Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

Published: September 15, 2016 doi: 10.3791/54543
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 1, 1
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

Protocol

1. تمييع المستضدات وتوليد مستضد ميكروأرس

  1. تمييع المستضدات في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. طباعة ما يصل إلى 162 مستضدات فريدة من نوعها في مكررة مع تكوين microarrayer مع 9 دبابيس. تشمل مفتش والغلوبولين المناعي المستضدات في المكتبة مستضد الضوابط الإيجابية. يشمل برنامج تلفزيوني فقط كوسيلة لمراقبة سلبية.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من كل مستضد لوحة مصدر جيدا 384. إضافة مستضدات لوحة مصدر في الجماعات التي تعكس الإعداد لرأس الطباعة (على سبيل المثال، وترتيب المستضدات في مجموعات من 9 عندما تستخدم 9 دبابيس للطباعة).
  3. لوحة الغلاف مصدر احباط وتجميد في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للطباعة المصفوفات.
  4. تنظيف دبابيس microarrayer الصلبة التي يحتضنها منهم في حمام sonicating مع الماء منزوع الأيونات لمدة 3 × 1 دقيقة. دبابيس مكان في الرف حتى يجف ثم ترتيب الدبابيس في رأس الطباعة ميكروأري. ل9 دبابيس، استخدام تكوين 3 × 3.
  5. microarrayer برنامج للطباعة تديرها وضع دبابيس الرقم على رأس الطباعة،عدد من الشرائح لطباعة، وعدد من منصات على كل شريحة، وعدد من البقع تكرار لكل مستضد. عادة، استخدم 9 دبابيس، 70 الشرائح، 2 منصات / الشرائح، و 2 البقع تكرار لكل مستضد. microarrayer برنامج ليصوتن المسامير في المياه بين مجموعات مختلفة من المستضدات.
  6. لوحة مصدر ذوبان الجليد ولوحة ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 100 × ز. وضع لوحة مصدر في بقعة معينة في microarrayer. إزالة قسم من رقائق أن تغطي المجموعة الأولى من مولدات المضادات التي سيتم طباعتها.
  7. ترتيب الشرائح غير مطبوع على سطح arrayer وبرنامج تشغيل الطباعة. طباعة الشرائح في RT مع الرطوبة وضعت على arrayer في 55-60٪ مع البناء في المرطب للآلة مجموعة.
  8. بعد طباعة كل مجموعة من المستضدات على كافة الشرائح، وقفة microarrayer. تغطية مولدات المضادات التي طبعت فقط مع رقائق (لمنع التبخر) وكشف المجموعة التالية من مولدات المضادات التي سيتم طباعتها. يواصل برنامج الطباعة.
  9. بعد وقد طبعت جميع مولدات المضادات، مصدر غطاء ررأكل مع قطعة جديدة من احباط وتجميد في -80 درجة مئوية. وضع الشرائح المطبوعة في مربع الشريحة وختم فراغ. ويمكن استخدام الشرائح في اليوم التالي أو بعد شهر واحد.

