Summary
Le cellule staminali adiposo-derivate (ASCs) sono facilmente isolate e raccolto dal grasso dei ratti normali. Fogli di ASC possono essere creati usando l'ingegneria di strato delle cellule e possono essere trapiantate in Zucker ratti grassi diabetici che esibiscono di pieno-spessore della pelle difetti con osso esposto e poi coperto con un doppio strato di pelle artificiale.
Abstract
Pelle artificiale ha raggiunto notevoli risultati terapeutici nella pratica clinica. Tuttavia, trattamenti della pelle artificiale per le ferite in pazienti diabetici con flusso sanguigno impedita o con le grandi ferite potrebbe essere prolungata. Terapie basate su cellule sono apparsi come una nuova tecnica per il trattamento delle ulcere diabetiche, e ingegneria di strato delle cellule ha migliorato l'efficacia del trapianto di cellule. Una serie di rapporti hanno suggerito che adiposo-ha derivato le cellule staminali (ASCs), un tipo di cellule stromali mesenchimali (MSC), presentano un potenziale terapeutico a causa della loro abbondanza relativa nel tessuto adiposo e loro accessibilità per raccolta rispetto al MSCs da altri tessuti. Di conseguenza, ASC sembra essere una buona fonte di cellule staminali per uso terapeutico. In questo studio, fogli ASC dal grasso adiposo dell'epididimo di ratti Lewis normali con successo sono stati creati utilizzando piastre di coltura termosensibile e normale mezzo di coltura contenente acido ascorbico. I fogli ASC sono stati trapiantati nei ratti grassi diabetici (ZDF) di Zucker, un modello del ratto del diabete di tipo 2 e dell'obesità, che presentano diminuita la guarigione delle ferite. Una ferita è stata creata sulla superficie cranica posteriore, fogli di ASC sono stati trapiantati nella ferita e una pelle artificiale doppio strato è stata usata per coprire i fogli. Ratti ZDF che hanno ricevuto fogli ASC meglio avevano delle ferite che i ratti ZDF senza il trapianto di fogli di ASC. Questo approccio è stato limitato perché ASC fogli sono sensibili alle condizioni di asciutto, che richiedono il mantenimento di un ambiente umido. Pertanto, pelle artificiale è stata usata per coprire il foglio di ASC per prevenire la secchezza. Il trapianto allogenico di fogli ASC in combinazione con pelle artificiale potrebbe anche essere applicabile ad altre ulcere intrattabili o ustioni, come quelle osservate con la malattia arteriosa periferica e la malattia del collageno e potrebbe essere somministrato a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Così, questo trattamento potrebbe essere il primo passo per migliorare le opzioni terapeutiche per diabetico wound healing.
Introduction
La popolazione di pazienti diabetici è in aumento in tutto il mondo e ha raggiunto 400 milioni nel 20151; circa 15-25% dei pazienti con diabete sono a rischio per la progressione di un ulcera diabetica del basso-estremità2. Ulcere diabetiche del basso-estremità sono intrattabili e potrebbero richiedere un periodo terapeutico prolungato con formazione di riabilitazione dopo il recupero completo. Un periodo di lunga terapia spesso si traduce in una significativa riduzione nella qualità della vita dei pazienti. Così, nuove terapie che diminuiscono o impediscono l'aggravamento devono essere sviluppate per il trattamento delle ferite diabetiche. Per valutare la guarigione della ferita diabetica, abbiamo ottimizzato un ulcera diabetica cicatrizzazione modello in ratti, che imita condizioni cliniche pratiche, e valutate se trapianto di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) fogli utilizzando ingegneria cellulare-foglio accelerato la guarigione delle ferite.
Cellule stromali mesenchimali (MSCs) esibiscono un potenziale eccellente per accelerare la guarigione della ferita a causa della loro capacità di auto-rinnovamento, loro effetti immunomodulatori e la loro capacità di differenziarsi in vari cell lineages3. ASC sono un tipo di MSC derivate dal tessuto adiposo, ed essi presentano parecchi vantaggi sopra MSCs derivate da altri tessuti, compreso il loro potenziale angiogenico e attività paracrina4,5. Il tessuto adiposo è relativamente abbondante nel corpo umano, e sua accessibilità consente insieme utilizzando procedure minimamente invasive. Quindi, ASC sono stati usati sperimentalmente per guarigione applicazioni6,7.
Rapporti precedenti hanno indicato che l'iniezione diretta di sospensioni unicellulari MSC in aree intorno alle ferite possa accelerare la cicatrizzazione8,9. Tuttavia, nonostante i rapporti di accelerazione della guarigione delle ferite nei modelli di ulcera diabetica dopo l'iniezione di sospensioni unicellulari, il tempo di sopravvivenza delle cellule trapiantate al sito della ferita non è chiaro.
In questo studio, abbiamo applicato ingegneria cellulare-foglio utilizzando piastre di coltura termosensibile. Questi piatti hanno il polimero termosensibile N- isopropylacrylamide covalentemente sulla loro superficie10. Lo strato di polimero innestato permette per adesione a temperatura controllata o distacco dalla superficie della piastra di coltura. La superficie del piatto diventa idrofobica a 37 ° C, consentendo alle cellule di aderire e proliferare, mentre le cellule si staccano spontaneamente dalla superficie quando diventa idrofila a temperature inferiori a 32 ° C. Cellule in coltura possono essere raccolto come uno strato di cellule contigue con giunzioni cellula--cellula intatte e matrici extracellulari (ECMs) semplicemente riducendo la temperatura; così, gli enzimi proteolitici che danneggiano l'ECM, quali tripsina, non sono necessari11. Pertanto, ingegneria di strato delle cellule può preservare le connessioni cellula--cellula e migliorare l'efficacia del trapianto di cellule.
Inoltre, il trapianto delle cellule-foglio aumenta i tassi di sopravvivenza delle cellule rispetto a cella iniezione12. In questo protocollo, ratti grassi diabetici di Zucker (ZDF) sono stati selezionati come un modello di obesità e diabete di tipo 2 con ritardata guarigione delle ferite. Ratti di ZDF sviluppano spontaneamente l'obesità a circa 4 settimane. Quindi si sviluppa il diabete di tipo 2 con l'obesità tra 8 e 12 settimane di età, al punto che esibiscono l'iperglicemia associata con insulino resistenza, dislipidemia e ipertrigliceridemia13. Ritardata guarigione delle ferite, riduzione del flusso sanguigno nei vasi sanguigni periferici e della nefropatia diabetica si osservano anche14,15,16. Inoltre, ratti di ZDF potrebbero essere un modello appropriato per studiare la guarigione delle ulcere cutanee insolubile, come le ulcere diabetiche.
Le differenze tra esseri umani e roditori nei meccanismi di guarigione sono associate con differenze anatomiche nella pelle. Cicatrizzazione in ratti normali si basa sulla contrazione della ferita, mentre la guarigione arrotolata negli esseri umani è basata sulla formazione di tessuto di granulazione e riepitelizzazione. In genere, ferita splinting utilizzato nei modelli del roditore aiuta a minimizzare la contrazione della ferita e consente la graduale formazione di tessuto di granulazione17, anche se le ferite in ratti nondiabetic sono quasi completamente chiusa dalla contrazione. Tuttavia, contrazione della ferita diabetica in ZDF ratti è alterata, e principalmente la guarigione della ferita avviene attraverso la riepitelizzazione e formazione di tessuto di granulazione; così, questo processo è più simile a14di cicatrizzazione umana.
Ferite diabetiche con osso esposto dopo lo sbrigliamento sono spesso incontrate clinicamente. Precedenti studi hanno esaminato le ferite della pelle di pieno-spessore 12 mm diametro sulle spalle dei topi nudi athymic18,19 e ferite della pelle di pieno-spessore 10 mm diametro sulle spalle dei topi normali20. Per sviluppare un modello clinico per gravi ferite diabetiche, più grande (15 x 10 mm2) difetti di pelle di pieno-spessore con esposti dell'osso e senza il periostio sono stati creati, come descritto in precedenza21, in ratti con diabete di tipo 2 e l'obesità.
