne hidtil ukendte kerne implantat ikke kun har gode dæmpningsegenskaber funktioner, men også er biokompatibel med SCP-1-celler. Under produktionen af implantatet, det kommer i kontakt med stærke ætsende og giftige stoffer (smøremiddel, bejdsemiddel, elektro-polering opløsning). Med hjælp af indirekte fluorescerende farvningsteknikker kunne vi visualisere resterende urenheder og følgelig optimere en rengøringsprotokol viser signifikant reduktion i substans belastning på stilladset. Figur 3 viser effektiviteten af etablerede rengøringsprotokol.
Succesen med implantater, der anvendes til artroplastik behandling bestemmes af begivenheder, der finder sted ved cellepositionen materialegrænseflade. Figur 4 viser cellerne fastgjort på stilladset efter 24 timer i yderklædningen, som beskrevet i protokollen sektion 6. En væsentlig transinfektion effektivitet SCP-1-celler blev observeret som vi kunne afbilde vækstmønster mesenchymale stromale precursorceller på stilladset (se figur 2). Direkte visualisering bekræfter biokompatibilitet stilladset og også viser vedhæftningen mønster på stilladset overflade (figur 4). Fluorescensfarvning kan gøres yderligere at undersøge celle interaktion med og spredning på stilladset overflade.
Fluoroforer blev med succes anvendt for at undersøge celledød og proliferation over en periode på stilladset. Levende dead-farvende billeder eksemplificere, hvordan farvning kan med held gøres på stilladset for at bekræfte procent levedygtigheden af celler over en periode. Figur 6 viser blå nuklear farvning (Hoechst 3342) i alle celler, rød fluorescensmærket (ethidiumhomodimer) døde celler og grøn mærkning til inkorporering af calcein-AM som levedygtighed marker. Calcein AM omdannes til calcein som udviser en lys grøn fluorescens i nærværelse af calciumioner i cytoplasmaet af cellerne. Hoechst 33342 er cellevæg gennemtrængelig og interkalerer i det cellulære DNA. Denne måde alle celler vil vise blå kerner (se figur 6). Ethidiumhomodimer er ikke cellevæg gennemtrængelig, således vil det kun interkalerer i DNA'et i døde celler. På denne måde vil døde celler viser røde kerner. Endvidere blev cellelevedygtighed og fold stigning i celletal på stillads over en uge kvantificeret ved resazurin omdannelse assay og gengives grafisk (figur 7).
Figur 1: celletælling med et hæmocytometer (A) Opsætning af et kammer forsamling.. (B) Illustration af tælle kamre; 4 x 4 tællekammer anvendes til en celle count. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. GFP transfektion effektivitet SCP1 celler udviser en stærk grøn fluorescens indikerer positiv ad-GFP- transfektion effektivitet. Scale bar = 1000 um, 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sulforhodamin B farvning negative billeder capture (A) Stillads før rengøring.. Pil indikerer tilstedeværelsen af giftige / ætsende stoffer på stilladset. (B) Stillads efter rengøringsprotokol. Scale bar = 1000 um, 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Overholdelse mønster af SCP1 celler på stilladset GFP signal angiver celleadhærens og vækst mønster på overfladen af det strikkede titanium stilladset. Scale bar = 1000 um, 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Co-fluorescens-farvning af celler på stilladset (.
Figur 7: Resazurin konvertering assay (A) Biochemical reduktionsreaktion af redox-farvestof (resazurin) til en færdigvare (resorufin), der udsender fluorescens og undergår kolorimetriske ændringer.. (B) mitochondrial aktivitet blev målt, når cellerne blev udpladet på 0,75 mg / cm³ densitet stillads. Dataene blev indsamlet ved brug fluorescence baseret måleinstrument. Fluorescensintensitet ved 590 nm (y-aksen) ved definerede tidspunkter (x-akse) er afbildet som et resultat af kvantitativ cellernes levedygtighed måling (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). Den statistiske signifikans blev bestemt ved anvendelse To-vejs ANOVA og standardfejlen af middelværdien (SEM) er vist som en fejl barer. I betragtning af de stillads fysiske egenskaber, f.eks porestørrelse og mekaniske egenskaber (f.eks dæmpning funktion) sammen, blev 0,75 mg / cm³ tæthed stillads bruges til biokompatibilitet karakterisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
| mediekomponenter | Koncentration |
| Basal aMEM media (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabel 1: Cellekultur (aMEM) Media sammensætning.
| Problem | Årsag | Løsning |
| Cellernes levedygtighed imaging på uigennemsigtige stillads | Stillads forhindrer lys i at trænge uden forvrængning | Brug fluorofor baseret billeddannelse teknik til celle vurdering. |
| Interferens af fluorescensintensitet | Auto fluorescens, baggrundssignal | Vær opmærksom på de fluoroforer og anvende passende baseret på bestemte stillads egenskaber. |
| vurdering cellelevedygtighed på stillads over en dyrkningsperiode | Repeated målinger over lang tid | Transficere cellerne med Ad-GFP-viruspartikler. |
| Cell funktionalitet vurdering på uigennemskuelig stillads | Fluorescensimagografi teknik tillader kun cellespredning mønster analyse. | Udfør resazurin konvertering assay (kvantitativ cellelevedygtighed måling) i en kombination med billeddannelse teknik. |
Tabel 2: Oversigt: fejlfinding levedygtighed cell imaging på uigennemskuelig stillads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stilladset overflade spiller en vigtig rolle i dets interaktion med omgivende væv in vivo for derved at bestemme implantater funktionel holdbarhed. Således er biokompatibilitet af stilladset undersøgt ved in vitro-assays ved anvendelse af celler (SCP1 cellelinie), når udpladet på stilladser.
Mikroskopiteknikker, som fungerer godt med tynde og optisk transparente stilladser er dårligt egnet til uigennemsigtige stilladser at studere biokompatibilitet. Dette er hovedsageligt fordi de ikke-transparente stilladser forhindrer lys i at trænge uden væsentlig forvrængning 15. Til dels overvinde disse problemer vi hermed etablere en fremgangsmåde til celle vurdering på / i strikkede titanium gjort scaffolds ved hjælp af forskellige fluoroforer.
For at muliggøre strikning efterfulgt ved foldning af titanium ledninger, materialet kommer i kontakt med stærke ætsende og giftige stoffer (smøremiddel, ætsende, elektro-polishing opløsning), der kan ændre biokompatibilitet stilladset hvis spor tilbage i / på stilladset. Med hjælp fra en udviklede indirekte-fluorescens protokol (Protokol 5) kunne vi visualisere skeletstrukturen. Endvidere stillads egenskaber, fx materialetykkelsen, den enkelte pore størrelse og form, eller den forbindende densitet, blev analyseret under anvendelse ImageJ. En højere forstørret epifluorescens mikroskopisk billede tilladt visualisere urenheder i stilladset samt på stilladset overflade. Figur 3b repræsenterer således den bekræftende resultat af den succes udviklet rengøringsprotokol. Princippet i denne indirekte farvning protokol kan let reproduceres til andre ugennemsigtige scaffolds, under hensyntagen til de enkelte stilladsdele egenskaber, f.eks porestørrelsen og tilsvarende diffusion som påvirker inkubationstid. Også autofluorescens af stilladset og mikroskopiske indstillinger påvirker valget af fluorophores anvendes. Den online-værktøj fluorescens spektral seeren kan være med til at vælge de passende fluoroforer.
Celle-metal interaktion er blevet undersøgt indirekte ved at analysere adhærens mønster af celler på stilladset. Protokol 6 beskriver metoden for, hvordan celler kan overvåges in vitro hvis forgyldt på uigennemsigtige stilladser i dyrkningssystemer ved hjælp af en GFP transfektion strategi. Baseret på foreløbige resultater af in vitro-assays, er det blevet forudsagt, at overfladeegenskaberne, såsom sammensætning, mikro-topografi og ruhed 16 kan spille en vigtig rolle i etableringen af adhærens og spredning af målceller. Titanium idet et biomateriale således kan fungere som et substrat skabelon for at tilvejebringe base for cellevedhæftning (se figur 4).
Implantatoverfladen topografi er blevet rapporteret at påvirke celle adfærd 16. I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi cellevæksten /spredning og levedygtighed under anvendelse af fluorescens farvningsteknikker i kombination med kvantitative levedygtighed målinger. Analyse afslørede subtile variation i celle procent levedygtighed og spredning afhænger af stilladset materiale. Men celle funktionalitet vurderes kvantitativt ved resazurin konvertering assay (mitokondrie-aktivitet), blev ikke signifikant påvirket af stilladset materiale. Målingen af den mitokondriske aktivitet ved resazurin konvertering har den fordel, at det ikke er celle giftigt og således kan udføres gentagne gange over en lang dyrkningsperiode. Særlig forsigtighed skal tages, når afvaskning resterende resazurin arbejder løsning, så at ikke akkumulere baggrund signal (falske positive resultater). På trods af disse fordele, vil resazurin konvertering analysen ikke give nogen oplysninger om den celle, spredes på skafottet. GFP-inficerede celler dermed kan spores over en lang dyrkningsperiode (GFP signal forblev konstant i over 14 dage), hvorved at visualisere sPECIFIKKE vækstmønster på stilladset overflade. Visualisering af celler dybere i stilladset er stadig begrænset af stilladset materiale og vil således kræve dissektion af implantatet. Kombinationen af disse to teknikker har den store fordel, at det let kan overføres til andre celletyper, i betragtning af at inkubationstiden kan tilpasses til celletypen af interesse. Pleje skal dog tages, når der overføres denne metode til andre uigennemskuelige stilladser, fx collagen baseret stillads, som generelt udviser en stærk grøn auto-fluorescens 17. I dette tilfælde kan anvendes andre fluorescerende tags. Kombinationen af ovenfor angivne to metoder har derfor adskillige fordele (se tabel 2).
Scaffold egenskaber, f.eks porestørrelse måske fælde celler inde i stilladset. Hvis leveres ikke nok næringsstoffer, kan disse celler dør og udskiller proteaser, der påvirker cellelevedygtighed af surrounding celler / væv. Vi var i stand til at tilpasse et fluorescerende baseret farvningsprotokol der er i stand til at visualisere levende og døde celler i og på det strikkede titanium stilladset. Svarende til den indirekte fluorescens farvningsprotokollen, kan princippet i denne farvningsprotokol let overføres til andre ugennemsigtige stilladser. Mens Derved sikrer de enkelte scaffold egenskaber, fx porestørrelse og tilsvarende diffusion så godt som muligt autofluorescens, mikroskopisk indstilling må tages i betragtning, da de kan påvirke inkubationstiden og valget af fluorophorer anvendes. Her, igen online værktøj fluorescens spektral seeren kan være med til at vælge de passende fluoroforer.
Sammenfattende in vitro resultater viser, at den foreslåede strikkede titanium kerne implantat model har en biologisk profil. Indledende fastgørelse af mesenkymale stromale præcursorceller (SCP-1 celler) på dette materiale tyder på, at denne titanium legering implantat material er biokompatible. Selvom vi ikke har analyseret sammenslutning af forskellige topografiske parametre, kan stillads overflademodifikation forbedre cellevedhæftning proliferation samt differentiering 18. Optimal kompatibilitet mellem stillads og celler hæve sandsynligheden for bedre implantat integration i det omgivende væv og således forbedre in vivo holdbarhed efter behandling 19. Under anvendelse af ovenstående angivne forsøgsopstilling åbner mulighed for at måle og visualisere forbedringer i den biologiske ydeevne af stilladset induceret af overflademodifikationer. Den præference for stilladser med bioaktive overflade over ikke-modificerede implantat designs foreslår bedre ydeevne 20 i form af osteo-chondrogen integration. Denne undersøgelse er yderligere forstærket af andre rapporter om strikkede titanium implantat, hvor dens mekaniske ejendom og bioaktivitet er blevet rapporteret 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser. Ingen del af arbejdet har været eller er under overvejelse til offentliggørelse eller er blevet offentliggjort andre steder.
Acknowledgments
Projektet er delvist finansieret af Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Gebyret publikation er omfattet af BG traume hospital Tübingen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