2. جس مستضد ميكروأرس مع المخفف سيرا

  1. وضع الشرائح في الإطارات باستخدام غرف الحضانة. إضافة 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة (2.5٪ [المجلد / المجلد] الجنين مصل العجل (FCS)، 0.1٪ [المجلد / المجلد] توين 20 في برنامج تلفزيوني) على كل سطح صفيف.
  2. وضع فيلم لاصقة أكثر من إطار وضعها في حاوية مغلقة مع قطعة من النسيج الرطب. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز.
  3. تمييع عينات مصل 1: 100 في عرقلة العازلة. نضح عرقلة الحل من المصفوفات وإضافة 500 ميكرولتر من العينة المخففة على كل سطح صفيف.
  4. مع تغطية فيلم لاصق واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع هزاز.
  5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة العازلة. للدراسات الإنسانية، وتمييع الأجسام المضادة مفتش و Cy3 المسمى الماعز مكافحة الإنسان إلى 0.33 ميكروغرام / مل وCy5 المسمى الماعز المضادة للهومان الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة إلى 0.25 ميكروغرام / مل. للدراسات الماوس، وتمييع لو Cy3 المسمى الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد إلى 0.38 ميكروغرام / مل وCy5 المسمى الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة إلى 0.7 ميكروغرام / مل.
  6. عينات نضح من المصفوفات وشطف السطوح مجموعة 4 مرات مع العازلة شطف (0.1٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني). صب العازلة على الشرائح ونفض الغبار قبالة بسرعة.
  7. إضافة 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة لغسل كل سطح مجموعة واحتضان 10 دقيقة في RT مع هزاز. كرر غسل خطوتين أكثر من مرة.
  8. إضافة 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على كل سطح الشريحة، وتغطي مع فيلم لاصق. احتضان 45 دقيقة على 4 درجات مئوية مع هزاز.
  9. نضح مزيج الأجسام المضادة الثانوية من الشرائح وشطف 4 مرات على النحو الوارد أعلاه. غسل الشرائح 3 مرات مع 700 ميكرولتر من عرقلة العازلة / التخفيف على النحو الوارد أعلاه.
  10. إزالة الشرائح من الإطارات وضعها في معدن الرف الشريحة التي هي مغمورة في برنامج تلفزيوني. احتضان 20 دقيقة في RT مع الهز المداري. وضع في حاوية جديدة من برنامج تلفزيوني واحتضان 20 م آخرفي مع اهتزاز.
  11. مكان رف الشريحة في حاوية من الماء منزوع الأيونات 15 ثانية. وضع رف في حاوية جديدة للمياه واحتضان 15 ثانية أخرى.
  12. على الشرائح الجافة، مكان الرف الشريحة على محول لوحة ELISA في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 220 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  13. وضع الشرائح في ضوء مربع محكم حتى على استعداد للمسح الضوئي.

3. المسح مستضد ميكروأرس وبيانات المصدرة لل

  1. الشرائح المسح الضوئي باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري التي يمكن الكشف عن و Cy3 Cy5 الإشارات الفلورسنت. من أجل ضبط أنبوب مضخم (PMT) مستويات الماسح الضوئي، قبل مسح الشريحة التي تم بحثها فقط مع الأجسام المضادة الثانوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا الانزلاق المكتبة مستضد كامل مطبوع عليها بما في ذلك إيجابيا (مفتش والغلوبولين المناعي)، وكذلك الضوابط سلبية (PBS). ما قبل الفحص الفحص منخفض القرار الذي يسمح للمستخدم بسرعة للعثور على إعدادات PMT المثلى.
  2. تعيين القيم PMT بحيث ملامح الإنسان مفتش (على قناة و Cy3) وهمهمةوميزات الغلوبولين المناعي (على قناة Cy5) لديها مماثلة متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية (MFI-B) (عادة 40000). يتم تعيين مستويات PMT عن طريق الضغط على زر "الأجهزة". مجموعة مرة واحدة، والحفاظ على هذه الإعدادات PMT ثابت.
  3. مسح الشرائح التجريبية على قناتين عن طريق الضغط على زر "مسح". حفظ الصور الشريحة (كل القنوات) بعد كل فحص.
  4. تحميل الشرائح ليتم تحليلها في البرنامج ميكروأري باستخدام زر "ملف".
  5. تحميل ملف قائمة مجموعة الجينات (GAL) باستخدام زر "ملف". الملف غال لديه تخطيط مجموعة مع هويات ميزات مجموعة.
  6. وضع قالب مجموعة فوق الصورة الممسوحة ضوئيا بحيث صفائف ميزات تطابق قالب قدر الإمكان.
  7. محاذاة الميزات في جميع الكتل مع القالب عن طريق الضغط على زر "محاذاة". هذا البرنامج سوف تجد عموما الخطوط العريضة لملامح الدائرية ولكن بعض التعديلات اليدوية التي قد تكون ضرورية. هذه التعديلات يمكن عن طريق إدخال وضع الميزة. يقوم البرنامج ثم حساب مؤسسات التمويل الأصغر-B لكل من المستضدات.
  8. استخدم زر "ملف" لتصدير هذه النتائج كملف نصي.

4. تحليل البيانات صفيف مع تحليل أهمية ميكروأرس (SAM)

  1. تحميل ملفات نصية الفردية في التفوق وتحديد الأعمدة التي لها مؤسسات التمويل الأصغر-B للقنوات و Cy3 Cy5.
  2. حساب متوسط ​​للميزات مكررة.
  3. للحصول على أي سلبي MFI-B، استبدل رقم سالب مع 10. تحويل البيانات من خلال تقسيم الخام MFI-B في 100 وبعد ذلك عن طريق حساب قاعدة سجل 2.
  4. تحليل البيانات المحولة سجل مع تحليل أهمية ميكروأرس (SAM) كما هو موضح سابقا 7.
  5. لدراسة استخدام مجموعتين (على سبيل المثال، من الاصحاء مقابل المرضى)، والتسمية مجموعة واحدة "1" ومجموعة "2." استخدام من الدرجة الثانية، تحليل أونبايريد في SAM لتحديد المستضدات نشاطية أن لياليمختلفة ignificantly بين المجموعتين (قيمة ف <0.05).
  6. استخدام تجميع وتوليد الحرارة خريطة البرامج لجعل الصور لعرضها 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم ترتيب المستضدات في لوحة جيدا 384 وطباعتها على الشرائح من قبل microarrayer الروبوتية كما هو مبين في الشكل رقم 1 يبين الشكل 2 شرائح توضع في الإطار مع غرف حضانة وشريحة فحصها بعد المعالجة. ويبين الشكل 3 الشرائح الموجبة والسالبة السيطرة. وسبرت الشريحة السلبية فقط مع الأجسام المضادة الثانوية، وحققت في الشرائح مراقبة إيجابية مع المصل من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية. باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية صفها كل على حدة، مفتش والغلوبولين المناعي نشاطية يمكن فصلها على سطح الشريحة نفس الشكل 4 يبين كثافة مضان من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي ضد الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) و IgG ضد الريباسي ف (ريبو P) على مدى واسع مجموعة من التخفيفات المصل. في هذه التجربة المصل السيطرة إيجابي من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية مع التفاعلات المعروفة ضد RIBO P تم استخدامها. لينويلاحظ ردود الأذن على قناة الغلوبولين المناعي على جميع التخفيفات المصل. ويلاحظ الردود الخطية على قناة مفتش تصل إلى MFI-B ما يقرب من 30000. بعد هذه النقطة، فإن الردود تبدأ لتشبع وزيادة في الأجسام المضادة لRIBO P لا تؤدي إلى زيادة مماثلة في مؤسسات التمويل الأصغر-B. ويوضح الشكل 5 كيف المصفوفات يمكن استخدامها للكشف عن عامل الروماتويد في مصل الدم البشري. في هذه الدراسة، تم استخدام مصل الدم من المريض مع التهاب الأوعية الدموية cryoglobulinemic مع عامل الروماتويد موثقة (الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي ضد مفتش) من 167 وحدة دولية / مل (عادي <11 وحدة دولية / مل). باستخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها، ويعتبر أي تفاعل الغلوبولين المناعي ضد مفتش التي رصدت على مجموعة. في المقابل، تم الكشف عن كبير الغلوبولين المناعي التفاعل (MFI-B ما يقرب من 5000) ضد مفتش عندما يتم بحثها الشريحة مع المصل من المريض مع عامل الروماتويد. ويبين الشكل (6) ووضع اللونين مستضد ميكروأري للاستخدام مع مصل الفأر. في هذا الرقم، ال الماوس الغلوبولين المناعيفي ورصدت على مجموعة يتم الكشف إلا عن طريق الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس الغلوبولين المناعي، ومفتش الماوس التي رصدت على اكتشاف مجموعة فقط من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس مفتش يبين الشكل 7 محاذاة شبكة قالب على الممسوحة ضوئيا مجموعة الصور باستخدام ميكروأري برامج التحليل. مرة واحدة وقد تم محاذاة ميزات مجموعة مع الشبكة، ويمكن تحليل الميزات مجموعة للحصول على متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية لكل ميزة.

