Summary
Aquí presentamos una técnica de imagen basada fluoróforo para detectar la viabilidad celular en un andamio de titanio no transparente, así como para detectar destellos de las impurezas del andamio. Este protocolo soluciona el inconveniente de la formación de imágenes célula-célula o célula-metálicos interacciones en los andamios no transparentes.
Introduction
dolor de espalda crónico es una enfermedad multifactorial. El interés en una opción de tratamiento mínimamente invasivo de la enfermedad degenerativa del disco ha crecido desde la década de 1950. Hasta hoy, la fusión multi-segmentaria de la columna vertebral es el tratamiento más ampliamente utilizado. Puesto que, este método conduce a menudo a las limitaciones en la movilidad del segmento afectado 1,2, la exploración de la era de la artroplastia se convirtió en un amplio interés. Avances significativos en reemplazo de disco y el núcleo reemplazo total se ha convertido en una buena alternativa para tratar el dolor de espalda crónico 1. A pesar de la enorme progreso, ninguno de los métodos ha sido clínicamente evaluado. Los implantes de núcleo menos rígidas representan una alternativa prometedora a la sustitución total de disco, a condición de que el anillo fibroso está intacto 3,4. Sin embargo, los implantes actualmente presentes en el mercado núcleo se asocian a menudo con complicaciones como cambios en el cuerpo vertebral, dislocación, la pérdida de altura vertical del disco y camisetaque es necesario falta de rigidez mecánica asociada 5. Con el fin de superar los inconvenientes actuales, una novela implante de núcleo hecha de alambres de titanio de punto se ha desarrollado con éxito 6. Debido a la estructura de punto único, este andamio recién desarrollado ha mostrado características biomecánicas distinguidos, por ejemplo, característica de amortiguación, tamaño de poro, capacidad de carga y de fiabilidad 7. Con el objetivo de probar la biocompatibilidad de este nuevo implante de núcleo, representado severas limitaciones en las técnicas de análisis (óptico) atribuidos a la naturaleza no transparente del implante.
Con el fin de probar la biocompatibilidad, la interacción de células de metal desempeña un papel destacado 8-10. Una interacción entre las células y el andamio es necesario para la estabilización y, por tanto, para la mejor integración del implante en el sistema anfitrión. Sin embargo, una profundidad creciente crecimiento interno podría alterar las propiedades mecánicas del andamio. Con el objetivo de Invesgar si la superficie del andamio proporciona una base para la fijación celular, la proliferación y la diferenciación o si el metal afecta a la viabilidad celular, es importante para solucionar el problema común bien conocida de imágenes de células sobre / en andamios no transparentes y opacas. Con el fin de superar esta limitación varios fluorescente se exploraron técnicas basadas. Empresas ofrecen una amplia gama de fluoróforos para visualizar las células vivas, los compartimentos celulares, o incluso estados celulares específicos 11. Fluoróforos para este experimento fueron seleccionados con la ayuda de la herramienta visor espectral en línea con el fin de adaptarse mejor a nuestro microscopio fluorescente.
La estrategia desarrollada para el análisis del comportamiento células adherentes sobre / en el andamio de titanio de punto no transparente implica lo siguiente: etiquetado 1) fluorescente (proteína verde fluorescente / GFP) de las células osteochondro-progenitoras para permitir el seguimiento de las células de la andamio, 2) la medición de la viabilidad (Mitoactividad mitocon-) de las células, y 3) la visualización de célula-célula y las interacciones célula-material dentro del andamio. El procedimiento tiene la ventaja de que puede ser transferido fácilmente a otras células adherentes y otros andamio no transparente u opaco. Además, la viabilidad y el patrón de crecimiento hacia el interior pueden ser monitoreados durante varios días, por lo que se puede utilizar con cantidades limitadas de material de soporte o de las células.
El presente estudio demuestra la utilización con éxito de nuestro protocolo actual para medir la viabilidad celular y visualizar el patrón de crecimiento de las células progenitoras osteochondro-sobre / en el andamio de titanio punto no transparente. Además, los protocolos desarrollados se podrían utilizar para determinar las impurezas de andamios y para comprobar los protocolos de limpieza.
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Protocol
Se utilizaron Inmortalizado células precursoras mesenquimales del estroma humano (células SCP-1) para los experimentos: NOTA. Las células SCP-1 fueron proporcionados por el profesor Matthias Schieker 12.
1. Ampliación del SCP-1 en las células
- Antes de trabajar con las células SCP-1, limpiar correctamente la zona de trabajo (designado bioseguridad armario I) con guantes de 70% de etanol (v / v) de desgaste.
- En la cabina de bioseguridad limpiado preparar un volumen apropiado de medio de cultivo celular mediante la mezcla de los componentes necesarios, como se indica en la Tabla 1. Con el fin de mantener la esterilidad del medio basal, añadir suplementos al pasar a través de filtros estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras.
- Para evitar la contaminación, preparar el medio, al menos, 24 horas antes de su uso. Con el fin de comprobar su esterilidad, incubar 1 ml de medio en una placa de cultivo celular sin células en la incubadora de cultivo celular estándar: 37 ° C, 5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad. Después24 horas, compruebe medio al microscopio utilizando una ampliación mínima de 200X.
- Mantener SCP-1 en las células en una incubadora de cultivo celular estándar con la condición de apoyo: 37 ° C, 5% CO2, 20% de O2 y 90% de humedad.
- Para el mantenimiento y la expansión, crecer las células SCP-1 hasta que alcanzan el 80-90% de confluencia. Durante este período de tiempo la cultura, cambiar el medio cada 2-3 días. Al llegar a 80 a 90% de confluencia, dividir celdas SCP-1 (en general una proporción de 1: 2) a la siguiente paso para la expansión o la placa para los experimentos (como se indica).
- Para la división de las células SCP-1, calentar el medio de cultivo a 37 ° C y descongelar tripsina / EDTA usando un baño de agua a 37 ° C.
- Completamente aspirar el medio de cultivo de las células confluentes 80 a 90% y desechar en un contenedor de residuos.
- Lavar las células al menos dos veces con DPBS (fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin magnesio y calcio, pH 7,2).
- Pipetear un volumen apropiado deDPBS sobre las células (5 ml de DPBS para un matraz de cultivo T75 y 12 ml para un matraz de cultivo T175).
- Aspirar DPBS cuidadosamente y desechar en un contenedor de residuos.
- Pipetear un volumen apropiado de 0,25% de tripsina / EDTA a las células (1 ml de DPBS para un matraz de cultivo T75 y 2 ml de un matraz de cultivo T175) y se incuba durante 5 a 10 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar con 5 % CO2, 20% de O2 y 90% de humedad.
- Desalojar las células golpeando ligeramente el vaso y asegurar que todas las células se separan del plástico de cultivo (tripsinización) mediante la observación de las células flotantes en el microscopio.
- Inactivar la reacción de tripsina mediante la adición de 10 ml de medio de cultivo. Mezclar la tripsina y las células con el medio cuidadosamente mediante pipeteo repetido.
- Transferir la suspensión celular en un tubo de reacción y se centrifuga a 600 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de cultivomedio.
- Contar las células mediante el método de exclusión de azul de tripano como se describe en el protocolo 2.
- Sembrar las células en función del diseño experimental.
2. Recuento de SCP-1 en las células
- Realizar un recuento de células viables (método de exclusión de azul de tripano) de las células resuspendidas utilizando un hemocitómetro.
- Antes del recuento de células, limpiar el hemocitómetro usando agua del grifo. Secar los componentes del hemocitómetro utilizando un paño sin pelusa. Ensamble que humedeciendo el vidrio de cubierta y presionándola inversamente en los dos corredores de vidrio en cada lado de la zona de recuento. Asegúrese de que los anillos de Newton se ven en los corredores de vidrio (Figura 1).
- Tomar 10 l de las células resuspendidas y se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,1% para obtener un factor de dilución de 2.
- Carga de 10 l de la muestra total en la cámara de hemocitómetro pre-limpiado y montado.
- Contar el número de vivo (células transparentes de color blanco /) y muerta(núcleos azules) células de los cuadrados de 4x4 (véase la Figura 1B).
- Calcular el número total de células después de la fórmula dada:
3. La transfección de GFP SCP-1 en las células
NOTA: Con el fin de observar SCP-1 de crecimiento celular encendido y en el armazón de titanio punto durante un cierto período de cultivo que marcamos las células con la proteína fluorescente verde (GFP). La sobreexpresión de GFP se consigue por la infección con partículas de adenovirus que codifican para GFP. De replicación incompetente (-E1 / -E3) partículas de adenovirus que codifican para la proteína verde fluorescente (GFP) se utilizaron para infectar células SCP-1. Las partículas de virus se obtuvieron del Prof. Steven Dooley 13 mediante la recopilación de sobrenadante de cultivo de adenovirus recombinante (Ad5-GFP) las células HEK293T transfectadas (de laboratorio de Bioseguridad II). Tres repetidos de congelación (-80 ° C) y descongelación (37 ° C en el baño de agua) ciclos garantiza que no HEK293T células permanecen viables para producir nuevas partículas virales. El uso de este lote de semillas, adenovirus pueden infectar eficazmente las células SCP-1 sin producir nuevas partículas virales. De este modo, las células infectadas se pueden manejar en un laboratorio de bioseguridad I.
- Resuspender las células diana (células SCP-1) con una densidad de siembra de 50.000 células / ml en medio de cultivo. Pipeta 2 ml por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
- Incubar a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar; 5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad, hasta que las células SCP-1 alcanzar una confluencia del 70-80%.
NOTA: confluencia depende de la densidad de siembra de las células. Para las condiciones anteriormente indicadas, las células SCP-1 alcanzan una confluencia del 70-80% en 1,5-2 días. - A una confluencia del 70-80%, sin aspirar el medio de cultivo se añaden 100 l de la reserva de semillas adenovirus por 1 ml de medio de cultivo.
- Determinar la gama de concentración individualmente en función de la cantidad de partículas de virus en cada virus seed preparación de la pasta. En caso de que la eficacia de la infección es demasiado baja, purificar y concentrar las partículas de virus usando varios kits disponibles en el mercado.
- Incubar durante una hora en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 ° C (5% CO2, 20% de O2 y 90% de humedad).
- Se elimina el medio de cultivo que contiene la semilla madre de virus y recogerlo para su eliminación. Añadir medio de cultivo fresco 2 ml por pocillo de una de 6 pocillos de cultivo de la placa para reponer.
- Asegúrese de que antes de su eliminación, partícula de virus que contiene el medio se trata en autoclave.
- Evaluar la expresión de GFP intracelular (eficiencia de infección) 24 horas después de la infección usando un microscopio de fluorescencia con un conjunto de cubo / filtro de LED GFP.
- Observar la morfología de las células (Figura 2). Las células se separe del plástico de cultivo pueden dar resultados falsos positivos.
4. Limpieza de tejidos de punto de titanio andamios
- PAGencaje hasta 5 andamios en un tubo de reacción de 50 ml.
- Lavar el andamio (6-7 mm de espesor) tres veces con 30 ml de agua destilada-desionizada durante 20 min a temperatura ambiente, usando las condiciones de rotor (8 xg).
- Sustituir el agua destilada desionizada con 30 ml 1% (w / v) de Triton-X-100 (disuelto en agua destilada-desionizada) y lavar los andamios de una vez por 20 min a temperatura ambiente, usando las condiciones de rotor (8 xg) .
- Descartar la solución de Triton-X-100, seguido de lavado con 30 ml de agua destilada-desionizada dos veces (5 min cada uno a temperatura ambiente) el mantenimiento de las condiciones de rotor (8 xg).
- Reemplazar el agua destilada-desionizada. Enjuague el secuencialmente andamios con calidad de reactivo 99% de acetona, 99% de isopropanol y 99% de etanol (30 ml cada uno) para 2 x 5 min cada uno en un baño de ultrasonidos (~ 50 Hz, 50 W, 220 a 240 V).
- Lavar de nuevo tres veces con 30 ml de agua destilada-desionizada durante 5 min, manteniendo constante el tratamiento de baño ultrasónico.
- Coloque el ScaffoLDS en un paño libre de pelusa con el fin de aire durante la noche seco a temperatura ambiente.
- Autoclave el andamio durante 15 min a 121 ° C con 15 psi.
- Para confirmar el protocolo de limpieza por fluorescencia indirecta como se describe en el protocolo 5.
5. Estructuras de imágenes por fluorescencia indirecta del andamio
NOTA: El presente protocolo describe la obtención de imágenes de las estructuras de andamios por fluorescencia indirecta utilizando el sulfordamina B fluoróforo que da una fluorescencia de color rojo brillante en una longitud de onda ex / em de 565/586 nm. Sin embargo, el fluoróforo se puede cambiar a un mejor ajuste para la configuración de microscopio dados o posible auto-fluorescencia del andamio.
- Preparar la solución de tinción sulfordamina B (0,04%) en ácido acético al 1% y se almacena a temperatura ambiente con protección de la luz.
- Tome una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se sumerja el andamio limpiado en 500 l de la solución de tinción sulfordamina B colocándolo inside los bien utilizando fórceps.
- Capturar las imágenes negativas del andamio mediante microscopio de fluorescencia.
- Tomar fotos con un cubo / filtro de LED RFP conjunto con una longitud de onda de excitación de 531/40 nm y una longitud de onda de emisión de 593/40 nm. Alternativamente elegir la excitación y la emisión de longitud de onda adecuada con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia 20. Sulfordamina B tiene su pico de excitación a 578 nm y su pico de emisión a 593 nm.
- Con el fin de visualizar la estructura del andamio, tomar fotografías con aumentos inferiores, por ejemplo, 4X o 10X (Figura 3). El uso de estas imágenes, determinar las características, por ejemplo, el tamaño de poro y la forma con la ayuda de la ImageJ.
- Con el fin de detectar impurezas de andamios, tomar fotografías a ampliaciones superiores, por ejemplo, 20X o 40X, teniendo en cuenta que esto limitará la profundidad de análisis. Asegúrese de que la suciedad partículas / sustancias que no se ven (ver resultados representativos; la figuraure 3).
Ensayo 6. En Vitro Biocompatibilidad
- Pre-calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua.
- Tome una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y el uso de fórceps, colocar los andamios limpiados y esterilizados en cada pocillo de ensayo asépticamente. Trabajar bajo la cabina de bioseguridad previamente limpiadas Me!
- Remojar / incubar los andamios con un medio de cultivo durante aproximadamente 15 min (500 l por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos), con el fin de eliminar el aire desde el interior del andamio.
- Mientras tanto, resuspender 500.000 células SCP1 Ad-GFP-infectados en 1 ml de medio de cultivo.
- Después de 15 minutos de remojo andamio, aspirar el medio completamente fuera del andamio.
- Para sembrar las células en el andamio, prescindir de 100 l de suspensión celular con cuidado en el andamio (que se coloca en la placa de 24 pocillos) de superficie. Mantener un volumen mínimo de suspensión de células, mientras que la siembra de las células, de modo de garantizar fluye ningún medio out del andamio.
- Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad).
- Añadir 500 l más medio de cultivo y se incuba durante 24 horas en la incubadora de cultivo celular estándar (37 ° C, 5% CO2, 20% de O2 y 90% de humedad).
- Evaluar el patrón de la adhesión celular y la propagación de células en la superficie del andamio usando un microscopio de fluorescencia.
- Tomar fotos con un cubo / filtro de LED GFP conjunto con una longitud de onda de excitación de 470/22 nm y una longitud de onda de emisión de 510/42 nm. Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. GFP tiene su excitación máxima a 488 nm y su emisión pico a 507 nm.
- Con el fin de visualizar adherencia de las células de captura de imágenes patrón a aumentos inferiores, por ejemplo, 4X o 10X (Figura 4). Con el fin de observar la propagación de células una revista de altoSe necesita nification (al menos 100X) - la limitación de la profundidad de enfoque.
- Para evaluar aún más la propagación de células en la superficie del andamio, fijar las células con formalina al 4% y proceder con la tinción convencional de fluorescencia de las estructuras celulares, por ejemplo, los filamentos de actina (faloidina). Sin embargo, adaptar los tiempos de incubación y el marcaje fluorescente de los anticuerpos con el fin de adaptarse a las características de andamio individuales, por ejemplo, tiempos de difusión o auto-fluorescencia 14.
- El día siguiente, cambiar el medio de cultivo para eliminar las células no adherentes.
- Calcular el porcentaje de células adherentes en el andamio por resazurina medición de conversión como se describe en el protocolo 7.
Figura 5: Cronología de ensayo in vitro (A) Montaje experimental para el recubrimiento de las células.. (B Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
7. Conversión de medición resazurina
NOTA: ensayo de conversión de resazurina se usa para medir la actividad mitocondrial y la proliferación celular por lo tanto indirectamente. Reducción de la resazurina a resorufina genera una señal fluorescente, que se basa en la actividad mitocondrial asociada con el número de células viables (Figura 7A).
- Completamente aspirar el medio de cultivo de las células SCP-1 y desecharlo en un recipiente de residuos.
- Se lavan las células SCP-1 una vez con DPBS para eliminar células desprendidas. Añadir 500 DPBS mu l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contenía células SCP-1 en el andamio.
- Cubrir las células con un am requeridoporte de la solución de resazurina de trabajo estéril (0,25% resazurina en medio de cultivo) y se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad) durante 30 min.
- Tome nota de que; tiempo de incubación depende del tipo de célula y la densidad celular. Puede variar entre 10 min y 6 hr. tiempo de incubación optimizado para las células SCP-1 es de 30 min.
- Como control de fondo, incluir al menos un bien con la solución de trabajo de resazurina pero sin células, que se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad) para el mismo cantidad de tiempo.
- Transferir 100 l condicionados sobrenadante de cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en una placa de 96 micropocillos.
- Lavar las células restantes tres veces con 1 ml de DPBS para 5 min a temperatura ambiente con el fin de eliminar la solución de trabajo resazurina residual. Después del tercer lavado añadir medio de cultivo to los implantes con células SCP-1 (500 l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos) y se continúa la incubación a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular estándar (5% de CO 2, 20% O 2 y 90% de humedad) en las medidas de curso temporal.
- Asegúrese de configurar réplicas en este paso (2-4) con el fin de reducir al mínimo los errores de pipeteo.
- Mientras tanto, colocar la placa de 96 micropocillos en el lector de microplaca y medir la fluorescencia de la resorufina formado.
- Con el fin de reducir la señal de fondo, medir la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 545 nm y una longitud de onda de emisión de 585 nm.
- Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Resorufina tiene su pico de excitación a 572 nm y su pico de emisión a 585 nm. La intensidad de la señal dada es un promedio de 25 lecturas individuales (25 flashes por pocillo).
- Medir el fluorescence de resorufina formado en medio condicionado, utilizando una óptica inferior.
- Tome nota de que, la ganancia depende de la cantidad promedio de resazurina convierte y puede variar entre 10 y 4.000. Ajustar la ganancia en el lector de microplacas individual utilizada pipeteando una curva estándar de resorufina, de manera que la señal fluorescente está por debajo de 80% de la intensidad máxima de la señal detectable (en este caso 20000). La ganancia optimizada para las células SCP-1 es 800.
- Restar la señal de fondo (resazurina solución de trabajo sin células) a partir de la señal de las muestras de ensayo.
- Dependiendo de la configuración experimental / propósito, proceda con los pasos:
- Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en el andamio utilizando una curva estándar. Hacer una curva estándar individual por separado para cada línea celular utilizada.
- Analizar el crecimiento / proliferación celular mediante la estimación del aumento relativo en la conversión de la resazurina durante todo el tiempo de cultivo. Para este cálculo, expuestasla conversión resazurina en el día 1 como referencia. Recién preparar la solución de trabajo de resazurina para este tipo de análisis. Además, los tiempos de incubación tienen que ser iguales entre las diferentes mediciones.
- Repetir todo el protocolo de medida de conversión de resazurina al menos tres veces para obtener resultados consistentes.
8. La tinción vivo-muerto
- Placa de las células Scp1 en el andamio con una densidad de siembra de 50.000 células / andamio y permitir que crezca en el andamio de mantenimiento de las condiciones de cultivo celular estándar (consulte el protocolo 1 y 2).
- Después de 24-48 hr aspirar completamente el medio de cultivo de las células SCP-1 y desechar en un contenedor de residuos.
- Se lavan las células SCP-1 una vez con DPBS para eliminar células desprendidas. Añadir 500 DPBS l por pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
- Manchas SCP-1 usando fluoróforos (las tres manchas al mismo tiempo):
- De ahora en adelantemantener a los andamios en la oscuridad con el fin de proteger el blanqueo fluoróforos de la luz del día!
- Establecer un tiempo de incubación de 30 min con el fin de permitir la distribución igual en todo el andamio. Si la transferencia a otros andamios, asegúrese de optimizar los tiempos de incubación para adaptarse a las características individuales de andamio (tamaño de poro, la profundidad de andamios, etc.).
- Con el fin de detectar células viables en el andamio, teñir las células con calceína AM a una concentración final de 2 mM (en medio de cultivo).
- Con el fin de detectar todas las células en el andamio, teñir las células con Hoechst 33342 a una concentración final de 0,002 g / l (en medio de cultivo).
- Con el fin de detectar las células muertas, incubar el andamio con homodímero de etidio a una concentración final de 4 mM (en medio de cultivo).
- Después del tiempo de incubación, se lavan las células 3 veces con DPBS (1 ml por pocillo) para cada 5 min a temperatura ambiente.
- Inmediatamente tomar la fotos mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
- Tomar fotografías de la calceína (células vivas) con un conjunto de cubo / filtro de LED GFP (excitación y emisión de longitud de onda de 470/22 nm y 510/42 nm, respectivamente). Alternativamente elegir una excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Calceína tiene su excitación máxima a 488 nm y su emisión pico a 507 nm. Nota: Asegúrese de no utilizar las células transfectadas GFP para la tinción de fluorescencia con calceína u otras manchas fluorescentes verdes.
- Tome fotografías de los Hoechst 33342 con DAPI LED cubo / juego de filtros con una longitud de onda de excitación de 357/44 nm y una longitud de onda de emisión de 447/60 nm. Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Hoechst 33342 tiene su excitación máxima a 347 nm y su pico de emisión a 483 nm.
- Tome fotografías del homodímero de etidio con un conjunto de LED RFP cubo / filtro (la excitación y la longitud de emisión of 531/40 nm y 593/40 nm, respectivamente). Alternativamente elegir la excitación adecuada y longitud de onda de emisión con la ayuda del espectador espectral de fluorescencia. Homodímero de etidio tiene su pico de excitación a 530 nm y su pico de emisión a 618 nm.
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Representative Results
Los resultados preliminares mostraron que la novela implante de núcleo descrito no sólo tiene buenas características de amortiguación, pero también es biocompatible con células SCP-1. Durante el proceso de producción del implante, que entra en contacto con sustancias fuertemente corrosivos y tóxicos (lubricante, solución mordiente, electro-pulido). Con la ayuda de técnicas de tinción de inmunofluorescencia indirecta hemos sido capaces de visualizar impurezas restantes y en consecuencia optimizar un protocolo de limpieza que muestra la reducción significativa de la carga de sustancias en el andamio. La figura 3 muestra la eficiencia de protocolo de limpieza establecido.
El éxito de los implantes utilizados para el tratamiento artroplastia se determina por los acontecimientos que tienen lugar en la interfase de las células material. La Figura 4 muestra las células unidas en el andamio después de 24 h de placas, como se describe en la sección de protocolo 6. Un significativo transeficiencia de infección de las células SCP-1 se observó que pudimos imagen del patrón de crecimiento de las células precursoras mesenquimales del estroma en el andamio (véase la Figura 2). La visualización directa confirma la biocompatibilidad del andamio y también representa el patrón de la adhesión en la superficie del andamio (Figura 4). tinción de fluorescencia se puede hacer más para analizar la interacción de células con y extendiéndose sobre la superficie del andamio.
Los fluoróforos se aplicaron con éxito a fin de examinar la muerte y la proliferación celular durante un período de tiempo en el andamio. Imágenes-dead-tinción vivo ejemplifican cómo tinción con éxito se puede hacer en el andamio para confirmar la viabilidad ciento de las células durante un período de tiempo. La Figura 6 muestra la tinción nuclear azul (Hoechst 3342) en todas las células, rojo marcado con fluorescencia (homodímero de etidio) células muertas y etiquetado verde para la incorporación de calceína-AM como la viabilidad marker. Calceína AM se convierte en calceína que exhibe una fluorescencia verde brillante en presencia de iones de calcio en el citoplasma de las células. Hoechst 33342 es la pared celular permeable y se intercala en el ADN celular. De esta manera todas las células mostrará núcleos azul (véase la Figura 6). Homodímero de etidio no es la pared celular permeable, por lo que sólo se intercalan en el ADN de las células muertas. De esta manera, las células muertas se mostrará núcleos rojos. Además, la viabilidad celular y doblar aumento del número de células en andamio más de una semana se cuantificó por ensayo de resazurina conversión y representados gráficamente (Figura 7).
Figura 1: Recuento celular con un hemocitómetro (A) Configuración de un conjunto de cámara.. (B) Ilustración de cámaras de recuento; 4 x 4 cámara de recuento se utiliza para una célula COUnt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. GFP eficiencia de la transfección las células Scp1 exhiben una fuerte fluorescencia verde que indica la eficacia de transfección positiva ad-GFP. Barra de escala = 1,000 micras, magnificación de 4x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Sulforodamina B tinción de captura de imágenes negativas (A) Andamios antes de limpiar.. La flecha indica la presencia de sustancias tóxicas / corrosivos en andamio. (B) Andamios después de que el protocolo de limpieza. Barra de escala = 1,000 micras, magnificación de 4x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Patrón de adherencia de las células SCP1 en andamio señal de GFP indica la adherencia celular y el patrón de crecimiento en la superficie del andamio de titanio de punto. Barra de escala = 1,000 micras, magnificación de 4x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: tinción Co-fluorescencia de las células en andamio (.
Figura 7: Análisis de Conversión de resazurina (A) reacción de reducción bioquímica de colorante redox (resazurina) en un producto final (resorufina) que emite fluorescencia y sufre cambios colorimétricos.. (B) se midió la actividad mitocondrial cuando se sembraron las células en andamio densidad de 0,75 mg / cm³. Los datos fueron recolectados a través de flfluorescencia aparato de medición basado. La intensidad de fluorescencia a 590 nm (eje y) en puntos de tiempo definidos (eje x) se representa como un resultado de la medición cuantitativa de la viabilidad celular (Ex = 540 nm, Em = 590 nm). La significación estadística se determinó usando ANOVA de dos vías y el error estándar de la media (SEM) se muestra como un barras de error. Teniendo en cuenta las propiedades físicas de andamios, por ejemplo, el tamaño de los poros y las propiedades mecánicas (por ejemplo, la función de amortiguación) juntos, se utilizó andamio densidad de 0,75 mg / cm³ para la caracterización de biocompatibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| componentes de medios | Concentración |
| aMEM medios basales (%) | 90 |
| Serum (%) | 10 |
| Penicilina / estreptomicina (%) | 1 |
Tabla 1: Cultivo de células composición (aMEM) los medios de comunicación.
| Problema | Porque | Solución |
| La viabilidad celular de imágenes en andamio para no transparente | Andamios impide que la luz penetre sin distorsión | Utilice una técnica de imagen basada fluoróforo para la evaluación de la célula. |
| Interferencia de la intensidad de fluorescencia | autofluorescencia, señal de fondo | Prestar atención a los fluoróforos y el uso adecuado en función de las propiedades particulares de andamios. |
| evaluación de la viabilidad celular en el andamio en un período de cultivo | Repeated mediciones durante un largo tiempo | Transfectar las células con partículas-GFP-virus anuncio. |
| evaluación de la funcionalidad celular en el andamio no transparente | técnica de imágenes de fluorescencia sólo permite la propagación de células análisis de patrones. | Realizar resazurina ensayo de conversión (cuantitativo de medición de la viabilidad celular) en una combinación con la técnica de formación de imágenes. |
Tabla 2: Tabla resumen: la solución de problemas de imagen viabilidad celular en andamio no transparente.
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Discussion
La superficie de andamio juega un papel importante en su interacción con el tejido circundante in vivo determinando de ese modo los implantes durabilidad funcional. Por lo tanto, la biocompatibilidad del andamio se estudió mediante ensayos in vitro usando células (línea celular SCP1), cuando se siembran en los andamios.
técnicas de microscopía que funcionan bien con andamios fino y ópticamente transparentes, son poco adecuados para los andamios no transparentes para estudiar la biocompatibilidad. Esto es principalmente debido a que los andamios no transparentes impiden que la luz penetre sin distorsión significativa 15. Para superar estos problemas, en parte, le presentamos aquí establecer un método para la evaluación de células sobre / en los andamios de titanio hecha de punto utilizando varios fluoróforos.
A fin de permitir hacer punto seguido por plegado de los alambres de titanio, el material entra en contacto con fuertes sustancias corrosivas y tóxicas (lubricante, mordiente, electrosolución), lo que podría alterar la biocompatibilidad del andamio si quedan restos en / sobre el andamio -polishing. Con la ayuda de un protocolo de fluorescencia indirecta-desarrollado (Protocolo 5) pudimos visualizar la estructura del andamio. Además, las características de andamios, por ejemplo, el espesor del material, el tamaño individual de los poros y forma, o la densidad conectivo, se analizaron usando ImageJ. A epifluorescencia superior magnificada imagen microscópica permite la visualización de las impurezas en el andamio, así como en la superficie del andamio. La figura 3b representa, pues, el resultado de confirmación del protocolo de limpieza desarrollado con éxito. El principio de este protocolo de tinción indirecta puede ser reproducida fácilmente a otros andamios no transparentes, teniendo en cuenta las propiedades de andamio individuales, por ejemplo, tamaño de poro y la difusión correspondiente que afecta al tiempo de incubación. También, auto-fluorescencia de la configuración de andamio y microscópicas afecta a la elección de fluorophores utilizan. El espectador espectral de fluorescencia herramienta en línea puede ayudar a elegir los fluoróforos adecuados.
interacción célula-metal ha sido examinado indirectamente mediante el análisis del patrón de adherencia de las células en el andamio. Protocolo 6 describe la metodología de cómo las células se pueden monitorizar in vitro si chapado en andamios no transparentes en sistemas de cultivo mediante el uso de una estrategia de GFP transfección. Con base en los resultados preliminares de los ensayos in vitro, se ha predicho que las propiedades de superficie tales como la composición, micro-topografía y rugosidad 16 podrían desempeñar un papel importante en el establecimiento de la adhesión y la propagación de las células diana. Titanium siendo un biomaterial de este modo podría estar actuando como una plantilla sustrato para proporcionar la base para la fijación celular (véase la Figura 4).
Topografía de la superficie del implante se ha informado de influir en el comportamiento de células 16. En el presente estudio, se analizó el crecimiento celular /la difusión y la viabilidad utilizando técnicas de tinción de fluorescencia en combinación con medidas de viabilidad cuantitativos. El análisis reveló sutil variación en porcentaje la viabilidad celular y la difusión en función del material de soporte. Sin embargo, la funcionalidad celular evaluada cuantitativamente por resazurina conversión de ensayo (actividad mitocondrial), no se vio afectada significativamente por el material de soporte. La medición de la actividad mitocondrial por resazurina conversión tiene la ventaja de que no es una célula tóxico y por lo tanto se puede realizar repetidamente durante un periodo de cultivo largo. Especial cuidado debe tenerse cuando se lava fuera de la solución de trabajo resazurina residual, por lo que no se acumulan señal de fondo (resultados falsos positivos). A pesar de estas ventajas, el ensayo de conversión de resazurina no dará ninguna información sobre la propagación de células en el andamio. Las células GFP infectadas por lo tanto, pueden ser seguidos durante un largo período de cultivo (señal de GFP se mantuvo constante durante más de 14 días), lo que permite visualizar sESPECÍFICOS patrón de crecimiento en la superficie del andamio. La visualización de las células más profundas en el andamio todavía está limitada por el material de soporte y por lo tanto requerirá disección del implante. La combinación de estas dos técnicas tiene la gran ventaja de que puede ser fácilmente transferido a otros tipos de células, teniendo en cuenta que el tiempo de incubación podría tener que ser adaptado al tipo de célula de interés. Sin embargo, la atención tiene que ser tomado al transferir este método a otros andamios no transparentes, por ejemplo, el colágeno andamios que suelen experimentar una fuerte verde autofluorescencia 17 basada. En este caso se podrían utilizar otras etiquetas fluorescentes. La combinación de dos métodos anteriores indicados por lo tanto tiene varias ventajas (ver Tabla 2).
Características de andamios, por ejemplo, las células de los poros de tamaño trampa poder dentro del andamio. Si no se suministran suficientes nutrientes, estas células podrían morir y secretan proteasas que afectan a la viabilidad celular de la envolventeing células / tejido. Hemos sido capaces de adaptar un protocolo de tinción basada fluorescente que es capaz de visualizar las células vivas y muertas en y sobre el andamio de titanio de punto. Al igual que en el protocolo de tinción de fluorescencia indirecta, el principio de este protocolo de tinción puede transferirse fácilmente a otros andamios no transparentes. Al hacerlo, las propiedades de andamio individuales, por ejemplo, tamaño de poro y la difusión correspondiente, así como sea posible auto-fluorescencia, entorno microscópico tienen que ser tomadas en consideración, ya que podría afectar el tiempo de incubación y la elección de los fluoróforos utilizados. Aquí, de nuevo al espectador espectral de fluorescencia herramienta en línea puede ayudar a elegir los fluoróforos adecuados.
En resumen, los resultados in vitro indican que el modelo de implante de núcleo de titanio de punto propuesto tiene un perfil biológico. fijación inicial de las células precursoras mesenquimales estromales (células SCP-1) en este material sugiere que este implante de titanio materia de aleaciónl es biocompatible. Aunque no hemos analizado asociación de diferentes parámetros topográficos, modificación de la superficie del andamio podría aumentar la proliferación adherencia de las células, así como la diferenciación 18. Compatibilidad óptima entre andamio y células elevar la probabilidad de una mejor integración del implante en el tejido circundante y por lo tanto la mejora de la longevidad en vivo después del tratamiento 19. Uso de la configuración de la prueba se ha indicado anteriormente, abre la posibilidad de medir y visualizar las mejoras en el rendimiento biológico del andamio inducida por modificaciones de la superficie. La preferencia de los andamios con superficie bioactiva sobre diseños de implantes sin modificar sugiere el mejor rendimiento de 20 en términos de integración osteo-condrogénica. Este estudio es aún mayor por otros informes sobre el implante de titanio de punto donde su propiedad mecánica y bioactividad se ha informado de 6,7.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia. Ninguna parte del trabajo ha sido o está actualmente bajo consideración para su publicación o ha sido publicado en otra parte.
Acknowledgments
Proyecto está financiado en parte por Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La tasa de publicación ha sido cubierto por el trauma del hospital BG Tübingen, Alemania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * | |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 | |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 | |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 | |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 | |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 | |
| Acetic acid, purum ≥ 99.0% | Carl Roth | 3738.4 | |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 | |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 | |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 | |
| Filter unit (0.22 µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS | |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 | |
| Ethanol 99% | SAV liquid prod. GmBH | 475956 | |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 | |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | ||
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG | |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | ||
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 | |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G | |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G | |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 | |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 | |
| Trypan Blue 0.5% | Carl Roth | CN76.1 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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