Fogli ASC (rASC) ratto da ASC di ratti normali di Lewis sono stati creati attraverso il trapianto allogenico di fogli di ASC. Nella pratica clinica, il trapianto autologo è impraticabile perché pazienti diabetici con ulcere spesso presentano gravi complicazioni diabetiche, quali i livelli di glucosio nel sangue alta non controllata e indici di massa corporea elevato e questi disturbi di cicatrizzazione di complicazioni causa che aumentano la difficoltà di ottenere tessuto adiposo da questi pazienti. Inoltre, ASC da animali con mostre di diabete alterata proprietà e alterata funzione22. Di conseguenza, il protocollo presentato qui descrive il trapianto allogenico di fogli rASC da ratti normali e l'applicazione della cute artificiale ai ratti diabetici.
La pelle artificiale doppio strato utilizzata nel presente protocollo impedisce la contrazione spontanea delle ferite, promuove la sintesi di una nuova matrice di tessuto connettivo e assomiglia il derma vero23. In questo protocollo, Cute artificiale viene appoggiata su un foglio di rASC e fissata con fili di nylon per impedire la contrazione della ferita o allargamento risultanti da pelle allentata del ratto. Inoltre, la pelle artificiale fornisce un quadro tridimensionale per i fogli ASC, mantiene un ambiente umido per il trapiantato ASC fogli e ferite e protegge le ferite da infezione e forze esterne. Infine, una medicazione non adesiva è posizionata sopra la ferita per proteggerlo da urti esterni, mantenere un ambiente umido e assorbire essudato.
Un foglio di rASC è sottile, flessibile e deformabile e possa essere rispettato siti destinatari, ad esempio un pestaggio cuore24in movimento. Ingegneria di strato delle cellule è stato utilizzato per la ricostruzione di vari tessuti e può generare effetti curativi25,26. Fogli ASC che presentano il potenziale terapeutico clinico potrebbero accelerare la guarigione di molti tipi di ferite. Inoltre, il trapianto allogenico di fogli ASC, combinato con l'uso della pelle artificiale, potrebbe non essere applicabile al trattamento delle ulcere intrattabili o ustioni, come quelli osservati nella malattia arteriosa periferica o malattia del collageno, o può essere somministrati a pazienti che sono denutriti o sono utilizzando gli steroidi. Questo approccio aumenta l'efficienza del trapianto ASC. Modello del ratto ZDF di guarigione della ferita produce una condizione di grave ferita che assomiglia il processo di cicatrizzazione umana e simula condizioni cliniche in un animale sperimentale di piccole dimensioni.
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Representative Results
Questo protocollo ha tentato di stabilire una nuova terapia cellulare per le ferite diabetiche insolubile. Brevemente (come illustrato nella Figura 1), trapianto allogeneic rASC fogli sono stati creati da ratti normali usando l'ingegneria di strato delle cellule e quindi sono stati trapiantati utilizzando un doppio strato di pelle artificiale su un difetto della pelle di pieno-spessore su un ratto diabetico. Immagini di microscopio ottico di un buon esempio di un foglio di rASC (Figura 2A) e un cattivo esempio di un foglio di rASC (Figura 2B) sono indicate nella Figura 2. Quando ASC sono piastrate su una nuova piastra di coltura, il piatto dovrebbe essere lentamente avanti e indietro scosso e sinistra e destra in un'incubatrice per raggiungere semina uniforme rASC e un foglio di spessore uniformemente rASC (Figura 2A). Se il rASCs non può essere collegato uniformemente e coltivate sulla superficie della piastra di coltura, il foglio non può essere raccolti come un foglio ASC contiguo (Figura 2B). La figura 3 Mostra fogli ASC che sono state raccolte come un foglio delle cellule contigue a temperatura ambiente perché ASC uniformemente sono state fissate alla superficie del piatto. Di solito, rASC fogli possono essere gestiti con un paio di pinze. Se necessario, che una membrana di trasferimento può essere utilizzata per trasferire un foglio delle cellule dalla piastra di coltura al sito della ferita, ad esempio se il foglio di cella è fragile e fragile.
Figura 4 descrive i ratti ZDF utilizzati come un modello diabetico di guarigione della ferita e il trapianto allogenico rASC fogli combinato con pelle artificiale. Un foglio rASC è morbido e flessibile, regolabile nelle dimensioni e in grado di essere estesa in ogni angolo del sito della ferita con un paio di pinze (Figura 4A-F). Il difetto coperto da fogli rASC era anche ricoperta di pelle artificiale (15 x 10 mm2) e suturato con circa 10 punti utilizzando una sutura in nylon 5-0 (Figura 4). Per proteggere la ferita, è stata mantenuta la ferita in ambiente umido e gli essudati sono stati assorbiti, una medicazione non adesiva (20 x 15 mm2) è stato disposto sopra la pelle artificiale e suture in nylon 5-0 sono state applicate (Figura 4I). La medicazione non adesiva viene spesso rimosso dai ratti ZDF entro parecchi giorni di applicazione. Di conseguenza, i ratti devono essere monitorati dopo trapianto. Di solito, la medicazione non adesiva viene sostituita ogni 2 giorni in anestesia generale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le fotografie macroscopiche nella Figura 5 sono risultati rappresentativi del trapianto di un foglio di rASC. Nel nostro studio precedente, l'area ferita medio nel gruppo di trapianto foglio rASC (figura 5B) era significativamente inferiore nel gruppo di controllo (Figura 5A). Per i controlli, solo pelle artificiale è stata utilizzata per coprire la ferita, senza il trapianto di un foglio di rASC. Queste immagini sono state scattate al 14° giorno dopo la creazione della ferita (n = 6 in ogni gruppo)31.
Figura 1: schematico della procedura di trapianto sperimentale. Schema della procedura di trapianto sperimentale eseguita con un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (rASC) di ratto allogeniche e pelle artificiale in un modello del ratto di guarigione del diabete di tipo 2 e dell'obesità. Ratto (A) tessuto adiposo è stata asportata chirurgicamente da ratti Lewis normali. rASCs sono stati isolati e seminate su una piastra di coltura di 60 cm2 e coltivate a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 7-8 giorni. (B) rASCs erano una subcoltura ogni 2-3 giorni, e rASCs di passaggio 3 sono state seminate su una piastra di coltura temperatura-sensibli a reagire del diametro di 35 mm. Le cellule sono state coltivate in terreno completo contenente L-ascorbico acido fosfato magnesio sale n-idrato (AA) 16,4 µ g/mL a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 7-8 giorni. Le rASCs sono state raccolte come un foglio contiguo rASC riducendo la temperatura a 20 ° C. (C) rASC fogli trapiantati su un difetto di pelle di pieno-spessore2 mm 15 x 10 con osso esposto sulle teste dei ratti che esibiscono il diabete e l'obesità (ratti (ZDF) grassi diabetici di Zucker) utilizzato come un modello di guarigione della ferita. (D) un foglio rASC era disposto sul cranio direttamente sopra il difetto e coperto) con un 15 x 10 mm2 foglio di Cute artificiale di doppio strato, che è stata suturata in posto con nylon 10 punti di sutura (5-0). Diabete 2015; 64: 2723-2734; con permesso. Diabete (c) copyright (2015) dall'associazione americana del diabete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Luce microscopio immagini di ASCs. Microscopio ottico immagini di proliferazione ASC al bordo delle piastre di coltura, senza pause tra le ASC. (A) un rASC foglio con uno spessore uniforme in tutte le direzioni 7 giorni dopo l'inizio della coltura (A). (B) un foglio rASC senza semina uniforme. Un foglio rASC contigui non può essere ottenuto il giorno 7 dopo l'inizio della coltura (B). Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Time-lapse immagini di rASC foglio statue a temperatura ambiente. Time-lapse immagini dello status di un foglio di rASC a temperatura ambiente. rASCs su una piastra di coltura temperatura-sensibli a reagire del diametro di 35 mm spontaneamente e gradualmente staccata dalla superficie del piatto a temperatura ambiente (circa 20 ° C) e sono state raccolte come un foglio contiguo. (A) circa 5 minuti dopo lo spostamento piastra di coltura temperatura-sensibli a reagire a temperatura ambiente. (B) circa 10 min dopo aver spostato il piatto di cultura termosensibile di diametro 35 mm a temperatura ambiente. (C) circa 20-30 min dopo aver spostato la piastra di coltura temperatura-sensibli a reagire a temperatura ambiente. Si tratta di un foglio di buona qualità rASC (C). Stato di foglio rASC (D-E) circa 20-30 min dopo aver spostato la piastra di coltura temperatura-sensibli a reagire a temperatura ambiente. Questo foglio rASC è di qualità media (D). Fogli di rASC (F-G) in genere vengono gestite con un paio di pinze. Se il foglio di cella è fragile e fragile, una membrana utilizzabile come impalcatura per il trasferimento di strato di cellule dalla piastra di coltura al sito della ferita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini serie temporali di creazione ferita e rASC foglio trapianto con pelle artificiale e una medicazione Non adesiva
Immagini di serie tempo di ferita creazione e rASC trapianto foglio con pelle artificiale e una medicazione non adesiva. (A), le teste di ZDF ratti erano rasati con un rasoio elettrico. Dopo la rasatura, i peli del corpo, segni di spunta (15 x 10 mm2) sono stati disegnati usando una penna oleosa idrofobica. (B), un difetto della pelle di pieno-spessore (15 x 10 mm2) è stato creato sulla testa di un ratto anestetizzato ZDF rimuovendo il tessuto cutaneo dall'epidermide al periostio. La pelle e il tessuto cutaneo sono stati asportati con un bisturi, e il periostio è stato rimosso con un periosteal raspatory. Utilizzando garza inumidita con soluzione fisiologica sterile, la pressione è stata applicata per fermare l'emorragia dopo l'asportazione. (C) trapianto di foglio rASC. Un foglio di rASC era posizionato sopra il difetto immediatamente sopra il cranio del ratto usando un paio di pinze. (D-G) Estensione di foglio rASC regolazione in base al formato della ferita. Il foglio rASC è flessibile, regolabile e può essere estesa in ogni angolo del sito della ferita usando un paio di pinze. Per le ferite più ampia, due o tre fogli flessibili rASC possono essere impilati. (H) suturare la cute artificiale che copre il foglio rASC. Il difetto e il foglio di trapiantati rASC erano ricoperte di pelle artificiale (15 x 10 mm2), che è stata suturata con 10 punti usando i suturare di nylon 5-0. (io) sutura del non-adesivo medicazione (20 x 15 mm2) al sito della ferita ricoperta di pelle artificiale. Per proteggere la ferita, la medicazione non adesiva (20 x 15 mm2) era posizionata sopra la pelle artificiale con suture in nylon 5-0. Diabete 2015; 64: 2723-2734; con permesso. Diabete (c) copyright (2015) dall'associazione americana del diabete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: immagini macroscopiche di pieno-spessore della pelle difetti. Fotografie macroscopiche della pelle di pieno-spessore difetti senza il trapianto di un foglio di rASC (A) e con il trapianto di un foglio di rASC (B) 14 giorni dopo la creazione della ferita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi più critici per la coltura con successo un foglio rASC sono come segue: 1) la temperatura deve essere mantenuta a circa 37 ° C durante la coltura sui piatti di cultura termosensibile. Durante la creazione di un foglio di rASC, ogni procedura è stata effettuata su un termo-piatto di 37 ° C, e ogni reagente è stata riscaldata a 37 ° C per impedire alle cellule di spontaneamente lo scollegamento dal piatto31. 2) i ratti ZDF destinatari devono essere monitorati per impedire la rimozione della medicazione non adesiva, che è critica per il riuscito trapianto di fogli rASC. Se viene tolto il bendaggio, una nuova medicazione non adesivo deve essere applicata per impedire che i fogli ASC trapiantati distaccarsi dal sito della ferita.
Utilizzando questa procedura, rASC fogli sono stati generalmente ottenuti entro 5-7 giorni di semina passaggio 3 celle in piastre di coltura termosensibile. Il tempo di cultura necessario per generare un foglio rASC può essere regolato secondo la densità iniziale delle cellule e l'ora in cui viene applicato il completo mezzo di coltura contenente AA. Se un foglio di rASC si stacca dal piatto durante la coltura delle cellule, il foglio rASC dovrebbe essere rifatto e ulteriori piatti devono essere preparati in caso di distacco cellulare.
Le limitazioni di questo protocollo sono come segue: 1) temperatura rigoroso di gestione deve essere applicato per mantenere una temperatura di 37 ° C circa durante l'intero processo, quando si utilizzano piastre di coltura termosensibile. 2) dopo aver ottenuto un foglio rASC, speciali dispositivi medici devono essere utilizzati per mantenere condizioni di umidità, poiché il foglio rASC è sensibile alle condizioni di asciutto. 3) gestione post-operatorie, tra cui osservazione quotidiana della condizione del ratto destinatario, è necessario.
Clinicamente si osservano spesso più grandi ferite con osso esposto. Ad esempio, traffico incidente trauma, ustioni, ferite infette e ferite necrotiche o danneggiate dopo sbrigliamento possono svilupparsi in grandi ferite con osso esposto. Qui, un modello clinico di gravi ferite è stato sviluppato utilizzando un difetto della pelle di grandi dimensioni, di pieno-spessore con osso esposto in ratti con diabete di tipo 2 e l'obesità. Questo modello ha il potenziale per essere utilizzato come un modello standard per valutare la guarigione arrotolata nei ratti diabetici.
Pelle artificiale è un dispositivo medico disponibile in commercio per i difetti della pelle di pieno-spessore dopo lo sbrigliamento e fattore di crescita ricombinanti base del fibroblasto (bFGF) è stato ampiamente utilizzato per la guarigione della ferita per promuovere l'angiogenesi e la granulazione. Questi due trattamenti sono stati utilizzati per raggiungere notevoli risultati terapeutici, anche per le ferite croniche, quali le ferite diabetiche. È stato segnalato che ASCs secernere fattori di crescita angiogeneic28, come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita epatocitario (HGF) e bFGF, che potrebbe contribuire alla neovascolarizzazione29,30 e accelerare la guarigione della ferita. Il nostro studio precedente ha confermato che ASCs secernono continuamente questi fattori di crescita31. Di conseguenza, fogli di ASC, combinati con pelle artificiale, hanno il potenziale per essere utilizzato come una nuova opzione terapeutica per accelerare la vascolarizzazione e cicatrizzazione31, e questi fogli potrebbero essere applicabili per il trattamento di molti tipi di ulcere intrattabili o ustioni nelle regolazioni cliniche umane in futuro.
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Disclosures
I seguenti autori rivelare relazioni finanziarie rilevanti per questa pubblicazione: Teruo Okano è fondatore e direttore del Comitato della cella seme Inc., che concede in licenza la tecnologia e brevetti da Università medica delle donne di Tokyo, e Teruo Okano e Masayuki Yamato sono le parti interessate in Medical University cella seme Inc Tokyo femminile riceve fondi di ricerca da Cell Seed Inc. Gli altri autori dichiarano che non hanno rapporti finanziari rilevanti per questa pubblicazione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Yukiko Koga del dipartimento di plastica e ricostruttiva, scuola di medicina dell'Università di Juntendo, per fornire consigli pratici. Ringraziamo anche il signor Hidekazu Murata del centro di Tokyo donne diabetiche di Medical University School of Medicine per l'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dalla creazione di centri di innovazione per avanzato programma di aree ricerca interdisciplinare del progetto per i sistemi in via di sviluppo innovativi "cella foglio Tissue Engineering Center (CSTEC)" dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60 cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
References
- International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