شكل 1
توضع الشكل 1. جيل من Antigen ميكروأرس. المستضدات لأول مرة في لوحة مصدر. في لوحة مصدر هو مبين في الشكل، يتم ترتيب المستضدات في مجموعات من 9 مطابقة تخطيط 3 × 3 من دبابيس رأس الطباعة. ثم يتم وضع لوحة مصدر في microarrayer الروبوتية وبعد ذلك رصدت المستضدات على الشرائح. في هذا المثال، 2 وسادة الشرائح FAST عالبريد المستخدمة، مما يسمح للصفائف متطابقة أن رصدت على أسطح النيتروسليلوز 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
توضع الشكل 2. المعالجة من Antigen ميكروأرس. الشرائح في الإطارات بسرعة باستخدام غرف حضانة وتتم معالجة عن طريق إضافة عينات ومن ثم الأجسام المضادة الثانوية. وكشف نشاطية المستضد مع ماسح ضوئي قادر على اكتشاف إشارات الفلورسنت. يتم عرض الصورة الممسوحة ضوئيا من 2 وسادة شريحة سريعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3) <ر /> الشكل 3. اللونين مستضد ميكروأرس الأمثل للاستخدام مع سيرا الإنسان. تم الكشف عن (A) مفتش، الغلوبولين المناعي، ومفتش التيسير على مجموعة سبرت فقط مع الأجسام المضادة الثانوية. هذه المستضدات الثلاثة هي الضوابط الإيجابية لإظهار خصوصية الأجسام المضادة الثانوية. مضان أحمر (قناة الغلوبولين المناعي) يشير ملزم من الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الإنسان. مخضر (قناة مفتش) يشير ملزم للمفتش الأضداد الثانوية مكافحة الإنسان. مستضد مفتش التيسير أبيض بسبب oversaturation يتم اكتشاف (ب) العديد من المزيد من نشاطية على مجموعة بحث مع المصل السيطرة إيجابي من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية مع التفاعلات المعروفة لRIBO P المستضد. مربعات تشير إلى المواقع التي تم المحتشدة الحمض النووي وRIBO P المستضدات. (C) الكمي لشدة مضان في المصل السيطرة إيجابي يكشف أن غالبية نشاطية الأجسام المضادة ضد المستضدات الحمض النووي هي من الإيجM نمط إسوي. (D) الكمي لشدة مضان في المصل السيطرة إيجابي يكشف أن غالبية نشاطية الأجسام المضادة ضد المستضدات RIBO P هي من نمط إسوي مفتش. ورصدت ملامح مجموعة من نسختين وما يقرب من 500 ميكرون في القطر. وتشير الرسوم البيانية يعني ± SD لميزات مجموعة. dsDNA، وضعف الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. ssDNA، واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي. MFI-B، متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية؛ RIBO P، الريبوسومي P. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
ويظهر الشكل 4. الإسفار كثافة مقابل مصل التخفيف عامل. (A) MFI-B على نطاق واسع من التخفيفات مصل لالغلوبولين المناعي ضد ssDNA ومفتش ضد RIBO P. لهذهالتجارب، تم استخدام المصل السيطرة الإيجابي مع المعروف التفاعل مفتش ضد RIBO P وssDNA. مشبعة MFI-B بقيمة حوالي 65،000. (ب) Log2 تحويل البيانات MFI-B يكشف الردود الخطية على كل القنوات مفتش والغلوبولين المناعي على نطاق واسع من نشاطية المستضد. أكثر من مؤسسات التمويل الأصغر ب 30،000، تبدأ إشارة مفتش لتشبع ويفقد الخطي. تم رصد ملامح مجموعة في 6 مكررات. وتشير الرسوم البيانية يعني ± SD لميزات مجموعة. ssDNA، واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي. MFI-B، متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية؛ RIBO P، الريبوسومي P. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الكشف عن التهاب عامل مع اللونين مستضد ميكروأرس. (ب) صفيف بحث مع المصل من مريض مع التهاب الأوعية الدموية cryoglobulinemic مع عامل الروماتويد عالية. ميزة مفتش هي الأخضر والأصفر بسبب ملزم من الغلوبولين المناعي في مصل المريض ليجمد مفتش. ومن المثير للاهتمام، لديه هذا المريض أيضا الأجسام المضادة مفتش الحكومة ضد الغلوبولين المناعي كما تظهر ميزة الغلوبولين المناعي البرتقال. لديه مريض أيضا تاريخ من أمراض القلب الخلقية ويلاحظ أن تفاعل عالية إلى القلب بروتين التروبونين جيم (C) الكمي لمفتش والغلوبولين المناعي يتميز على مجموعة سبرت فقط مع الأجسام المضادة الثانوية يدل على أن الأجسام المضادة الثانوية لم يكن لديك أي تفاعلية متصالبة. (D) الكميمن ميزات مفتش والغلوبولين المناعي على مجموعة بحث مع مصل المريض يؤكد وجود عامل الروماتويد. ورصدت ملامح من نسختين وما يقرب من 500 ميكرون في القطر. وتشير الرسوم البيانية يعني ± SD لميزات مجموعة. MFI-B، متوسط ​​كثافة مضان ناقص الخلفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. تطوير صالحة اللونين إلى الملف الشخصي ماوس مصل الأجسام المضادة. سبر (A) صفيف فقط مع الأجسام المضادة الثانوية. يشير مضان أحمر ملزم من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس الغلوبولين المناعي. يشير مخضر ملزم من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس مفتش. تم الكشف عن مفتش الماوس التي رصدت على مجموعة فقط من قبل مكافحة مذكرة التفاهمحد ذاته مفتش الأضداد الثانوية، والماوس الغلوبولين المناعي الذي رصدت يتم الكشف إلا عن طريق الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس الغلوبولين المناعي. الميزات الأخرى على المصفوفات التي يتم الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة الثانوية هي الأجسام المضادة القبض على مفتش الماوس أو الفأرة الغلوبولين المناعي. (ب) صفيف بحث مع ماوس مفتش الأضداد وحيدة النسيلة ضد علامات الحامض الاميني. في هذه المجموعة، مستضد RIBO P (المؤتلف البروتين له الموسومة) هو أخضر، مشيرا إلى أن تم الكشف عن ذلك إلا عن طريق الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس مفتش. ومن المتوقع هذا بالنظر إلى أن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة هو من نمط إسوي مفتش. لم يتم الكشف عن مستضد RIBO P عندما حققت في المصفوفات مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها (المربع البرتقالي). (C) الكمي للمفتش، الغلوبولين المناعي، وRIBO P يتميز على مجموعة بحث مع الماوس مفتش وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد علامات الحامض الاميني. ورصدت ملامح مجموعة في ستة مكررات وما يقرب من 500 ميكرون في القطر. وتشير الرسوم البيانية يعني ± SD لميزات مجموعة. MFI-B، متوسط ​​فلورescence شدة ناقص الخلفية؛ RIBO P، الريبوسومي P. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. محاذاة من الشبكة قالب على صورة صفيف. في هذه الصورة، وشبكة القالب الذي تم إنشاؤه من ملف غال، وتتماشى مع ميكروأري المستضد التي سبق مسحها ضوئيا. تم بحثها في مجموعة مع المصل من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية واضطراب تخثر الدم الذي كان العديد من نشاطية الأجسام المضادة. مخضر يمثل ملزمة من الأجسام المضادة ومضان أحمر يمثل ملزمة من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي. الميزات المطبوعة بواسطة المسامير الصلبة هي شبه الدائرية وبسهولة حددت من قبل البرنامج ميكروأري (Genepix). مرة واحدة في محاذاة شبكة كاملة، وسوفتواريه يمكن أن يحسب كثافة مضان متوسط ​​ناقص الخلفية (على كل القنوات و Cy3 Cy5) لكل من ميزات مجموعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول صفها هنا يسمح لتقدير حجم الأجسام المضادة باستخدام تقنية مستضد ميكروأري. ميكروأرس المستضد توفر العديد من المزايا ELISA التقليدية في الكشف عن الأجسام المضادة. أولا وقبل كل شيء، مجموعة متنوعة من مولدات المضادات بما في ذلك الأحماض النووية والبروتينات والببتيدات، ولست] خلية يمكن المحتشدة على الشرائح المغلفة النيتروسليلوز، وبالتالي السماح للفحص المضاعفة من الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، ميكروغرام فقط من المستضد ضرورية لتوليد صفائف منذ ورصدت nanoliters المستضد على كل شريحة. تتطلب صفائف أيضا القليل جدا من عينة المريض، كما هو مطلوب فقط 5 ميكرولتر من الدم لفحص سطح مجموعة في 1: عينة التخفيف 100. وأخيرا، رصدت صفائف على النيتروسليلوز وقد ثبت أن تكون أكثر حساسية من ELISA التقليدية في الكشف عن الأجسام المضادة 9.

بالإضافة إلى استخدام ميكروأرس المستضد للكشف عن الأجسام المضادة، يمكن أن يكون استخدام المصفوفاتد للكشف عن القابلية للتفاعل ضد بروتينات غير المتمتعة بالحكم الذاتي (على سبيل المثال، والبروتينات الفيروسية)، لتحديد خصوصية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وقياس مستويات الأجسام المضادة غير HLA في زرع كما هو موضح سابقا 12/09. ويمكن أيضا المجهرية مستضد أن تستخدم لإجراء تجارب رسم خرائط حاتمة مفصلة حيث المحتشدة الببتيدات متداخلة من بروتين واحد على شريحة. واستخدمت الدراسة الأخيرة هذا النهج لتحديد الحواتم من البروتين U1-70K التي هي أهداف الأجسام المضادة في الذئبة الحمامية الجهازية (13).

باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، والكشف عن مفتش والغلوبولين المناعي نشاطية خطي على نطاق واسع من التخفيفات المصل. وأجريت هذه الدراسات باستخدام المصل السيطرة إيجابي من المريض مع الذئبة الحمامية الجهازية مع التفاعلات المعروفة لمستضد الريباسي ف وssDNA. الغلوبولين المناعي التفاعل إلى ssDNA غير الخطية في التخفيفات مصل 1: 125-1: 32،000، المقابلة لمؤسسات التمويل الأصغر-B من 17000 إلى 50. مفتش التفاعل لRIBO P غير الخطية في التخفيفات المصل من 1: 4000 إلى 1: 512،000، المقابلة لمؤسسات التمويل الأصغر-B من 32000 إلى 200. وفي التخفيفات أقل من 1: 4000 (وMFI-B أكبر من 32،000)، ومنحنى الكشف عن يسطح التفاعل مفتش ولم يعد الخطية. في العمل مع متلقي زرع القلب، ويخفف المصل بشكل روتيني إلى 1: 100 كما MFI-B لمستضدات نادرا ما يتجاوز 10000 في هذا التخفيف. للدراسات مع المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية مع الأجسام المضادة عالية عيار، قد تحتاج عينات المرضى إلى أن تضعف أيضا بضمان أن غالبية نشاطية الأجسام المضادة تقع ضمن مجموعة خطية من الفحص.

في حين MFI-B يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة نشاطية الأجسام المضادة بين مجموعات من المرضى، قد يكون من المفيد أيضا لتحويل هذه القيمة إلى قياس كمي لمستويات الأجسام المضادة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الكشف متعددة المعروف التخفيفات من مفتش المنقى والغلوبولين المناعي على الشرائح لتوليد منحنى القياسية. باستخدام هذا المنحنى، يمكن أن مؤسسات التمويل الأصغر-B ثم تكون العابرشكلت في مستوى الأجسام المضادة لكل مستضد.

في بروتوكول المعروضة هنا، تم استخدام 2 وسادة الشرائح المغلفة النيتروسليلوز. على هذه الشرائح، واثنين من صفائف متطابقة، والتي يمكن بحثها مع اثنين من عينات مصل منفصلة، ​​تطبع على كل شريحة. وهذا يسمح عينتين من نفس المريض (مثل قبل وبعد العلاج) ليتم مقارنتها على نفس الشريحة، مما يقلل تقلب interslide. تتم معالجة اثنين وثلاثين الشرائح مع 64 عينات من المرضى الفردية بشكل روتيني في نفس الوقت في يوم واحد. تتم طباعة مجموعة أحدث مع 9 دبابيس، والسماح ل162 المستضدات التي سيتم طباعتها في نسختين (كل دبوس يطبع subarray 36 ميزة أي ما يعادل 18 المستضدات مطبوعة في نسختين).

طبعت ميكروأرس مستضد ولدت في هذا البروتوكول مع دبابيس microarrayer الصلبة. طباعة مع دبابيس الصلبة هي أكثر استهلاكا للوقت من الطباعة مع دبابيس أسلوب ريشة منذ microarrayer يجب إعادة تراجع إلى لوحة المصدر بعد كل رIME أن المسامير تلمس سطح الشريحة. تم استخدام المسامير الصلبة لأنها تنتج استنساخه للغاية، شبه الدائرية ميزات مجموعة (حوالي 500 ميكرون في القطر). هذه الميزات يمكن اكتشافه بسهولة وحددت من قبل برنامج الماسح الضوئي، وهناك حاجة إلى دليل التسويات الحد الأدنى لتحديد ملامح مجموعة. دبابيس الصلبة تسمح أيضا لللست] الخلية التي سيتم طباعتها، والتي قد يكون من الصعب طباعة مع دبابيس ريشة بسبب اللزوجة العالي. نظرا لمرات الطباعة طويلة تشارك مع دبابيس الصلبة (في بعض الأحيان 10-11 ساعة لطباعة 70 شرائح)، وتغطي مولدات المضادات التي لم يتم طباعتها في لوحة مصدر احباط لمنع التبخر.

يعرض بروتوكول صفها هنا طريقة لفصل مفتش والغلوبولين المناعي نشاطية على سطح الشريحة نفسها. وقد تم تحسين المصفوفات للكشف عن الأجسام المضادة على حد سواء الإنسان والفأر باستخدام زوج من الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع fluorophores مختلفة. الحرجة لهذا النهج اللونين يتم تحديد سكالأجسام المضادة ndary التي هي محددة لأي مفتش أو الغلوبولين المناعي isotypes للغاية. الأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم تعترف جزء التيسير للمفتش أو IgM و لا عبر تتفاعل مع بعضها البعض. فصل إشارات مفتش والغلوبولين المناعي أمر هام نظرا لوظائف مختلفة من هذه الأجسام المضادة في الاستجابة المناعية. على سبيل المثال، يتم إنتاج الغلوبولين المناعي عند مستويات أعلى من الخلايا B1 و هو عادة ما يكون علامة على استجابة مناعية في وقت مبكر. من ناحية أخرى، مفتش هو علامة على استجابة مناعية لاحقة، الذي يتطور نتيجة الطبقة تبديل 14. عن طريق الكشف عن إشارات مفتش والغلوبولين المناعي على حدة، فمن الممكن أيضا لتحديد عامل الروماتويد الغلوبولين المناعي في عينات المرضى (أي الغلوبولين المناعي المناعية التي تربط لمفتش التي رصدت على مجموعة). قبل اكتشاف أجزاء مختلفة من الأجسام المضادة (على سبيل المثال، التيسير مقابل فاب)، ملزمة للعامل الروماتويد لمختلف الحواتم الأجسام المضادة مفتش يمكن قياسها كميا. مع توافر الماسحات الضوئية مع أكثر من عقدين من أشعة الليزر، والثانية إضافيةويمكن إضافة الأجسام المضادة آرى إلى الزوج الضد الثانوية الحالي لتحديد ملزمة ايغا، الجمعية الإسلامية أو فريق الخبراء الحكومي الدولي الأجسام المضادة. ويمكن أيضا أن يتم تحديد الأجسام المضادة الثانوية التي من شأنها أن تسمح لتحديد الفئات الفرعية مفتش منفصلة (IgG1، IgG2، IgG3، IgG4) ملزمة لمولدات المضادات في مجموعة واحدة.

في الختام، تقنية مستضد ميكروأري هي تقنية قوية السماح لتوصيف الإنتاجية العالية من الأجسام المضادة في مصل الدم. هذا الأسلوب هو غاية للتخصيص والحساسة. وقد تم تحسين نظام الكشف على الفلورسنت للدراسات كل من الإنسان والفأر، ويسمح للكشف في وقت واحد مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 115، مستضد ميكروأري، الأجسام المضادة، والأجسام المضادة غير HLA، البروتينات، مضان، المناعية مفتش / الغلوبولين المناعي، ورسم خرائط حاتمة
جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y.,… More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter