Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. dilution Antigènes Generating Antigène Microarrays

  1. Diluer les antigènes dans du PBS à une concentration finale de 0,2 mg / ml. Imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double avec une configuration de puces à ADN de 9 broches. Inclure des IgG et IgM antigènes présents dans la banque d'antigène comme témoins positifs. Inclure PBS seulement comme un contrôle négatif.
  2. Ajouter 20 pi de chaque antigène au puits plaque source 384. Ajouter des antigènes à la plaque de source dans des groupes qui reflètent la configuration de la tête d' impression (par exemple, disposer d' antigènes dans des groupes de 9 quand 9 broches sont utilisées pour l' impression).
  3. Plaque de source avec une feuille et le gel à -80 ° C jusqu'à ce que prêt à imprimer des tableaux.
  4. Nettoyer les repères de la microarrayer solides en les incubant dans un bain de sonication avec de l'eau déminéralisée pendant 3 x 1 min. La place des broches dans le rack à sécher et ensuite organiser des épingles dans microarray tête d'impression. Pour 9 broches, utilisez une configuration 3 x 3.
  5. microarrayer de programme pour le tirage en réglant les repères de numéro sur la tête d'impression,nombre de diapositives à imprimer, le nombre de plaquettes sur chaque diapositive, et le nombre de taches réplicats pour chaque antigène. En règle générale, utiliser 9 broches, 70 diapositives, 2 pads / slide, et 2 spots réplicats pour chaque antigène. microarrayer du programme à Soniquer épingles dans l'eau entre les différents groupes d'antigènes.
  6. plaque source Thaw et la plaque puis centrifuger pendant 1 min à 100 x g. Placer la plaque de source endroit désigné dans microarrayer. Retirer la partie de la feuille qui recouvre le premier groupe d'antigènes à imprimer.
  7. Disposer les diapositives non imprimées sur la surface de arrayer et l'exécution du programme d'impression. Imprimer des diapositives à la température ambiante avec une humidité réglées sur le arrayer à 55 - 60% avec la construction dans l'humidificateur de la machine à matrice.
  8. Après chaque groupe d'antigènes est imprimé sur toutes les diapositives, mettre en pause le microarrayer. Couvrir les antigènes qui ont été simplement imprimées avec du papier (pour éviter l'évaporation) et de découvrir le prochain groupe d'antigènes à imprimer. Poursuivre le programme d'impression.
  9. Après tous les antigènes ont été imprimés, source de couverture plmangé avec le nouveau morceau de papier et le gel à -80 ° C. Placez les diapositives imprimées dans la boîte coulissante et joint à vide. Les lames peuvent être utilisés le lendemain ou jusqu'à un mois plus tard.

2. Sonder Antigène Microarrays avec Dilué Sera

  1. Placez les diapositives dans des cadres à l'aide de chambres d'incubation. Ajouter 700 pi de tampon de blocage (2,5% [vol / vol] fœtal de sérum de veau (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 dans du PBS) à chaque surface de la matrice.
  2. Placez un film adhésif sur le cadre et le placer dans un récipient hermétique avec un morceau de tissu humide. Incuber O / N à 4 ° C sur une bascule.
  3. Diluer les échantillons de sérum 1: 100 dans un tampon de blocage. Aspirer la solution de blocage de tableaux et ajouter 500 ul d'échantillon dilué dans chaque surface de la matrice.
  4. Couvrir avec un film adhésif et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec balancement.
  5. Diluer Anticorps secondaires dans un tampon de blocage. Pour les études sur l'homme, on dilue un anticorps IgG de chèvre marqué au Cy3 antihumain à 0,33 pg / ml et une Cy5 de chèvre marqué anti human IgM à 0,25 ug / ml. Pour les études sur la souris, diluer une Cy3 de chèvre marqué à l'anticorps anti-IgG de souris à 0,38 pg / ml et un anticorps marqué par Cy5 IgM anti-souris de chèvre à 0,7 pg / ml.
  6. Aspirer échantillons à partir des tableaux et rincer les surfaces du tableau 4 fois avec un tampon de rinçage (0,1% de Tween 20 dans du PBS). Verser le tampon sur des diapositives et feuilleter rapidement.
  7. Ajouter 700 pi de tampon de blocage pour laver chaque surface de la matrice et incuber 10 min à température ambiante avec bascule. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
  8. Ajouter 500 pi d'anticorps secondaire dilué dans chaque surface de glissement et couvrir avec un film adhésif. Incuber 45 min à 4 ° C avec balancement.
  9. Aspirer mélange secondaire d'anticorps à partir de diapositives et rincer 4 fois comme ci-dessus. Laver les lames 3 fois avec 700 pi de tampon de blocage / de dilution comme ci-dessus.
  10. Retirer les lames de cadres et les placer dans la grille coulissante métallique qui est immergé dans du PBS. Incuber 20 min à température ambiante avec agitation orbitale. Placer dans le nouveau conteneur de PBS et incuber une autre 20 mavec agitation.
  11. Placer la grille coulissante dans un récipient d'eau désionisée 15 sec. Placer la grille dans un nouveau récipient d'eau et incuber une autre 15 sec.
  12. Pour diapositives sèches, lieu glisser la grille sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et de spin à 220 g pendant 5 min à température ambiante.
  13. Placez les diapositives dans une boîte étanche à la lumière jusqu'au moment de la numérisation.

3. Numérisation Antigène Microarrays et exportation de données

  1. Numériser diapositives à l'aide d'un scanner de puces à ADN permettant de détecter des signaux fluorescents Cy3 et Cy5. Afin d'ajuster les niveaux tube photomultiplicateur (PMT) du scanner, pré-numériser une diapositive qui n'a été sondé avec des anticorps secondaires.
    Note: Cette diapositive doit avoir la bibliothèque de l'antigène complet imprimé sur elle, y compris positive (IgG et IgM) et négatifs (PBS) contrôles. Le pré-scan est un balayage à basse résolution qui permet à l'utilisateur de trouver rapidement les réglages optimaux PMT.
  2. Définissez les valeurs PMT de sorte que les traits humains IgG (sur le canal Cy3) et le bourdonnementune des caractéristiques IgM (sur le canal Cy5) ont une même intensité de fluorescence médiane moins arrière-plan (MFI B), (typiquement 40 000). Les niveaux PMT sont réglés en appuyant sur le bouton "hardware". Une fois réglée, conserver ces paramètres de PMT constant.
  3. Numérisez les diapositives expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton "scan". Enregistrez les images de diapositives (les deux canaux) après chaque balayage.
  4. Chargez la diapositive à analyser dans le logiciel de microréseaux en utilisant le bouton "fichier".
  5. Chargez la liste de réseaux de gènes (GAL) fichier en utilisant le bouton "fichier". Le fichier GAL a la mise en page du tableau avec les identités des caractéristiques du tableau.
  6. Placez le gabarit de tableau sur l'image numérisée de telle sorte que les tableaux caractéristiques correspondent aussi étroitement le modèle que possible.
  7. Alignez fonctionnalités dans tous les blocs avec le modèle en appuyant sur le bouton "align". Le programme trouvera généralement les grandes lignes des caractéristiques circulaires mais certains réglages manuels peut être nécessaire. Ces ajustements peuvent être faits en entrant dans le mode de fonction. Le logiciel calcule ensuite un MFI B pour chacun des antigènes.
  8. Utilisez le bouton "Fichier" pour exporter ces résultats sous forme de fichier texte.

4. Les données Analyse de tableau avec l'analyse de signification de Microarrays (SAM)

  1. Charger des fichiers texte individuels dans Excel et d'identifier les colonnes qui ont MFI-B pour les canaux Cy3 et Cy5.
  2. Calculer la moyenne pour les fonctions en double.
  3. Pour toute négative MFI-B, remplacer le nombre négatif avec 10. Transformer les données en divisant brutes MFI-B par 100 et puis en calculant log base 2.
  4. Analyser journal des données transformées avec l' analyse de signification de Microarrays (SAM) comme décrit précédemment 7.
  5. Pour une étude utilisant deux groupes (par exemple, des contrôles sains contre patients), l' étiquette d' un groupe "1" et le groupe "2." Utilisez un bi-classe, l'analyse apparié dans SAM pour identifier les antigènes réactivités qui sont significantly différente entre les deux groupes (valeur de q <0,05).
  6. Utilisez le regroupement et la chaleur carte de génération de logiciels pour faire des images pour la présentation 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les antigènes sont disposés dans une plaque à 384 puits et imprimés sur des lames par un microarrayer robotisé comme représenté sur la figure 1. La figure 2 montre des diapositives placées dans un cadre avec des chambres d'incubation et d' une lame numérisée après traitement. La figure 3 montre des lames de contrôle positif et négatif. La diapositive négative est seulement sondé avec des anticorps secondaires, et la lame de contrôle positif est sondé avec le sérum d'un patient souffrant d'un lupus érythémateux systémique. En utilisant deux anticorps secondaires marqués séparément, IgG et IgM réactivités peuvent être séparés sur la même surface de glissement. La figure 4 montre l' intensité de fluorescence des anticorps IgM dirigés contre l' ADN simple brin (ADNsb) et d' IgG d' anticorps contre ribosomal P (Ribo P) sur une large gamme de dilutions de sérum. Dans cette expérience, le sérum de contrôle positif d'un patient avec le lupus érythémateux systémique avec une réactivité connue contre Ribo P a été utilisé. Linles réponses de l'oreille sont observées sur le canal IgM sur toutes les dilutions de sérum. réponses linéaires sont observées sur le canal IgG jusqu'à un MFI-B d'environ 30.000. Après ce point, les réponses commencent à saturer et l' augmentation des anticorps à Ribo P ne conduisent pas à une augmentation correspondante de MFI-B. Figure 5 montre comment les tableaux peuvent être utilisés pour détecter le facteur rhumatoïde dans le sérum humain. Dans cette étude, le sérum d'un patient souffrant vascularite cryoglobulinémique avec un facteur rhumatoïde documenté (anticorps IgM dirigés contre les IgG) de 167 IU / ml (normale <11 IU / ml) a été utilisé. En utilisant des anticorps secondaires seul, aucune réactivité IgM est perçue contre l'IgG qui est repéré sur le réseau. En revanche, la réactivité IgM significative (MFI B d'environ 5000) est détectée contre l' IgG lorsque le tiroir est sondé avec du sérum provenant du patient avec le facteur rhumatoïde. La figure 6 montre l'évolution des deux couleurs antigène puces à ADN pour une utilisation avec du sérum de souris. Dans cette figure, e IgM de sourisat est repéré sur la matrice est seulement détecté par l'anticorps secondaire anti-souris IgM et IgG de souris qui est repéré sur le réseau ne peut être détectée par l'anticorps secondaire anti-IgG de souris. La figure alignement 7 montre une grille de modèle sur une scannée image tableau en utilisant un logiciel d'analyse des microréseaux. Une fois les caractéristiques du tableau ont été alignées sur la grille, les caractéristiques du tableau peuvent être analysées pour obtenir médiane intensité de la fluorescence moins arrière-plan pour chaque fonction.

Figure 1
Figure 1. Génération d'antigène Microarrays. Les antigènes sont d' abord placés dans la plaque de la source. Dans la plaque de source indiqué sur la figure, les antigènes sont disposés en groupes de 9, ce qui correspond au 3 x 3 la disposition des broches de tête d'impression. La plaque de source est ensuite placé dans le microarrayer robotique et les antigènes sont ensuite repéré sur les lames. Dans cet exemple, 2-pad diapositives FAST are utilisé, ce qui permet pour les tableaux identiques à être repéré sur les 2 surfaces de nitrocellulose. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Traitement de l' antigène Microarrays. Slides sont placés dans des cadres FAST en utilisant des chambres d'incubation et sont traitées en ajoutant des échantillons puis des anticorps secondaires. réactivités Antigen sont révélés avec un scanner capable de détecter des signaux fluorescents. L'image numérisée d'une diapositive FAST 2-pad est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 <br /> Figure 3. Deux couleurs Antigène Microarrays Optimisé pour une utilisation avec des sérums humains. (A) IgG, IgM et IgG Fc sont détectés sur le réseau sondé avec des anticorps secondaires seulement. Ces trois antigènes sont les témoins positifs pour montrer la spécificité des anticorps secondaires. la fluorescence rouge (canal IgM) indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgM humaine. fluorescence verte (canal IgG) indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgG humaine. L'antigène IgG Fc est blanche due à la sursaturation. (B) Beaucoup plus de réactivités sont détectés sur le réseau sondé avec du sérum de contrôle positif d'un patient avec le lupus érythémateux systémique avec une réactivité connue à Ribo P antigène. Les cases indiquent les endroits où l' ADN et Ribo P antigènes ont été disposés. (C) La quantification des intensités de fluorescence dans le sérum témoin positif révèle que la majorité des réactivités des anticorps dirigés contre des antigènes d'ADN sont des IgM isotype (D) . La quantification des intensités de fluorescence dans le sérum témoin positif révèle que la majorité des réactivités d'anticorps contre les antigènes Ribo P sont de l'isotype IgG. caractéristiques de tableau sont repérés en double exemplaire et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. dsDNA, ADN double brin; ADNss, ADN simple brin; MFI-B, médiane intensité de la fluorescence moins fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Fluorescence Intensity vs Sérum Facteur de dilution. (A) MFI-B sur une large gamme de dilutions de sérum est indiquée pour IgM contre ADNss et IgG contre Ribo P. Pour cesexpériences, sérum de contrôle positif avec la réactivité connue IgG contre Ribo P et ADNss a été utilisé. MFI B est saturé à une valeur d'environ 65.000. (B) Log2 transformation des données MFI-B révèle des réponses linéaires sur les deux canaux IgG et IgM sur une large gamme de réactivités d'antigène. Plus d'un MFI B de 30.000, le signal IgG commence à saturer et perd la linéarité. caractéristiques de tableaux ont été repérés en 6 répétitions. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. ADNss, ADN simple brin; MFI-B, médiane intensité de la fluorescence moins fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Détection de facteur rhumatoïde avec deux couleurs Antigène Microarrays. (B) Tableau sondé avec du sérum d'un patient avec vascularite cryoglobulinémique avec un facteur rhumatoïde élevé. La caractéristique IgG est vert-jaune due à la liaison de l'IgM dans le sérum du patient immobilisé IgG. Fait intéressant, ce patient a également des anticorps IgG dirigés contre IgM comme la caractéristique IgM apparaît orange. Le patient a aussi une histoire de maladie cardiaque congénitale et est noté pour avoir une réactivité élevée à la troponine cardiaque de la protéine C. (C) Quantification de l'IgG et IgM dispose sur le réseau sondé seulement avec des anticorps secondaires montre que les anticorps secondaires ne sont pas toute réactivité croisée. (D) Quantificationdes caractéristiques IgG et IgM sur la matrice sondées avec le sérum du patient confirme la présence du facteur rhumatoïde. Caractéristiques sont repérés en double exemplaire et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. MFI-B, médiane intensité de fluorescence moins de fond. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Développement des Tableaux à deux couleurs au profil de la souris anticorps sériques. (A) Tableau sondée seulement avec des anticorps secondaires. la fluorescence rouge indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgM de souris. la fluorescence verte indique que la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris. L'IgG de souris qui est repéré sur le réseau est détecté uniquement par l'anti-mouse IgG d'anticorps secondaire, et l'IgM de souris qui est repéré est détectée seulement par l'anticorps secondaire anti-IgM de souris. Les autres caractéristiques sur les réseaux qui sont détectés par les anticorps secondaires sont des anticorps de capture contre IgG de souris ou IgM de souris (B) . Tableau sondé avec un anticorps IgG monoclonal de souris contre les étiquettes histidine. Sur ce tableau, l'antigène Ribo P (protéine recombinante marquée par His) est vert, ce qui indique qu'il est seulement détecté par l'anticorps secondaire IgG anti-souris. Ceci est attendu étant donné que l'anticorps monoclonal est de l'isotype IgG. L'antigène Ribo P n'a pas été détectée lorsque les matrices sont sondées avec un anticorps secondaire seul (boîte orange). (C) La quantification de l' IgG, IgM et Ribo P dispose sur le réseau sondé avec un anticorps monoclonal IgG de souris contre les étiquettes histidine. caractéristiques de tableau sont repérés dans six répétitions et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. MFI-B, médiane Fluorescence intensité moins de fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Alignement d'un modèle de grille sur un tableau image. Dans cette capture d' écran, une grille de modèle, qui a été généré à partir d' un fichier de gal, a été aligné avec un antigène microarray préalablement numérisé. La matrice a été sondé avec du sérum d'un patient souffrant de lupus érythémateux aigu disséminé et un trouble de la coagulation sanguine qui avait beaucoup réactivités autoanticorps. fluorescence verte représente la liaison des anticorps IgG et la fluorescence rouge représente la liaison des anticorps IgM. Les caractéristiques imprimées par des broches pleines sont à peu près circulaire et sont facilement définis par le logiciel de puces à ADN (Genepix). Une fois l'alignement de la grille est terminée, le software peut calculer l'intensité de fluorescence moyenne moins de fond (sur les deux canaux Cy3 et Cy5) pour chacune des fonctions de tableau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le protocole décrit ici permet la quantification d'auto-anticorps en utilisant la technique des puces à ADN antigène. microréseaux d'antigènes offrent plusieurs avantages par rapport à ELISA classique dans le dépistage des auto-anticorps. Tout d'abord, une variété d'antigènes, y compris des acides nucléiques, des protéines, des peptides, et les lysats cellulaires peuvent être revêtus sur les lames de nitrocellulose revêtu, permettant ainsi de criblage d'auto-anticorps multiplexé. En outre, seuls microgrammes d'antigène sont nécessaires pour générer les tableaux depuis nanolitres d'antigène sont déposés sur chaque diapositive. Les réseaux exigent également très peu de l'échantillon du patient, car seulement 5 pi de sérum est nécessaire pour sonder une surface de matrice à un 1: dilution de l'échantillon 100. Enfin, les tableaux déposés sur nitrocellulose ont été montré pour être plus sensible que ELISA classique au dépistage des autoanticorps 9.

Outre l'utilisation de microréseaux d'antigènes à l'écran pour autoanticorps, les tableaux peuvent être utiliserd pour détecter la réactivité contre les protéines non-soi (par exemple des protéines virales), pour définir la spécificité des anticorps monoclonaux, et de mesurer le taux d'anticorps non-HLA en transplantation , comme décrit précédemment 12/09. microréseaux d'antigènes peuvent également être utilisés pour effectuer des épitopes détaillée des expériences de cartographie où peptides chevauchants d'une seule protéine sont disposées sur une lame. Une étude récente a utilisé cette approche pour définir des epitopes de la protéine U1-70K qui sont des cibles d'auto - anticorps dans le 13 lupus érythémateux disséminé.

En utilisant le protocole décrit ici, la détection des IgG et IgM réactivités est linéaire sur une large gamme de dilutions de sérum. Ces études ont été réalisées en utilisant du sérum de contrôle positif d'un patient avec le lupus érythémateux systémique avec une réactivité connue à ribosomal P antigène et ADNss. la réactivité IgM à ADNsb est linéaire à des dilutions de sérum de 1: 125-1: 32.000, correspondant à MFI-B de 17 000 à 50. IgG réactivitéRibo P est linéaire à des dilutions de sérum de 1: 4000 à 1: 512 000, correspondant au MFI B de 32,000 à 200. A des dilutions inférieures à 1: 4000 (MFI B supérieur à 32000), la courbe de détection des IgG aplatit la réactivité et est plus linéaire. Dans le travail avec les transplantés cardiaques, le sérum est régulièrement dilué à 1: 100 comme MFI-B pour les antigènes dépasse rarement 10 000 à cette dilution. Pour les études avec des patients souffrant d'une maladie auto-immune avec des auto-anticorps à titre élevé, peuvent nécessiter des échantillons de patients à diluer davantage pour s'assurer que la majorité des réactivités autoanticorps tombent dans la plage linéaire du dosage.

Alors que MFI B peut être utile de comparer les réactivités auto-anticorps entre les groupes de patients, il peut également être utile pour convertir cette valeur dans une mesure plus quantitative des niveaux d'auto-anticorps. Ceci peut être accompli grâce à la détection de multiples dilutions connues d'IgG et d'IgM purifiée sur les lames pour générer une courbe standard. En utilisant cette courbe, MFI-B peut alors être transformé dans un niveau d'auto-anticorps pour chaque antigène.

Dans le protocole présenté ici, les diapositives de nitrocellulose revêtu 2-pad ont été utilisés. Sur ces glissières, deux ensembles identiques, qui peuvent être sondées avec deux échantillons de sérum distincts sont imprimés sur chaque lame. Cela permet à deux échantillons provenant du même patient (tel que pré- et post-traitement) à comparer sur la même lame, ce qui réduit au minimum la variabilité INTERSLIDE. Trente-deux lames avec 64 échantillons de patients individuels sont habituellement traitées en même temps en une seule journée. La gamme la plus courante est imprimée avec 9 broches, permettant 162 antigènes à imprimer en double exemplaire (chaque broche imprime un sous-réseau 36 caractéristique qui est égale à 18 antigènes imprimés en double exemplaire).

Les microréseaux d'antigènes générés dans ce protocole ont été imprimées avec des épingles de microarrayer solides. Impression avec des épingles solides est plus longue que l'impression avec des épingles de style plume depuis le microarrayer doit re-plonger dans la plaque source après chaque tIme que les broches touchent la surface de glissement. goupilles solides ont été utilisés car ils produisent hautement reproductibles, les caractéristiques de réseau presque circulaires (environ 500 pm de diamètre). Ces fonctionnalités peuvent être facilement détectées et décrites par le logiciel du scanner et des réglages manuels minimales sont nécessaires pour quantifier les caractéristiques du tableau. goupilles solides permettent également de lysats de cellules à imprimer, qui peut être difficile à imprimer avec les repères de la cannette en raison de leur viscosité élevée. En raison des temps d'impression longues impliquées avec des épingles solides (parfois 10 - 11 h 70 pour imprimer des diapositives), des antigènes qui ne sont pas imprimées dans la plaque source sont recouverts de papier d'aluminium pour éviter l'évaporation.

Le protocole décrit ici présente une méthode pour séparer les réactivités IgG et IgM sur la même surface de glissement. Les tableaux ont été optimisés pour dépister les anticorps humains et de souris à l'aide de paires d'anticorps secondaires marqués avec des fluorophores différents. Critique de cette approche en deux couleurs est d'identifier secoanticorps Ndary qui sont hautement spécifiques pour soit isotypes IgG ou IgM. Les anticorps secondaires utilisés reconnaissent la partie Fc des IgG ou des IgM et ne sont pas de réaction croisée avec l'autre. La séparation des signaux IgG et IgM est important étant donné les différentes fonctions de ces anticorps dans les réponses immunitaires. Par exemple, l'IgM est produite à des niveaux plus élevés par les cellules B1 et est typiquement un marqueur d'une réponse immunitaire précoce. D'autre part, l' IgG est un marqueur d'une réponse immunitaire par la suite, qui se développe à la suite de la commutation de classe 14. En détectant les signaux d' IgG et d' IgM séparément, il est également possible d'identifier des facteurs rhumatoïdes d' IgM dans les échantillons de patients ( par exemple, des immunoglobulines IgM qui se lient à l' IgG qui a été repéré sur la matrice). En repérant les différentes parties d'anticorps (par exemple, Fc contre Fab), la liaison du facteur rhumatoïde à différents épitopes d'anticorps IgG peut être quantifiée. Avec la disponibilité de lecteurs avec plus de deux lasers, le deuxième supplémentaireary anticorps peuvent être ajoutés à la paire d'anticorps secondaire de courant pour identifier la liaison des anticorps IgA, IgD ou IgE. Les anticorps secondaires pourraient également être identifiés qui permettrait l'identification des sous-classes d'IgG séparées (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) liés à des antigènes sur une seule matrice.

En conclusion, la technique de l'antigène de puces à ADN est une technique robuste permettant la caractérisation à haut débit d'auto-anticorps sériques. Cette technique est hautement personnalisable et sensible. Le système de détection fluorescente à base a été optimisé pour les études à la fois humains et de souris et permet la détection simultanée des anticorps IgG et IgM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter