Summary
Células-tronco adiposo-derivado (ASCs) são facilmente isoladas e colhidas a partir da gordura de ratos normais. ASC as folhas podem ser criadas usando a célula-folha engenharia e podem ser transplantadas Zucker ratos diabéticos gordos, exibindo a espessura total da pele defeitos com osso exposto e então coberto com uma BICAMADA de pele artificial.
Abstract
Pele artificial tem alcançado resultados terapêuticos consideráveis na prática clínica. No entanto, tratamentos de pele artificial para feridas em pacientes diabéticos com fluxo sanguíneo impedido ou com grandes feridas podem ser prolongados. Terapias baseadas em células surgiram como uma nova técnica para o tratamento de úlceras diabéticas e célula-folha engenharia melhorou a eficácia do transplante de células. Um número de relatórios sugeriram que derivado de adiposo as células-tronco (ASCs), um tipo de células estromais mesenquimais (MSC), apresentam potencial terapêutico devido a sua abundância relativa no tecido adiposo e sua acessibilidade para coleção quando comparados com MSCs de outros tecidos. Portanto, ASCs parecem ser uma boa fonte de células-tronco para uso terapêutico. Neste estudo, folhas ASC do epidídimo gordura adiposa de ratos normais de Lewis foram criadas com êxito usando pratos de cultura temperatura-responsiva e normal meio de cultura contendo ácido ascórbico. As folhas do ASC foram transplantadas em ratos diabéticos gordos (ZDF) de Zucker, um modelo do rato de diabetes tipo 2 e obesidade, que apresentam diminuição de cicatrização. Uma ferida foi criada na superfície craniana posterior, folhas do ASC foram transplantadas para a ferida, e uma pele artificial de BICAMADA foi utilizada para cobrir as folhas. Ratos ZDF que receberam folhas ASC tinham melhor cicatrização de feridas que ratos ZDF sem o transplante de folhas ASC. Esta abordagem foi limitada porque folhas ASC são sensíveis às condições de seca, que exigem a manutenção de um ambiente de ferida húmido. Portanto, pele artificial foi usada para cobrir a folha ASC para impedir a secagem. O transplante alogênico de folhas ASC em combinação com pele artificial pode também ser aplicável a outras úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como os observados com a doença arterial periférica e doença do colágeno e pode ser administrado a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Assim, este tratamento pode ser o primeiro passo para melhorar as opções terapêuticas para diabético ferida cura.
Introduction
A população de pacientes diabéticos está aumentando em todo o mundo e chegou a 400 milhões em 20151; um estimado de 15-25% dos pacientes com diabetes estão em risco da progressão de uma úlcera diabética de extremidade inferior2. Baixo-extremidade úlceras diabéticas são intratáveis e podem exigir um período prolongado de terapêutico com treinamento de reabilitação após a completa recuperação. Um período de tempo terapia muitas vezes resulta em uma redução significativa no paciente qualidade de vida. Assim, novas terapias que diminuem ou evitar o agravamento devem ser desenvolvidas para o tratamento de feridas diabéticas. Para avaliar a cicatrização de feridas diabéticas, nós aperfeiçoamos um úlcera diabética cicatrização modelo em ratos, que imita condições práticas clínicas, e avaliada se transplante de células-tronco adiposo-derivado (ASC) folhas usando célula-folha engenharia acelerado cicatrização de feridas.
Células estromais mesenquimais (MSCs) apresentam um potencial excelente para acelerar a cicatrização de feridas por causa de sua capacidade de auto-renovação, seus efeitos imunomoduladores e sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens de célula3. ASCs são um tipo de MSC derivada de tecido adiposo, e eles apresentam várias vantagens sobre o MSCs derivadas de outros tecidos, incluindo o seu potencial angiogênico e parácrina atividade4,5. Tecido adiposo é relativamente abundante no corpo humano, e sua acessibilidade permite coleção usando procedimentos minimamente invasivos. Portanto, ASCs foram usados experimentalmente para cicatrização da ferida aplicações6,7.
Relatórios anteriores mostraram que a injeção direta de suspensões de célula única MSC em áreas ao redor de feridas pode acelerar8,9de cicatrização de feridas. No entanto, apesar dos relatos da aceleração da cicatrização de feridas em modelos de úlcera diabética após a injeção de suspensões de célula única, o tempo de sobrevida das células transplantadas no local da ferida não é claro.
Neste estudo, aplicamos engenharia de celular-folha usando pratos de cultura temperatura-responsivo. Estes pratos têm a temperatura-responsivo polímero de N- isopropylacrylamide ligados covalentemente em sua superfície10. A camada de polímero transplantado permite aderência de célula de temperatura controlada de ou o destacamento da superfície do prato cultura. A superfície do prato se torna hidrofóbica a 37 ° C, permitindo que as células para aderir e proliferar, Considerando que as células espontaneamente desanexar da superfície quando se torna hidrofílica em temperaturas abaixo de 32 ° C. Culturas de células podem ser colhidas como uma folha de células contíguas com cruzamentos de célula para célula intactos e matrizes extracelulares (ECMs) simplesmente reduzindo a temperatura; assim, as enzimas proteolíticas que danificam o ECM, tais como a tripsina, não são necessários11. Portanto, célula-folha engenharia pode preservar ligações de celular para celular e melhorar a eficácia do transplante de células.
Além disso, transplante de células-folha aumenta as taxas de sobrevivência de células quando comparado com injeção de célula12. Neste protocolo, Zucker ratos diabéticos do gordo (ZDF) foram selecionados como um modelo de obesidade e diabetes tipo 2 com cicatrização retardada. Ratos ZDF espontaneamente desenvolvem obesidade em aproximadamente 4 semanas. Eles então desenvolver diabetes tipo 2 com obesidade entre 8 e 12 semanas de idade, altura em que eles apresentam hiperglicemia associada com insulina resistência, dislipidemia e hipertrigliceridemia13. Retardada ferida cura, redução do fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos periféricos e nefropatia diabética são também observadas14,15,16. Além disso, ratos ZDF podem ser um modelo adequado para estudar a cicatrização de úlceras cutâneas intratáveis, tais como úlceras diabéticas.
As diferenças entre os seres humanos e roedores em mecanismos de cicatrização de feridas são associadas com diferenças anatômicas na pele. Ferida em ratos normais de cura baseia-se na contração da ferida, Considerando que a cicatrização de feridas em humanos baseia-se na formação de tecido de granulação e re epitelização. Normalmente, ferida imobilização usado em modelos de roedores ajuda a minimizar a contração da ferida e permite a formação gradual do tecido de granulação17, apesar de feridas em ratos não-diabéticos são quase completamente fechadas pela contração. No entanto, diabético ferida contração na ZDF ratos é prejudicada, e ferida cura principalmente ocorre através de re-epitelização e a formação de tecido de granulação; assim, este processo é mais semelhante à humana ferida cura14.
Feridas diabéticas com osso exposto após desbridamento são frequentemente encontrados clinicamente. Estudos prévios examinaram, feridas de pele de espessura total de 12 mm de diâmetro nas costas do modelo camundongos18,19 e feridas de pele de espessura total de 10 mm de diâmetro nas costas dos ratos normais20. Para desenvolver um modelo clínico para feridas diabéticos graves, maiores defeitos de pele de espessura total (15 x 10 mm2) com expostos osso e sem o periósteo foram criados, como descrito anteriormente,21, em ratos com diabetes tipo 2 e obesidade.
Folhas ASC (rASC) rato das ASCs de ratos normais de Lewis foram criadas através do transplante alogênico de folhas ASC. Na prática clínica, o transplante autólogo é inviável porque pacientes diabéticos com úlceras, muitas vezes, apresentam graves complicações do diabético, como glicemia alta não controlada e os índices de massa corporal elevada e estes distúrbios cicatrização de causa complicações que aumentam a dificuldade de obtenção de tecido adiposo destes pacientes. Além disso, ASCs de animais com exposição de diabetes alteraram Propriedades e prejudicada a função22. Portanto, o protocolo aqui apresentado descreve o transplante alogênico de rASC folhas de ratos normais e a aplicação de pele artificial para ratos diabéticos.
A pele artificial de BICAMADA utilizada neste protocolo impede a contração espontânea das feridas, promove a síntese de uma nova matriz de tecido conjuntivo e assemelha-se a derme verdadeiro23. Neste protocolo, pele artificial é colocado sobre uma folha de rASC e fixado com fios de nylon para evitar a contração da ferida ou alargamento resultantes de pele de rato solto. Além disso, a pele artificial fornece uma estrutura tridimensional para as folhas ASC, mantém um ambiente úmido para o transplantado folhas ASC e feridas e protege as feridas de infecção e forças externas. Finalmente, um curativo não-adesivo é colocado sobre a ferida para protegê-lo contra impacto externo, manter um ambiente de ferida húmido e absorver o exsudato.
