Summary
Hier presenteren we een fluorofoor gebaseerde beeldvormende techniek om cellevensvatbaarheid te detecteren op een ondoorzichtige titanium draagstructuren alsook oogopslag van de steiger verontreinigingen te detecteren. Dit protocol oplossen van problemen met het nadeel dat de beeldvorming van cel-cel of cel-metaal interacties op ondoorzichtige steigers.
Introduction
Chronische rugpijn is een multifactoriële aandoening. De belangstelling voor een minimaal invasieve behandeling optie voor de degeneratieve discopathie is gegroeid sinds de jaren 1950. Tot op heden, multi-segmentale fusie van de wervelkolom is de meest gebruikte behandeling. Aangezien deze werkwijze vaak leidt tot beperkingen in de beweeglijkheid van het aangetaste segment 1,2 verkenning van het artroplastiek tijd werd een brede interesse. Significante verbeteringen in totaal schijfvervanging en kern vervangen is uitgegroeid tot een goed alternatief voor chronische rugpijn 1. Ondanks de enorme vooruitgang, geen van de werkwijzen is klinisch geëvalueerd. Hoe minder stijve kern implantaten zijn een veelbelovend alternatief voor totaal vervangingsschijf, mits de annulus fibrosus intact 3,4. Echter, de nog aanwezige kern implantaten in de handel vaak geassocieerd met complicaties zoals veranderingen in wervellichaam, dislocatie, verticale hoogteverlies van de schijf en tHij ontbreken van de nodige bijbehorende mechanische starheid 5. Om de huidige nadelen op te heffen, is een nieuwe kern implantaat gemaakt van titanium gebreide draden succes ontwikkeld 6. Door de unieke gebreide structuur heeft deze nieuw ontwikkelde scaffold getoond onderscheiden biomechanische karakteristieken, bijvoorbeeld dempende eigenschap, poriegrootte, het draagvermogen en de betrouwbaarheid 7. Gericht op de biocompatibiliteit van deze nieuwe kern implantaat testen, afgebeeld ernstige beperkingen in het (optisch) analysetechnieken toegekend aan niet-transparante karakter van het implantaat.
Om de biocompatibiliteit testen, cel-metal interactie speelt een prominente rol 8-10. Een interactie tussen de cellen en de steiger nodig is voor de stabilisatie en daarmee een betere integratie implantaat binnen het gastheersysteem. Er kan echter een toenemende diepte ingroei de mechanische eigenschappen van het schavot veranderen. Gericht op investigate of het schavot oppervlak verschaft een basis voor celhechting, proliferatie en differentiatie of dat de metalen cellevensvatbaarheid beïnvloedt, is het belangrijk om de gemeenschappelijke bekend probleem afbeelden van cellen op / in niet-transparante en ondoorzichtige steigers oplossen. Om deze beperking te overwinnen werden verscheidene fluorescentie gebaseerde technieken onderzocht. Bedrijven een groot aantal fluoroforen levende cellen, cellulaire compartimenten of zelfs specifieke cellulaire staten 11 visualiseren. Fluoroforen voor dit experiment werden gekozen met behulp van de online tool spectrale viewer om optimaal fit onze fluorescentiemicroscoop.
De ontwikkelde strategie voor de analyse van de hechtende cellen gedrag / in de ondoorzichtige gebreide titanium scaffold omvat het volgende: 1) fluorescerende (groen fluorescent proteïne / GFP) labeling van de osteochondro progenitorcellen te volgen van de cellen op het toestaan steiger, 2) het meten van de levensvatbaarheid (mitochondrial activiteit) van de cellen, en 3) het visualiseren van cel-cel en cel-materiaal interacties binnen de scaffold. De werkwijze heeft het voordeel dat het gemakkelijk kan worden overgedragen naar andere hechtende cellen en andere niet-transparant of ondoorzichtig scaffold. Bovendien kunnen de levensvatbaarheid en ingroei patroon worden gevolgd gedurende meerdere dagen, kan dus worden gebruikt met beperkte hoeveelheden dragermateriaal of cellen.
De onderhavige studie toont de succesvolle toepassing van de huidige protocol bij de cellevensvatbaarheid gemeten en gevisualiseerd in groeipatroon van osteochondro progenitorcellen op / in de ondoorzichtige gebreide titanium draagstructuren. Bovendien zou de ontwikkelde protocollen worden gebruikt om het schavot onzuiverheden bepalen en reinigingsprotocollen controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: geïmmortaliseerde humane mesenchymale stromale voorlopercellen (SCP-1 cellen) werden gebruikt voor de experimenten. SCP-1-cellen werden verstrekt door Prof. Matthias Schieker 12.
1. Uitbreiding van SCP-1-cellen
- Voordat hij de SCP-1 cellen, behoren het werkgebied (aangeduid bioveiligheid kast I) met 70% ethanol (v / v) het dragen van de handschoenen.
- In de gereinigde bioveiligheid kast bereidt een geschikt volume celkweekmedium door mengen van de benodigde onderdelen zoals aangegeven in tabel 1. Om steriliteit van het basismedium behouden supplementen voeg passeren steriele filters met een poriegrootte van 0,22 urn.
- Om besmetting te voorkomen, te bereiden medium ten minste 24 uur voor gebruik. Om de steriliteit te testen, incubeer 1 ml medium in een celkweekplaat zonder cellen in het standaard celkweek incubator: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid. Na24 uur, check medium microscopisch met behulp van een vergroting van ten minste 200X.
- Handhaaf SCP-1 cellen in een standaard celkweek incubator met ondersteunende staat: 37 ° C, 5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid.
- Voor het onderhoud en de uitbreiding, groeien de SCP-1-cellen tot ze 80-90% confluentie bereiken. Gedurende deze periode cultuur veranderen medium elke 2-3 dagen. Bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing, gesplitst SCP-1-cellen (in het algemeen een 1: 2 verhouding) naar de volgende passage voor uitbreiding of platen voor de experimenten (zoals aangegeven).
- Voor het splitsen van de SCP-1 cellen, warm het cultuurmedium bij 37 ° C en ontdooien trypsine / EDTA gebruikmaking van een waterbad bij 37 ° C.
- Volledig zuigen het kweekmedium van de 80-90% confluente cellen en gooi het in een afvalbak.
- Was de cellen ten minste tweemaal met DPBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium, pH 7,2).
- Pipet een geschikt volume vanDPBS op de cellen (5 ml DPBS voor een T75 kweekfles en 12 ml voor een T175 kolf).
- Zuig DPBS zorgvuldig en gooi het in een afvalbak.
- Pipet een geschikt volume van 0,25% trypsine / EDTA op de cellen (1 ml DPBS voor een T75 kweekfles en 2 ml van een T175 kolf) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C in standaard celkweek incubator met 5 % CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid.
- Los de cellen door op het schip en ervoor zorgen dat alle cellen worden losgemaakt uit de kweek kunststof (trypsine) en houdt de drijvende cellen onder de microscoop.
- Inactiveren trypsine reactie door toevoeging van 10 ml kweekmedium. Meng de cellen met trypsine en het medium zorgvuldig door herhaaldelijk pipetteren.
- Breng de celsuspensie in een reactiebuis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml kweekmedium.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie werkwijze zoals beschreven in protocol 2.
- Zaad van de cellen, afhankelijk van de experimentele opzet.
2. Tellen van SCP-1 cellen
- Voer een telling van levensvatbare cellen (trypan blauw exclusie methode) van de geresuspendeerde cellen met een hemocytometer.
- Voorafgaand aan het aantal cellen, het reinigen van de hemocytometer gebruik van leidingwater. Droog de hemocytometer onderdelen met behulp van een pluisvrije tissue. Monteren door het bevochtigen van het dekglas en omgekeerd drukken op de twee glazen lopers aan weerszijden van het tellen gebied. Controleer of Newtonse ringen worden gezien op het glas runners (figuur 1).
- Neem 10 ul van de geresuspendeerde cellen en mengen met 10 pi 0,1% trypan blauwe oplossing een verdunningsfactor van 2 te verkrijgen.
- Belasting 10 pi van de totale steekproef op de pre-gereinigd en gemonteerd hemocytometer kamer.
- Tel het aantal levende (wit / transparant cellen) en dode(blauw kernen) cellen op het 4x4 vierkant (zie Figuur 1B).
- Bereken het totale aantal cellen na de gegeven formule:
3. Transfectie van GFP SCP-1 cellen
LET OP: Met het oog op SCP-1 celgroei te observeren op en in de gebreide titanium steiger over een bepaalde cultuur periode hebben we gemerkt van de cellen met groen fluorescerend eiwit (GFP). Overexpressie van GFP verkregen door infectie met adenovirus deeltjes codeert voor GFP. Replicatie incompetent (-E1 / -E3) adenovirusdeeltjes codeert voor groen fluorescerend eiwit (GFP) gebruikt om SCP-1 cellen te infecteren. De virusdeeltjes werden uit Prof. Steven Dooley 13 verkregen door het verzamelen van kweeksupernatant van recombinant adenovirus (Ad5-GFP) getransfecteerde HEK293T cellen (Biosafety lab II). Drie herhaalde vries (-80 ° C) en ontdooien (37 ° C in het waterbad) cycli gegarandeerd dat geen HEK293T cellen blijven levensvatbaar om nieuwe virusdeeltjes te produceren. Met behulp van deze adenovirus uitgangsmateriaal kan het SCP-1-cellen efficiënt te infecteren zonder dat de productie van nieuwe virusdeeltjes. Aldus kunnen de geïnfecteerde cellen in een Biosafety Lab I. behandeld
- Resuspendeer de doelcellen (SCP-1 cellen) met een zaaidichtheid van 50.000 cellen / ml in kweekmedium. Pipetteer 2 ml per putje in een 6-well weefselkweek plaat.
- Incubeer bij 37 ° C in standaard celkweek incubator; 5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid tot SCP-1 cellen te bereiken een confluentie van 70-80%.
OPMERKING: Confluentie afhankelijk van de zaaidichtheid van de cellen. Voor de hierboven genoemde voorwaarden, SCP-1-cellen komen tot een confluentie van 70-80% in 1,5-2 dagen. - Bij een confluentie van 70-80%, zonder afzuigen het kweekmedium voeg 100 ul van het adenovirus uitgangsmateriaal per 1 ml kweekmedium.
- Bepaal het concentratiebereik individueel afhankelijk van de hoeveelheid virusdeeltjes per se virused voorraad voorbereiding. Indien de infectie-efficiëntie te laag, zuiveren en concentreren virusdeeltjes met behulp van diverse commercieel verkrijgbare kits.
- Incubeer gedurende een uur in de standaard celkweek incubator bij 37 ° C (5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid).
- Verwijder het kweekmedium dat het virus uitgangsmateriaal en verzamelen voor verwijdering. Voeg vers kweekmedium 2 ml per putje van een 6-well-culture-plaat aan te vullen.
- Zorg ervoor dat voorafgaand aan verwijdering, virusdeeltje bevattend medium wordt geautoclaveerd.
- Evalueer de intracellulaire GFP-expressie (infectie-efficiëntie) 24 uur na de infectie met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een GFP LED kubus / filter set.
- Houd u aan de cel morfologie (figuur 2). Cellen losmaken uit de kweek plastic kan vals-positieve resultaten geven.
4. Reiniging van gebreide Titanium Steigers
- Place up tot 5 steigers in een 50 ml reageerbuis.
- Was de steiger (6-7 mm dik) driemaal met 30 ml gedestilleerd-gedeïoniseerd water gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met behulp rotor condities (8 xg).
- Vervang de gedestilleerd gedeïoniseerd water met 30 ml 1% (w / v) Triton-X-100-oplossing (opgelost in gedestilleerd-gedeïoniseerd water) en was daarna de steigers eenmaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met behulp rotor condities (8 xg) .
- Gooi de Triton-X-100 oplossing, gevolgd door wassen met 30 ml gedestilleerd-gedeïoniseerd water twee maal (telkens 5 min bij kamertemperatuur) handhaven rotor condities (8 xg).
- Vervang de gedistilleerd-gedemineraliseerd water. Spoel de steigers achtereenvolgens met reagenskwaliteit 99% aceton, 99% isopropanol en 99% ethanol (30 ml elk) gedurende 2 x 5 min elk in een ultrasoonbad (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
- Was opnieuw driemaal met 30 ml gedestilleerd-gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten, waarbij de behandeling in een ultrasoonbad constant.
- Plaats de scaffolds op een niet-pluizende tissue om droge nacht bij kamertemperatuur lucht.
- Autoclaaf de matrix voor 15 minuten bij 121 ° C bij 15 psi.
- Bevestig de schoonmaak protocol door indirecte fluorescentie zoals beschreven in protocol 5.
5. Imaging Steiger Structures door Indirect Fluorescentie
LET OP: De huidige protocol beschrijft de beeldvorming van steiger structuren door indirecte fluorescentie met behulp van de fluorofoor sulforhodamine B, die een heldere rode fluorescentie bij een ex / em golflengte van 565/586 nm geeft. Echter, de fluorofoor worden veranderd om beter bij bepaalde instellingen microscoop of mogelijke auto-fluorescentie van de steiger.
- Bereid de sulforhodamine B kleuroplossing (0,04%) in 1% azijnzuur en bewaar bij kamertemperatuur met bescherming tegen licht.
- Neem een 24-well weefselkweek plaat en dompel de schoongemaakte steiger in 500 ul van de sulforhodamine B kleuroplossing door deze inside de put met behulp van een tang.
- Leg de negatieve beelden van de steiger met behulp van fluorescentie microscoop.
- Foto's maken met een RFP LED kubus / filter set met een excitatie golflengte van 531/40 nm en een emissie van 593/40 nm. Als alternatief kiest de passende excitatie en emissie golflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer 20. Sulforhodamine B heeft haar hoogtepunt excitatie bij 578 nm en een piek emissie bij 593 nm.
- Om de steigerconstructie visualiseren, beelden te maken op lagere vergrotingen, bijvoorbeeld 4X of 10 keer (figuur 3). Met behulp van deze beelden, bepalen kenmerken, bijvoorbeeld de poriegrootte en vorm met behulp van de ImageJ.
- Om schavot onzuiverheden op te sporen, foto's maken met sterkere vergrotingen, bijvoorbeeld 20X of 40X, gezien het feit dat dit de analyse diepte zal beperken. Zorg ervoor dat de vuildeeltjes / stoffen worden niet gezien (zie representatieve resultaten toont;ure 3).
6. In Vitro Biocompatibiliteit Assay
- Pre-warm het cultuurmedium bij 37 ° C in een waterbad.
- Neem een 24-well weefselkweek plaat en met behulp van een tang, plaatst u de gereinigd en gesteriliseerd steigers in elke test goed aseptisch. Werken onder het pre-gereinigde bioveiligheid kast I!
- Genieten / incubeer de scaffolds met een kweekmedium gedurende ongeveer 15 minuten (500 pi per putje van een 24 putjes weefselkweekplaat), om lucht uit de steiger te verwijderen.
- Ondertussen, resuspendeer 500.000-Ad-GFP geïnfecteerde SCP1 cellen in 1 ml kweekmedium.
- Na 15 minuten van de steiger weken, zuig het medium volledig uit het schavot.
- Zaaien de cellen op de scaffold, afzien 100 gl celsuspensie voorzichtig op de steiger (die wordt geplaatst in 24-well plaat) oppervlak. Handhaaf een minimaal volume van celsuspensie terwijl het zaaien van de cellen, om zo te garanderen dat er geen medium o stroomtut van de steiger.
- Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C in standaard celkweek incubator (5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid).
- Voeg 500 ul meer cultuurmedium en incubeer 24 uur in de standaard celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid).
- Evalueer de celadhesie patroon en celverspreiding op het schavot oppervlak met een fluorescentiemicroscoop.
- Foto's maken met een GFP LED kubus / filter set met een excitatie golflengte van 470/22 nm en een emissie van 510/42 nm. Als alternatief kiest adequate excitatie- en emissiegolflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer. GFP heeft zijn hoogtepunt excitatie bij 488 nm en een piek emissie bij 507 nm.
- Om celhechting patroon capture foto visualiseren lagere vergrotingen, bijvoorbeeld 4x of 10x (figuur 4). Om de cel te observeren het verspreiden van een hoger magnification (ten minste 100X) nodig - het beperken van de diepte focus.
- Voor verdere evaluatie van cel verspreiding op het schavot oppervlak, bevestig de cellen met 4% formaline en ga verder met de conventionele fluorescentie kleuring van celstructuren, bijvoorbeeld actine filamenten (Phalloidin). Echter, passen incubatietijden en fluorescente labeling van antilichamen om de individuele kenmerken steiger, bijvoorbeeld diffusie tijden of auto-fluorescentie 14 past.
- De volgende dag, verandert het kweekmedium niet hechtende cellen te verwijderen.
- Bereken het percentage van de hechtende cellen op het schavot door resazurin conversie meting zoals beschreven in protocol 7.
Figuur 5: tijdlijn van in vitro assay (A) Experimentele opstelling voor plating cellen.. (B Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Resazurin Conversie meting
OPMERKING: Resazurin conversie assay wordt gebruikt voor het meten van de mitochondriale activiteit en dus indirect celproliferatie. Resazurin reductie tot resorufine genereert een fluorescerend signaal, dat is gebaseerd op de mitochondriale activiteit zich aantal levensvatbare cellen (Figuur 7A).
- Volledig zuigen het kweekmedium uit de SCP-1-cellen en gooi het in een afvalbak.
- Was de SCP-1-cellen één keer met DPBS om vrijstaande cellen te verwijderen. Voeg 500 ul per putje DPBS van de 24-well weefselkweekplaat met SCP-1 cellen op de scaffold.
- Bedek de cellen met een gewenste amount steriele Resazurin werkoplossing (0,25% resazurin in kweekmedium) en incubeer bij 37 ° C in standaard celkweek incubator (5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid) gedurende 30 min.
- Noteer dat; incubatietijd afhankelijk van het celtype en celdichtheid. Het kan variëren tussen 10 minuten en 6 uur. Geoptimaliseerde incubatietijd voor SCP-1-cellen is 30 min.
- Als achtergrondcontrole, ten minste één putje met Resazurin werkoplossing maar zonder cellen die geïncubeerd bij 37 ° C in standaard celkweek incubator (5% CO2, 20% O2 en 90% vochtigheid) voor dezelfde tijdshoeveelheid.
- Breng 100 pi geconditioneerde supernatant uit elk putje van de 24-well weefselkweekplaat in een 96-microwell plaat.
- Was de resterende cellen driemaal met 1 ml DPBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur teneinde resterende resazurin werkoplossing verwijderd. Na de derde wasbeurt toe te voegen kweekmedium to de implantaten met SCP-1 cellen (500 pl per putje van de 24-well weefselkweekplaat) en verder incubatie bij 37 ° C in standaard celkweek incubator (5% CO2, 20% O2 en 90% luchtvochtigheid) voor verdere tijdsverloop metingen.
- Zorg ervoor instellen triplo deze stap (2-4) om pipetteringsfouten minimaliseren.
- Ondertussen zet de 96-microwell plaat in de microplaat lezer en meet de fluorescentie van het gevormde resorufine.
- Om achtergrondsignaal verminderen, gemeten fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 545 nm en een emissiegolflengte van 585 nm.
- Als alternatief kiest adequate excitatie- en emissiegolflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer. Resorufin heeft zijn piek excitatie bij 572 nm en een piek emissie bij 585 nm. De opgegeven signaalsterkte is een gemiddelde van 25 afzonderlijke metingen (25 flitsen per putje).
- Meet de fluorescence van gevormde resorufine in geconditioneerd medium, met behulp van een bottom optiek.
- Noteer dat de winst is afhankelijk van de gemiddelde hoeveelheid resazurin geconverteerd en kan variëren tussen de 10 en 4000. Stel de winst voor de afzonderlijke microplaat lezer door pipetteren een resorufine standaardcurve, zodat het fluorescentiesignaal is dan 80% van de maximale signaalintensiteit detecteerbaar (in dit geval 20.000). De geoptimaliseerde winst voor SCP-1-cellen is 800.
- Trek de achtergrond signaal (resazurin werkende oplossing zonder cellen) uit het signaal van de proefmonsters.
- Afhankelijk van de experimentele opstelling / doel, verder met verdere stappen:
- Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cellen op de scaffold met een standaard curve. Maak een individuele norm curve afzonderlijk voor elke cellijn gebruikt.
- Analyseer celgroei / proliferatie door het schatten van de relatieve toename van resazurin conversie gedurende de teelt tijd. Voor deze berekening stellende resazurin conversie op dag 1 als referentie. Vers bereid de Resazurin werkoplossing voor een dergelijke analyse. Bovendien incubatietijden gelijke tussen de verschillende metingen kunnen worden.
- Wordt het gehele protocol van Resazurin omzetting meting ten minste drie maal om consistente resultaten.
8. live-dead kleuring
- Plaat SCP1 de cellen op de scaffold met een zaaidichtheid van 50.000 cellen / steiger en laten groeien op het schavot houden standaard celkweekomstandigheden (zie protocol 1 en 2).
- Na 24-48 uur volledig zuigen het kweekmedium uit de SCP-1-cellen en gooi het in een afvalbak.
- Was de SCP-1-cellen één keer met DPBS om vrijstaande cellen te verwijderen. Voeg 500 ul per putje DPBS van de 24-well weefselkweekplaat en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vlek SCP-1 gebruikt fluoroforen (drie vlekken tegelijkertijd):
- Van nu af aanHoud de steigers in het donker om de fluoroforen bleken te beschermen tegen daglicht!
- Stel een incubatietijd tot 30 min om een gelijke verdeling over het schavot staan. Als het overbrengen naar andere steigers, zorg ervoor om het optimaliseren van de incubatietijd van de individuele schavot kenmerken (poriegrootte, schavot diepte, etc.) passen.
- Om levensvatbare cellen te detecteren op het schavot vlekken de cellen met calceïne AM bij een eindconcentratie van 2 uM (in kweekmedium).
- Om alle cellen te detecteren op het schavot vlekken de cellen met Hoechst 33342 in een uiteindelijke concentratie van 0,002 pg / pl (in kweekmedium).
- Om dode cellen te detecteren, incubeer de steiger met ethidium homodimeer bij een eindconcentratie van 4 uM (in kweekmedium).
- Na de incubatietijd, was de cellen 3 keer met DPBS (1 ml per putje) gedurende elk 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Onmiddellijk neem fotos met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
- Neem foto's van de calceïne (levende cellen) met een GFP LED kubus / filter set (excitatie en emissie golflengte van 470/22 nm en 510/42 nm, respectievelijk). Daarnaast is het mogelijk een adequaat excitatie- en emissiegolflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer. Calceïne heeft zijn piek excitatie bij 488 nm en een piek emissie bij 507 nm. Opmerking: Zorg ervoor dat niet te GFP getransfecteerde cellen te gebruiken voor fluorescentie kleuring met calceïne of andere groen fluorescerend vlekken.
- Neem foto's van de Hoechst 33342 met een DAPI LED kubus / filter set met een excitatie golflengte van 357/44 nm en een emissie van 447/60 nm. Als alternatief kiest adequate excitatie- en emissiegolflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer. Hoechst 33342 heeft zijn piek excitatie bij 347 nm en een piek emissie bij 483 nm.
- Neem foto's van de ethidiumhomodimeer met een RFP LED kubus / filter set (excitatie en emissiegolflengte of 531/40 nm en 593/40 nm respectievelijk). Als alternatief kiest adequate excitatie- en emissiegolflengte met behulp van de fluorescentie spectrale viewer. Ethidiumhomodimeer heeft zijn piek excitatie bij 530 nm en een piek emissie bij 618 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorlopige resultaten tonen aan dat de beschreven nieuwe kern implantaat niet alleen goede dempende eigenschappen maar ook biologisch verenigbaar met SCP-1 cellen. Tijdens het productieproces van het implantaat, het in contact komt met sterke corrosieve en toxische stoffen (smeermiddel, bijtmiddel, elektropolijstmethodes oplossing). Met behulp van indirecte fluorescente kleuringen konden we de resterende onzuiverheden visualiseren en daarmee een optimale reinigingsprotocol toont significante vermindering in wezen belasting van de steiger. Figuur 3 toont de efficiëntie van gevestigde reinigingsprotocol.
Het succes van implantaten voor artroplastiek behandeling wordt bepaald door gebeurtenissen die op cel-materiaal-interface plaatsvindt. Figuur 4 toont de cellen bevestigd aan de steiger na 24 uur in de platen, zoals beschreven in het protocol sectie 6. significant transfection efficiency van SCP-1 cellen waargenomen als we konden beeld het groeipatroon van mesenchymale stromale voorlopercellen op de scaffold (zie Figuur 2). Directe visualisatie bevestigt de biocompatibiliteit van de steiger en toont ook de hechting patroon op het schavot oppervlak (figuur 4). Fluorescentie kleuring kan verder worden gedaan om celinteractie met en verspreiding op het schavot oppervlak onderzocht.
Fluoroforen met succes toegepast om celdood en proliferatie onderzocht gedurende een tijdsperiode op het schavot. Levend-dood-kleuring beelden illustreren hoe kleuring succesvol kan op de steiger om het percentage levensvatbaarheid van de cellen gedurende een tijdsperiode bevestigen. Figuur 6 toont blauwe kleuring van kernen (Hoechst 3342) in alle cellen rood fluorescent gelabelde (ethidium homodimeer) dode cellen, en groene etikettering voor het inbouwen van calceïne-AM als levensvatbaarheid marker. Calceïne AM omgezet in calceïne waarbij een heldere groene fluorescentie in de aanwezigheid van calciumionen in het cytoplasma van de cellen vertoont. Hoechst 33342 is celwand doorlaatbaar en intercalaten in het cellulaire DNA. Op deze manier alle cellen zullen blauwe kernen (zie Figuur 6) te tonen. Ethidium homodimeer is niet permeabele celwand, waardoor het zal alleen intercalaat in het DNA van dode cellen. Op deze manier zal de dode cellen rood kernen te laten zien. Verder cellevensvatbaarheid en voudige toename van celaantal op steiger gedurende een week werd gekwantificeerd door Resazurin omzetting assay en grafisch weergegeven (Figuur 7).
Figuur 1: Cel tellen met een hemocytometer (A) Instelling van een kamer montage.. (B) Illustratie van het tellen van kamers; 4 x 4 telkamer wordt gebruikt voor een cel count. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. GFP transfectie-efficiëntie SCP1 cellen vertonen een sterke groene fluorescentie aangeeft positief ad-GFP transfectie-efficiëntie. Schaal bar = 1,000 micrometer, 4x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Sulforhodamine B vlekken negatieve beelden vast te leggen (A) Steiger voor het schoonmaken.. Pijl geeft de aanwezigheid van giftige / bijtende stoffen schavot. (B) Steiger na de reiniging protocol. Schaal bar = 1,000 micrometer, 4x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Hechting patroon van SCP1 cellen op steiger GFP aangeeft celhechting en groei patroon op het oppervlak van de gebreide titanium draagstructuren. Schaal bar = 1,000 micrometer, 4x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Co-fluorescentie kleuring van cellen op steiger (.
Figuur 7: Resazurin conversie assay (A) Biochemische reductiereactie redox kleurstof (Resazurin) tot een eindproduct (resorufine) die fluorescentie uitstraalt en colorimetrische veranderingen ondergaat.. (B) Mitochondrial werd gemeten wanneer de cellen werden uitgeplaat op 0,75 mg / cc dichtheid scaffold. De gegevens werden verzameld met behulp van flfluorescentie gebaseerde meetinstrument. Fluorescentie-intensiteit bij 590 nm (y-as) op vastgestelde tijdstippen (x-as) wordt afgebeeld als gevolg van kwantitatieve cellevensvatbaarheid gemeten (ex = 540 nm, em = 590 nm). De statistische significantie werd bepaald onder toepassing Two way ANOVA en standaardfout van het gemiddelde (SEM) wordt weergegeven als foutstaven. Gezien het schavot fysische eigenschappen, bijvoorbeeld poriegrootte en mechanische eigenschappen (bijv demping functie) samen, werd 0,75 mg / cm³ dichtheid steiger gebruikt voor biocompatibiliteit karakterisering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| media componenten | Concentratie |
| Basale aMEM media (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Pen / Strep (%) | 1 |
Tabel 1: Cel cultuur (aMEM) Media samenstelling.
| Probleem | Oorzaak | Oplossing |
| Levensvatbaarheid van de cellen beeldvorming over niet-transparante steiger | Steiger voorkomt dat licht door te dringen zonder vervorming | Gebruik fluorofoor gebaseerde beeldvormende techniek voor mobiele assessment. |
| Interferentie van fluorescentie-intensiteit | Auto fluorescentie, achtergrond signaal | Besteed aandacht aan de fluoroforen en gebruik de toepasselijke op basis van bepaalde eigenschappen schavot. |
| Cell levensvatbaarheidsbeoordeling op steiger over een kweekperiode | Repeated metingen over een lange tijd | Transfecteren van de cellen met Ad-GFP-virusdeeltjes. |
| Celfunctionaliteit beoordeling op niet-transparante steiger | Fluorescentiebeeldvorming techniek laat slechts cell strooibeeld analyse. | Voer resazurin conversie assay (kwantitatieve cellevensvatbaarheid meting) in combinatie met beeldvormende techniek. |
Tabel 2: Overzicht tabel: het oplossen van de levensvatbaarheid van de cellen imaging op niet-transparante schavot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het schavot oppervlak speelt een belangrijke rol in de interactie met omringende weefsel in vivo waarbij bepaald implantaten functionele duurzaamheid. Aldus wordt de biocompatibiliteit van de scaffold door in vitro assays cuvetten (SCP1 cellijn), bij het uitplaten op de steigers.
Microscopische technieken die goed functioneren met dun en optisch transparant steigers zijn slecht geschikt voor ondoorzichtige scaffolds de biocompatibiliteit te bestuderen. Dit komt vooral omdat de niet-transparante steigers te voorkomen dat het licht door te dringen zonder noemenswaardige vervorming 15. Om deze problemen deels ondervangen we hierbij stellen een methode voor mobiele assessment op / in gebreide titanium gemaakt steigers met behulp van verschillende fluoroforen.
Om breien gevolgd door het vouwen van het titanium draden mogelijk het materiaal in contact komt met sterke corrosieve en toxische stoffen (smeermiddel, bijtmiddel, electro-polishing oplossing), die de biocompatibiliteit van het skelet kunnen veranderen als sporen in / over op het schavot. Met de hulp van een ontwikkelde indirecte fluorescentie-protocol (Protocol 5) konden we de steiger structuur te visualiseren. Bovendien steiger kenmerken, bijvoorbeeld de materiaaldikte, de individuele grootte en vorm poriën of het verbindend dichtheid, werden geanalyseerd met ImageJ. Een hogere vergrote epifluorescentie microscopische beeld schetst een beeld van onzuiverheden in de steiger en op het schavot oppervlak. Figuur 3b vormt aldus het bevestigende resultaat van het succes reinigingsprotocol. Het principe van deze indirecte kleuring protocol kan gemakkelijk worden gereproduceerd andere ondoorzichtige steigers, rekening houdend met de individuele scaffold eigenschappen, bijvoorbeeld poriegrootte en overeenkomstige diffusie die de incubatietijd beïnvloedt. Ook auto-fluorescentie van de steiger en microscopische instellingen beïnvloedt de keuze van fluorophores gebruikt. De online tool fluorescentie spectrale kijker kan helpen om de adequate fluoroforen te kiezen.
Cel-metaal interactie indirect onderzocht door het analyseren van het patroon hechting van cellen op de scaffold. Protocol 6 beschrijft de methodologie van cellen kan worden gevolgd in vitro als uitgeplaat op ondoorzichtige steigers in kweeksystemen door een GFP transfectie strategie. Op basis van voorlopige resultaten van in vitro testen, is voorspeld dat de oppervlakte eigenschappen zoals samenstelling, micro-topografie en ruwheid 16 een belangrijke rol bij de vaststelling hechting en spreiding van doelwitcellen zou kunnen spelen. Titanium wordt een biomateriaal dus zou kunnen worden als een substraat sjabloon om uitvalsbasis voor celhechting (zie Figuur 4) te verstrekken.
Implantaatoppervlak topografie is gerapporteerd dat 16 celgedrag beïnvloeden. In deze studie analyseerden we de celgroei /spreiding en levensvatbaarheid van het gebruik van fluorescentie kleuring technieken in combinatie met kwantitatieve levensvatbaarheid metingen. analyse toonde subtiele variaties in cel percentage levensvatbaarheid en verspreiding afhankelijk van het dragermateriaal. Echter, celfunctionaliteit kwantitatief bepaald door resazurin omzetting assay (mitochondriale activiteit), werd niet significant beïnvloed door het dragermateriaal. De meting van de mitochondriale activiteit van Resazurin omzetting heeft het voordeel dat het niet giftig is cel en dus herhaaldelijk worden uitgevoerd gedurende een lange kweekperiode. Speciale aandacht moet worden genomen bij het wassen off resterende resazurin werkende oplossing, dus niet de achtergrond signaal (vals positieve resultaten) accumuleren. Ondanks deze voordelen, zal de resazurin conversie test geen informatie over de cel verspreiding op het schavot te geven. De GFP geïnfecteerde cellen kan daarom worden gevolgd gedurende een lange kweekperiode (GFP signaal bleef constant meer dan 14 dagen), waardoor het mogelijk te visualiseren sPECIFIEKE groeipatroon op het schavot oppervlak. Visualisatie van cellen dieper in het skelet nog beperkt door het dragermateriaal en zal dus ontleding van het implantaat nodig. De combinatie van deze twee technieken heeft het grote voordeel dat het gemakkelijk kan worden overgebracht naar andere celtypen, aangezien incubatietijd zou moeten worden aangepast aan het celtype van belang. Echter, zorg moet worden genomen bij het overbrengen van deze methode om andere ondoorzichtige steigers, bijvoorbeeld collageen gebaseerde scaffolds die in het algemeen een sterke groene auto-fluorescentie 17 vertonen. In dit geval kunnen andere fluorescerende labels worden gebruikt. De combinatie van bovengenoemde twee methoden heeft dus verschillende voordelen (zie tabel 2).
Steiger kenmerken, bijvoorbeeld poriegrootte macht val cellen in het schavot. Als er niet voldoende voedingsstoffen worden geleverd, kunnen deze cellen sterven en uitscheiden proteases die cel levensvatbaarheid van de surround invloeding cellen / weefsel. We waren in staat om op basis van fluorescentie kleuring protocol dat in staat is om levende en dode cellen visualiseren en de gebreide titanium draagstructuren passen. Net als bij de indirecte fluorescentie kleuring protocol, kan het principe van deze kleuring protocol gemakkelijk worden overgedragen aan andere niet-transparante steigers. Terwijl daarbij de afzonderlijke scaffold eigenschappen, bijvoorbeeld poriegrootte en bijbehorende diffusie en mogelijke auto-fluorescentie, microscopische instelling rekening moet worden gehouden omdat zij gevolgen voor de incubatietijd en de keuze van gebruikte fluoroforen. Hier, nogmaals op de online tool fluorescentie spectrale kijker kan helpen om de adequate fluoroforen te kiezen.
Samengevat, in vitro resultaten geven aan dat de voorgestelde gebreide titanium kern implantaatmodel een biologisch profiel. Aanvankelijke bevestiging van mesenchymale stromale voorlopercellen (SCP-1 cellen) over dit materiaal suggereert dat dit titaniumlegering implantaat material is biocompatibel. Hoewel we niet hebben geanalyseerd associatie van verschillende topografische parameters, misschien steiger modificatie van het oppervlak cel therapietrouw proliferatie te verbeteren evenals differentiatie 18. Optimale compatibiliteit tussen scaffold en cellen verhogen de kans op betere integratie implantaat in de omringende weefsel en dus verbetering in vivo levensduur na de behandeling 19. Via de hierboven genoemde testopstelling opent de mogelijkheid gemeten en gevisualiseerd verbetering van de biologische prestatie van het skelet geïnduceerd door oppervlaktemodificaties. De voorkeur van steigers met bioactieve oppervlak over ongemodificeerde implantaat ontwerpen suggereert dat de betere prestaties 20 in termen van osteo-chondrogene integratie. Deze studie wordt versterkt door andere rapporten over de gebreide titanium implantaat waarbij de mechanische eigenschappen en bioactiviteit gemeld 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. Geen enkel deel van het werk is of wordt momenteel bestudeerd voor publicatie of is elders gepubliceerd.
Acknowledgments
Project wordt gedeeltelijk gefinancierd door Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. De publicatie honorarium is gedekt door de BG trauma ziekenhuis Tübingen, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. Buck, A. E., Kaps, H. -P. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).