Uma folha de rASC é fino, flexível e deformável e pode ser aderida a mover sites destinatários, como uma batida de coração24. Célula-folha engenharia tem sido usada para a reconstrução de vários tecidos e pode gerar efeitos curativos25,26. Folhas ASC que apresentam potencial clínico terapêutico podem acelerar a cicatrização de muitos tipos de feridas. Além disso, o transplante alogênico de folhas ASC, combinado com o uso de pele artificial, pode ser aplicável para o tratamento de úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como aquelas observadas na doença arterial periférica ou doença do colágeno, ou eles podem ser administrados a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Esta abordagem aumenta a eficiência do transplante de ASCs. O modelo de rato ZDF-cicatrização produz uma condição de ferimento grave que se assemelha a ferida humana, processo de cura e imita condições clínicas em um animal experimental de pequeno porte.
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Representative Results
Este protocolo tentou estabelecer uma nova terapia baseada em células para feridas diabéticas intratáveis. Brevemente (como ilustrado na Figura 1), folhas de rASC alogênico foram criadas a partir de ratos normais usando a célula-folha engenharia e então foram transplantadas usando uma BICAMADA de pele artificial para um defeito de pele de espessura total em um rato diabético. Imagens de microscópio de luz de um bom exemplo de uma folha de rASC (Figura 2A) e um mau exemplo de uma folha de rASC (Figura 2B) são mostradas na Figura 2. Quando ASCs são banhados em um prato de cultura nova, o prato deve ser lentamente destruído e para trás e esquerda e direita na incubadora para alcançar rASC uniforme semeadura e uma folha de rASC uniformemente de espessura (Figura 2A). Se o rASCs não pode ser anexado e cultivadas na superfície do prato cultura uniformemente, a folha não pode ser coletada como uma folha contígua de ASC (Figura 2B). A Figura 3 mostra folhas ASC que tenham sido colhidas como uma folha de células contíguas à temperatura ambiente, porque as ASCs estavam presos uniformemente a superfície do prato. Geralmente, rASC folhas podem ser tratadas com um par de pinças. Se necessário, que uma membrana de transferência pode ser usada para transferir uma camada de células do prato de cultura para o local da ferida, como se a camada de células é frágeis e quebradiços.
A Figura 4 mostra os ratos ZDF, usados como um modelo de cicatrização de feridas diabético e o transplante alogênico rASC folhas combinado com pele artificial. Uma folha de rASC é macio e flexível, ajustável em tamanho e capaz de ser estendido a todos os cantos do local da ferida com um par de pinças (Figura 4A-F). RASC-cobria defeito também foi coberto com pele artificial (15 x 10 mm2) e suturado com aproximadamente 10 pontos usando uma sutura de nylon 5-0 (Figura 4). Para proteger a ferida, manteve-se um ambiente de ferida húmido e exsudatos foram absorvidos, um curativo não-adesivas (20 x 15 mm2) foi colocado sobre a pele artificial, e aplicaram-se suturas de nylon 5-0 (Figura 4I). O curativo não-adesivas é removido frequentemente pelos ratos ZDF dentro de vários dias de aplicação. Portanto, os ratos devem ser monitorados após transplante. Geralmente, o curativo não-adesivas é substituído a cada 2 dias sob anestesia geral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As fotografias macroscópicas na Figura 5 são os resultados representativos do transplante de uma folha de rASC. Em nosso estudo anterior, a área ferida média do grupo de transplante do rASC folha (Figura 5B) foi significativamente menor do que no grupo controle (Figura 5A). Para os controles, apenas pele artificial foi usada para cobrir a ferida, sem o transplante de uma folha de rASC. Estas imagens foram tiradas o 14º dia após a criação da ferida (n = 6 em cada grupo)31.
Figura 1: esquemático do processo de transplante Experimental. Diagrama esquemático do processo de transplante experimental realizada com uma folha de células-tronco adiposo-derivado (rASC) rato alogênico e pele artificial em um modelo do rato-cicatrização de obesidade e diabetes tipo 2. (A) rato tecido adiposo foi extirpado cirurgicamente de ratos normais de Lewis. rASCs foram isolados e semeados em um prato de cultura2 60 cm e cultivadas a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 , 7-8 dias. (B) rASCs foram repicagem cada 2-3 dias, e rASCs de passagem 3 foram semeadas em um prato de cultura temperatura-responsivo de diâmetro de 35mm. As células foram cultivadas em meio completo contendo 16,4 µ g/mL L-ascórbico ácido fosfato magnésio sal n-hidrato (AA) a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 7-8 dias. Os rASCs foram colhidas como uma folha contígua rASC, reduzindo a temperatura de 20 ° C. (C) folhas de rASC transplantadas para um defeito de pele de espessura total de2 de 15 x 10 mm com osso exposto nas cabeças dos ratos apresentando diabetes e obesidade (Zucker gordurosos (ZDF) ratos diabéticos), usado como um modelo de cicatrização de feridas. (D), uma folha de rASC foi colocado no crânio diretamente sobre o defeito e coberto) com 15 x 10 mm2 folha de pele artificial de BICAMADA, que foi suturada no lugar com nylon 10 suturas (5-0). Diabetes 2015; 64: 2723-2734; com permissão. Diabetes (c) copyright (2015) pela Associação Americana de Diabetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Luz imagens de microscópio de ASCs. Imagens de microscópio de luz da proliferação de ASC para a borda de pratos de cultura, sem lacunas entre as ASCs. (A) um rASC folha com espessura uniforme em todos os sentidos 7 dias após o início do cultivo (A). (B) uma folha rASC sem semeadura uniforme. Uma folha de rASC contíguas não pode ser obtida no 7º dia após o início do cultivo (B). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens do tempo-lapso de rASC folha estátuas à temperatura ambiente. Imagens de lapso de tempo do status de uma folha de rASC à temperatura ambiente. rASCs em um prato de cultura temperatura-responsivo de diâmetro 35mm espontaneamente e gradualmente retirado da superfície do prato à temperatura ambiente (cerca de 20 ° C) e foram colhidas como uma folha contígua. (A) aproximadamente 5 min depois de mover o prato de cultura temperatura-responsiva à temperatura ambiente. (B) aproximadamente 10 min depois de mover o prato de cultura temperatura-responsivo de diâmetro 35mm à temperatura ambiente. (C) aproximadamente 20-30 min depois de mover o prato de cultura temperatura-responsiva à temperatura ambiente. Esta é uma boa qualidade rASC folha (C). Status de folha (D-E) rASC aproximadamente 20-30 min depois de mover o prato de cultura temperatura-responsiva à temperatura ambiente. Esta folha de rASC é de qualidade média (D). (F-G) rASC folhas geralmente são tratadas com um par de pinças. Se a camada de células frágeis e quebradiços, uma membrana pode ser usada como um andaime para transferir a camada de células do prato de cultura para o local da ferida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens da série temporal de criação ferida e rASC transplante de folha com um molho de Non-adesivo de pele Artificial e
Imagens de série de tempo da ferida criação e rASC transplante de folha com pele artificial e um curativo não-adesivas. (A), os chefes da ZDF ratos foram a barba com um barbeador elétrico. Após raspar os pelos do corpo, marcas de verificação (15 x 10 mm2) foram desenhadas usando uma caneta hidrofóbica oleosa. (B), um defeito de pele de espessura total (15 x 10 mm2) foi criado na cabeça de um rato ZDF anestesiado, removendo o tecido cutâneo da epiderme para o periósteo. A pele e o tecido cutâneo foram extirpados com um bisturi, e o periósteo foi removido com um periosteal raspatory. Usando gaze umedecida com soro fisiológico estéril, aplicou-se pressão para parar o sangramento após a excisão. (C) rASC transplante de folha. Uma folha de rASC foi colocada sobre o defeito imediatamente acima do crânio do rato usando um par de pinças. (D-G) Ajuste rASC extensão de folha para coincidir com o tamanho da ferida. A folha rASC é flexível, ajustável e pode ser estendida a todos os cantos do local da ferida, usando um par de pinças. Para feridas mais largas, duas ou três folhas rASC flexíveis podem ser empilhadas. (H) sutura da pele artificial cobrindo a folha rASC. O defeito e a folha rASC transplantados estavam cobertos com pele artificial (15 x 10 mm2), que foi suturada com 10 pontos usando suturas de nylon 5-0. (eu) sutura do non-adesivo vestir (20 x 15 mm2) para o local da ferida coberta com pele artificial. Para proteger a ferida, o curativo não-adesivas (20 x 15 mm2) foi colocado sobre a pele artificial com suturas de nylon 5-0. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; com permissão. Diabetes (c) copyright (2015) pela Associação Americana de Diabetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens macroscópicas da cheio-espessura de pele defeitos. Defeitos de fotografias macroscópicas da cheio-espessura de pele sem o transplante de uma folha de rASC (A) e com o transplante de uma folha de rASC (B) 14 dias após a criação da ferida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os passos mais críticos para cultivo com sucesso uma folha rASC são as seguintes: 1) a temperatura deve ser mantida a aproximadamente 37 ° C durante o cultivo sobre os pratos de cultura temperatura-responsivo. Durante a criação de uma folha de rASC, cada procedimento foi realizado em um thermo-prato de 37 ° C, e cada reagente foi aquecido a 37 ° C, para impedir que as células espontaneamente desanexação do prato31. 2) os destinatários ratos ZDF devem ser monitorados para evitar a remoção do curativo não adesivas, que é crítico para o transplante bem sucedido de folhas rASC. Se o curativo é removido, um novo curativo não-adesivo deve ser aplicado para evitar que as folhas ASC transplantadas desanexação do local da ferida.
Usando este procedimento, rASC folhas geralmente obtiveram-se dentro de 5-7 dias de semeadura passagem 3 células em pratos de cultura temperatura-responsivo. O tempo de cultura necessário para gerar uma folha rASC pode ser ajustado de acordo com a densidade de pilha inicial e o tempo no qual o meio de cultura completo contendo AA é aplicado. Se uma folha de rASC separa o prato durante o cultivo de células, a rASC folha deve ser refeita, e pratos adicionais devem estar preparados no caso de destacamento de célula.
As limitações do presente protocolo são os seguintes: 1) gestão rigorosa de temperatura deve ser aplicado para manter uma temperatura aproximada de 37 ° C durante todo o processo, ao usar pratos de cultura temperatura-responsivo. 2) depois de obter uma folha rASC, dispositivos médicos especiais devem ser usados para manter condições húmidas, porque a folha rASC é sensível às condições de seca. 3) gestão pós-operatório, incluindo observação diária da condição do rato destinatário, é necessária.
Feridas maiores com osso exposto são frequentemente observadas clinicamente. Por exemplo, trauma de acidente de trânsito, queimaduras, feridas infectadas e feridas necróticas ou danificadas após desbridamento podem se desenvolver em grandes feridas com osso exposto. Aqui, foi desenvolvido um modelo clínico de feridas graves usando um defeito grande, espessura total da pele com o osso exposto em ratos com diabetes tipo 2 e obesidade. Este modelo tem o potencial para ser usado como um modelo padrão para avaliar a cicatrização de feridas em ratos diabéticos.
Pele artificial é um dispositivo médico disponível comercialmente para defeitos de pele de espessura total após desbridamento, e fator de crescimento recombinante de fibroblasto básico (bFGF) tem sido amplamente utilizada para a cura da ferida para promover a granulação e a angiogênese. Estes dois tratamentos têm sido utilizados para alcançar resultados terapêuticos consideráveis, mesmo para feridas crônicas, tais como feridas diabéticas. Tem sido relatado que a ASCs secretam fatores de crescimento angiogeneic28, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF) e bFGF, que poderia contribuir para neovascularização29,30 e acelerar a cicatrização de feridas. Nosso estudo anterior confirmou que ASCs secretam continuamente estes fatores de crescimento de31. Portanto, folhas ASC, combinadas com a pele artificial, têm o potencial para ser usado como uma nova opção terapêutica para acelerar a vascularização e31de cicatrização de feridas, e estas folhas podem ser aplicáveis ao tratamento de muitos tipos de úlceras intratáveis ou queimaduras em ambientes clínicos humanos no futuro.
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Disclosures
Os seguintes autores divulgar relações financeiras relevantes para esta publicação: Teruo Okano é fundador e diretor do Conselho da célula Seed Inc., que licencia a tecnologia e patentes da universidade médica de Tokyo feminino, e Teruo Okano e Masayuki Yamato são partes interessadas na Universidade de medicina de célula semente Inc. Tokyo feminino recebe fundos de pesquisa de célula semente Inc. Outros autores a declaram que não têm relações financeiras relevantes para essa publicação.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. Yukiko Koga do departamento de plástico e cirurgia reconstrutiva, Juntendo University School of Medicine, fornecendo conselhos práticos. Agradecemos também o Sr. Hidekazu Murata do centro de Tóquio diabéticas do Medical University School of Medicine para excelente suporte técnico. Este estudo foi suportado pela criação de centros de inovação para avançado programa de áreas de investigação interdisciplinar do projeto em desenvolvimento para sistemas de inovação "célula folha de tecido Engineering Center (CSTEC)" do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60 cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
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