Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation av två färger Antigen Microarrays för samtidig detektion av IgG och IgM autoantikroppar

doi: 10.3791/54543 Published: September 15, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. späda Antigener och Generating Antigen Microarrays

  1. Späd antigen i PBS till en slutkoncentration av 0,2 mg / ml. Skriv ut upp till 162 unika antigener i duplikat med en konfiguration microarrayer med 9 stift. Inkludera IgG och IgM antigener i antigen biblioteket som positiva kontroller. Inkluderar PBS enbart som en negativ kontroll.
  2. Tillsätt 20 | il av varje antigen till 384 väl källplattan. Lägg antigener till källplattan i grupper som speglar inställningen av skrivhuvudet (t.ex. ordna antigener i grupper om nio när 9 stift används för utskrift).
  3. Täckkällplattan med folie och frysa vid -80 ° C tills redo att skriva ut arrayer.
  4. Rengör fasta microarrayer stift genom att inkubera dem i en ultraljud bad med avjoniserat vatten under 3 x 1 min. Placera stift i rack för att torka och sedan ordna stift i microarray skrivhuvudet. För 9 stift, använd en 3 x 3-konfiguration.
  5. Program microarrayer för upplaga genom att antalet stift på skrivhuvudet,antal bilder för att skriva ut, antal dynor på varje bild, och antalet upprepade platser för varje antigen. Normalt använder 9 stift, 70 rutschbanor, 2 kuddar / bild och 2 likadana fläckar för varje antigen. Program microarrayer att sonikera stift i vatten mellan olika grupper av antigener.
  6. Tina källplattan och centrifugera sedan plattan under 1 minut vid 100 x g. Placera källplatta på anvisad plats i microarrayer. Ta bort den del av folien som täcker den första gruppen av antigener som skall tryckas.
  7. Ordna otryckta glider på arrayer yta och kör utskriftsprogram. Skriv ut glider vid RT med luftfuktighet inställd på arrayer på 55-60% med den inbyggda luftfuktare i matrisen maskinen.
  8. Efter varje grupp av antigener är tryckt på alla bilder, pausa microarrayer. Täck antigener som bara trycktes med folie (för att förhindra avdunstning) och avslöja nästa grupp av antigener som ska skrivas ut. Fortsätt utskriftsprogram.
  9. Efter alla antigener har skrivits ut, täcka källa plåt med ny bit folie och frysa vid -80 ° C. Placera tryckta bilder i glidlåda och vakuumtätning. Objektglasen kan användas nästa dag eller upp till en månad senare.

2. Sondering Antigen Microarrays med utspätt serum

  1. Placera objektglasen i ramar med hjälp av inkubation kammare. Lägg 700 | il blockeringsbuffert (2,5% [vol / vol] Fetalt kalvserum (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 i PBS) till varje array yta.
  2. Placera självhäftande film över ram och plats i en sluten behållare med en bit av våt vävnad. Inkubera O / N vid 4 ° C på en vippa.
  3. Späd serumprover 1: 100 i blockeringsbuffert. Sug blockerande lösningen från matriser och tillsätt 500 pl av utspätt prov till varje array yta.
  4. Täck med självhäftande film och inkubera under 1 h vid 4 ° C under skakning.
  5. Späd sekundära antikroppar i blockerande buffert. För humana studier, späd en Cy3 märkt get-anti-human IgG-antikropp till 0,33 | j, g / ml och en Cy5-märkta get-anti-human IgM-antikroppar till 0,25 mikrogram / ml. För mus studier, späd en Cy3 märkt get-anti-mus-IgG-antikropp till 0,38 | j, g / ml och en Cy5-märkta get-anti-mus-IgM-antikropp till 0,7 | j, g / ml.
  6. Aspirera prover från matriser och skölj array ytor 4 gånger med sköljbuffert (0,1% Tween 20 i PBS). Pour buffert på att bilder och bläddra upp snabbt.
  7. Lägg 700 ul blockerande buffert för att tvätta varje grupp yta och inkubera 10 minuter vid RT med gunga. Upprepa tvättningen två gånger.
  8. Tillsätt 500 pl av utspätt sekundär antikropp till varje glidyta och täck med adhesiv film. Inkubera 45 min vid 4 ° C under skakning.
  9. Sug sekundär antikropp blandning av diabilder och skölj 4 gånger som ovan. Tvätta objektglasen 3 gånger med 700 pl blockerings / utspädningsbuffert som ovan.
  10. Ta bort diabilder från ramar och plats i metall glidhylla som nedsänkt i PBS. Inkubera 20 min vid RT med orbital skakning. I New behållare med PBS och inkubera ytterligare 20 min med skakning.
  11. Placera bilden rack i behållare av avjoniserat vatten 15 sek. Placera rack i en ny behållare med vatten och inkubera ytterligare 15 sek.
  12. Till torra bilder, plats slide rack på en ELISA-platta adapter i centrifugen och snurra på 220 xg under 5 minuter vid RT.
  13. Placera objektglasen i ljustäta lådan tills redo för skanning.

3. Scanning Antigen Microarrays och exportera data

  1. Skanna diabilder med hjälp av en microarray scanner som kan upptäcka Cy3 och Cy5 fluorescerande signaler. I syfte att justera fotomultiplikatorrör (PMT) nivåer av scannern, pre-scan en bild som endast undersöktes med sekundära antikroppar.
    Obs: Denna bild bör ha full antigen biblioteket tryckt på det, inklusive positiva (IgG och IgM) samt negativa (PBS) kontroller. Pre-scan är en lågupplöst skanning som gör det möjligt för användaren att snabbt hitta de optimala PMT inställningar.
  2. Ställ in PMT värdena så att de humana IgG-funktioner (på Cy3-kanalen) och humen IgM funktioner (på Cy5-kanalen) har en liknande medianfluorescensintensitet minus bakgrunden (MFI-B) (typiskt 40000). PMT nivåerna fastställs genom att trycka på "hårdvara" -knappen. När set, hålla dessa PMT inställningar konstant.
  3. Skanna experiment glider på de två kanalerna genom att trycka på "Scan" -knappen. Spara på bildfilerna (båda kanalerna) efter varje skanning.
  4. Fyll bilden som skall analyseras i microarray programvara genom att använda "fil".
  5. Ladda genen array listan (GAL) fil genom att använda "fil". GAL-fil har layouten av arrayen med identiteterna för array funktioner.
  6. Placera array mall över den skannade bilden så att arrayer funktioner matchar mallen så nära som möjligt.
  7. Rikta funktioner i alla block med mallen genom att trycka på "align" -knappen. Programmet kommer i allmänhet att finna konturerna av de cirkulära funktioner, men vissa manuella justeringar kan behövas. Dessa justeringar kan göras genom att ange funktionen läget. Mjukvaran beräknar sedan en MFI-B för var och en av antigenerna.
  8. Använd "fil" knappen för att exportera dessa resultat som en textfil.

4. Analysera Array Data med Betydelse analys av microarrays (SAM)

  1. Ladda enskilda textfiler till Excel och identifiera de kolumner som har MFI-B för Cy3 och Cy5 kanaler.
  2. Beräkna medelvärdet för de dubbla funktioner.
  3. För varje negativ MFI-B, ersätter negativt tal med 10. Omvandla data genom att dela rå MFI-B med 100 och sedan genom att beräkna log bas två.
  4. Analysera loggtransformerade data med Betydelse analys av microarrays (SAM) som beskrivits tidigare 7.
  5. För en studie med två grupper (t.ex. friska kontroller kontra patienter), etikett en grupp "1" och gruppen "2." Använd en två-klass, oparade analys i SAM för att identifiera antigener reaktiviteter som är significantly olika mellan de två grupperna (q-värde <0,05).
  6. Använd klustring och värme karta genere programvara för att göra bilder för presentation 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antigener är anordnade i en 384-brunnsplatta och skrivs ut på objektglas med en robot microarrayer såsom visas i figur 1. Figur 2 visar diabilder placeras i en ram med inkubationstider kamrar och en skannad bild efter bearbetning. Figur 3 visar positiva och negativa kontrollobjektglas. Den negativa sliden endast sonderades med sekundära antikroppar, och den positiva kontrollen sliden sonderades med serum från en patient med systemisk lupus erythematosus. Genom att använda två separat märkta sekundära antikroppar, kan IgG- och IgM-reaktiviteterna separeras på samma glas yta. Figur 4 visar fluorescensintensiteten hos IgM-antikroppar mot enkelsträngat DNA (ssDNA) och IgG antikroppar mot ribosomala P (Ribo P) över ett brett spektrum av serumspädningar. I detta experiment positivt kontrollserum från en patient med systemisk lupus erythematosus med känd reaktivitet mot Ribo P användes. linöronsvar observeras på IgM-kanalen över alla serumspädningar. Linjära svar observeras på IgG-kanal upp till en MFI-B av ungefär 30.000. Efter denna punkt, svaren börjar att mätta och ökar i antikropp till Ribo P inte leder till en motsvarande ökning av MFI-B. Figur 5 visar hur de matriser kan användas för att detektera reumatoid faktor i humanserum. I denna studie var serum från en patient med cryoglobulinemic vaskulit med en dokumenterad reumatoid faktor (IgM-antikroppar mot IgG) av 167 IE / ml (normal <11 IU / ml) användes. Använda sekundära antikroppar ensam, ingen IgM reaktivitet ses mot IgG som är prickig på uppsättningen. Däremot är betydande IgM reaktivitet (MFI-B av cirka 5000) detekteras mot IgG när bilden sonderade med serum från patienten med reumatoid faktor. Figur 6 visar utvecklingen av en tvåfärgad antigen microarray för användning med musserum. I denna figur, mus IgM thvid är fläckas på arrayen detekteras endast av den anti-mus-IgM sekundär antikropp, och mus-IgG som fläckas på arrayen detekteras endast av anti-mus-IgG sekundär antikropp. Figur 7 visar inriktning av en mall rutnät på en skannad array bild med microarray analys programvara. När array funktioner har anpassats till nätet, kan array funktioner ska analyseras för att erhålla medianfluorescensintensitet minus bakgrund för varje funktion.

Figur 1
Figur 1. Generation av antigen mikroarrayer. Antigener placeras först i källplattan. I källplattan som visas i figuren, är antigener anordnade i grupper om 9, matchande den 3 x 3 layouten för skrivhuvudets stift. Källplattan placeras sedan i den robot microarrayer och antigenerna därefter fläckvis på objektglasen. I detta exempel, två-pad FAST slides are används, vilket möjliggör identiska matriser kan upptäckas på 2 nitrocellulosa ytor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Behandling av antigen Microarrays. Diabilder placeras i FAST ramar med hjälp av inkubation kammare och behandlas genom att tillsätta prover och sedan sekundära antikroppar. Antigen reaktiviteter avslöjas med en scanner kan detektera fluorescenssignaler. Den skannade bilden av en 2-pad FAST bild visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 <br /> Figur 3. Två färger Antigen Microarrays optimerats för användning med humana sera. (A) IgG, IgM, och IgG-Fc detekteras på matrisen sonderas endast med sekundära antikroppar. Dessa tre antigenerna är positiva kontroller för att visa specificiteten av de sekundära antikropparna. Röd fluorescens (IgM-kanal) indikerar bindning av anti-human IgM sekundär antikropp. Grön fluorescens (IgG-kanal) indikerar bindning av anti-human IgG sekundär antikropp. IgG Fc-antigenet är vit på grund av övermättnad. (B) Många fler reaktiviteter upptäcks på matrisen undersöktes med positivt kontrollserum från en patient med systemisk lupus erythematosus med känd reaktivitet mot Ribo P antigen. Boxarna indikerar de platser där DNA- och Ribo P antigener har grupperade. (C) Kvantifiering av fluorescensintensiteterna i det positiva kontrollserumet avslöjar att huvuddelen av de reaktiviteter av antikroppar mot DNA-antigener är av IgM isotyp. (D) Kvantifiering av fluorescensintensiteterna i det positiva kontrollserumet avslöjar att de flesta av de reaktiviteter antikroppar mot Ribo P antigener är av IgG-isotypen. Array funktioner fläckig i duplikat och är ungefär 500 mikrometer i diameter. Grafer visar medelvärde ± SD för array funktioner. dsDNA, dubbelsträngat DNA; ssDNA, enkelsträngat DNA; MFI-B, medianfluorescensintensitet minus bakgrund; Ribo P, ribosomal P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Fluorescens Intensitet vs. Serum Spädningsfaktor. (A) MFI-B över ett brett spektrum av serumspädningar visas för IgM mot ssDNA och IgG mot Ribo P. För dessaexperiment positivt kontrollserum med känd IgG reaktivitet mot Ribo P och ssDNA används. MFI-B är mättad till ett värde av cirka 65 tusen. (B) Log2 omvandling av MFI-B data avslöjar linjära svar på både IgG och IgM-kanaler över ett brett spektrum av antigen reaktivitet. Under en MFI-B på 30.000, börjar IgG signalen för att mätta och förlorar linearitet. Array funktioner sågs i 6 replikat. Grafer visar medelvärde ± SD för array funktioner. ssDNA, enkelsträngat DNA; MFI-B, medianfluorescensintensitet minus bakgrund; Ribo P, ribosomal P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Upptäckt av reumatoid faktor med två färger Antigen Microarrays. (B) Array sonderades med serum från en patient med cryoglobulinemic vaskulit med hög reumatoid faktor. IgG funktionen är gröngul grund av bindning av IgM i patientens serum till immobiliserat IgG. Intressant nog har denna patient även IgG-antikroppar mot IgM som IgM funktionen visas orange. Patienten har också en historia av medfödd hjärtsjukdom och noteras att ha hög reaktivitet till hjärtprotein troponin C. (C) Kvantifiering av IgG och IgM har på matrisen undersöktes endast med sekundära antikroppar visar att de sekundära antikropparna inte har någon korsreaktivitet. (D) Kvantifieringav IgG och IgM-funktioner på matrisen sonderades med patientens serum bekräftar närvaron av reumatoid faktor. Funktioner är fläckig i duplikat och är ungefär 500 mikrometer i diameter. Grafer visar medelvärde ± SD för array funktioner. MFI-B, medianfluorescensintensitet minus bakgrunden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Utveckling av två färger matriser till profil musserum Antikroppar. (A) Array sonderade endast med sekundära antikroppar. Röd fluorescens indikerar bindning av anti-mus-IgM sekundär antikropp. Grön fluorescens indikerar bindning av anti-mus-IgG sekundär antikropp. Den mus-IgG som fläckas på arrayen detekteras endast av den anti-mouSE-IgG sekundär antikropp, och mus-IgM som är fläckig detekteras endast av den anti-mus-IgM sekundär antikropp. De andra funktioner på de matriser som upptäcks av de sekundära antikropparna är infångningsantikroppar mot mus-IgG eller mus-IgM. (B) Array sonderades med en mus-IgG-monoklonal antikropp mot histidin taggar. På denna array, Ribo P antigen (rekombinant his-taggat protein) är grön, vilket indikerar att det bara upptäcks av anti-mus-IgG sekundär antikropp. Detta förväntas med tanke på att den monoklonala antikroppen är av IgG-isotypen. Den Ribo P-antigenet är inte detekteras när uppsättningarna probas med enbart sekundära antikroppar (apelsin box). (C) Kvantifiering av IgG, IgM, och Ribo P funktioner på matrisen sonderades med en mus-IgG-monoklonal antikropp mot histidin taggar. Array funktioner är fläckig i sex replikat och är ungefär 500 mikrometer i diameter. Grafer visar medelvärde ± SD för array funktioner. MFI-B, median fluorescence intensitet minus bakgrund; Ribo P, ribosomal P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Anpassning av en mall Grid på en Array bild. I denna skärmdump, en mall galler, som genererades från en gal-fil, var i linje med en tidigare skannad antigen microarray. Uppsättningen undersöktes med serum från en patient med systemisk lupus erythematosus och en blodkoagulering sjukdom som hade många autoantikropps reaktiviteter. Grön fluorescens representerar bindning av IgG-antikroppar och röd fluorescens representerar bindning av IgM-antikroppar. De funktioner skrivs ut av fasta stift är nästan cirkulär och lätt beskrivs av microarray programvara (GenePix). När nätet inriktningen är klar, software kan beräkna medianen fluorescensintensitet minus bakgrunden (på både Cy3 och Cy5 kanaler) för var och en av gruppfunktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för kvantifiering av autoantikroppar med användning av antigenet microarray teknik. Antigen mikroarrayer erbjuder flera fördelar jämfört med konventionell ELISA i screening för autoantikroppar. Först av allt, kan en mängd olika antigener, inklusive nukleinsyror, proteiner, peptider, och cellysat vara klädd på nitrocellulosabelagda objektglas, vilket möjliggör multiplex screening av autoantikroppar. Dessutom, bara mikrogram antigen är nödvändiga för att generera arrayer eftersom nanoliter av antigen är fläckig på varje bild. Uppsättningarna kräver också mycket lite patientprov, eftersom det bara behövs 5 | il av serum för att sondera en array yta vid en 1: 100 prov utspädning. Slutligen arrayer i fläckar på nitrocellulosa har visat sig vara känsligare än konventionella ELISA vid screening för autoantikroppar 9.

Förutom att använda antigen microarrays att screena för autoantikroppar, kan uppsättningarna vara användningend att detektera reaktivitet mot icke-självproteiner (t.ex. virala proteiner), för att definiera specificiteten hos monoklonala antikroppar, och för att mäta nivåer av icke-HLA-antikroppar i transplantation såsom beskrivits tidigare 9-12. Antigen microarrays kan också användas för att utföra detaljerad epitopkartläggning experiment där överlappande peptider av ett enda protein är grupperade på ett objektglas. En nyligen genomförd studie använde detta tillvägagångssätt för att definiera epitoper av U1-70K protein som är mål för autoantikroppar vid systemisk lupus erythematosus 13.

Användning av det protokoll som beskrivs här, är detekteringen av IgG- och IgM-reaktiviteterna linjär över ett brett område av serumspädningar. Dessa studier genomfördes med hjälp av positiva kontrollserumet från en patient med systemisk lupus erythematosus med känd reaktivitet mot ribosomala P antigen och ssDNA. IgM reaktivitet mot ssDNA är linjär vid serumspädningar av 1: 125 till 1: 32.000, motsvarande MFI-B av 17.000 till 50. IgG reaktivitet motRibo P är linjär vid serumspädningar av 1: 4000 till 1: 512 tusen, motsvarande MFI-B av 32.000 till 200. Vid späd lägre än 1: 4000 (och MFI-B är större än 32.000), kurvan av IgG reaktivitet planar upptäckt och är inte längre linjärt. I arbetet med hjärttransplantationspatienter, är serum rutinmässigt utspätt till 1: 100 som MFI-B för antigen överstiger sällan 10.000 vid denna utspädning. För studier med patienter med autoimmun sjukdom med hög titer autoantikroppar, kan patientprover måste spädas ytterligare för att säkerställa att majoriteten av autoantikropps reaktivitet faller inom det linjära området för analysen.

Medan MFI-B kan vara bra att jämföra autoantikropps reaktiviteter mellan grupper av patienter, kan det också vara lämpligt att omvandla detta värde till ett mer kvantitativt mått på autoantikroppsnivåer. Detta kan åstadkommas genom att fläcka flera kända utspädningar av renade IgG och IgM på objektglasen för att generera en standardkurva. Med hjälp av denna kurva, kan MFI-B då transformas till en autoantikropp nivå för varje antigen.

I protokollet presenteras här, var två-pad nitrocellulosabelagda objektglas används. På dessa bilder, två identiska matriser, som kan sonderas med två separata serumprover, är tryckta på varje objektglas. Detta tillåter två prover från samma patient (såsom före och efter behandling) som skall jämföras på samma glas, vilket minimerar interslide variabilitet. Trettiotvå glider med 64 individuella patientprover rutinmässigt bearbetas samtidigt i en dag. Den senaste uppsättningen skrivs med 9 stift, vilket möjliggör 162 antigener som ska skrivas ut i två exemplar (varje stift skriver en 36 funktion undersystem som är lika med 18 antigener tryckta i två exemplar).

De antigen mikroarrayer genereras i detta protokoll trycktes med fasta microarrayer stift. Skriva ut med fasta stift är mer tidskrävande än att skriva med gåspenna stil pins eftersom microarrayer måste åter dopp i källplattan efter varje tIME att stiften röra glidytan. Fasta stift användes som de producerar mycket reproducerbara, nästan cirkulär uppsättning funktioner (ca 500 | j, m i diameter). Dessa funktioner kan lätt detekteras och beskrivs av skannerprogrammet, och minimala manuella justeringar behövs för att kvantifiera array funktioner. Fasta stift gör det också möjligt för cellysat som ska skrivas ut, vilket kan vara svårt att skriva ut med quill stift på grund av sin högre viskositet. På grund av de långa utskriftstider som arbetar med fasta stift (ibland 10-11 timmar för att skriva ut 70 diabilder), antigener som inte skrivs ut i källplattan är täckta med folie för att förhindra avdunstning.

Protokollet som beskrivs här presenterar en metod för att separera IgG och IgM reaktivitet på samma glidytan. Uppsättningarna har optimerats för att screena för både människa och mus antikroppar med användning av par av sekundära antikroppar märkta med olika fluoroforer. Avgörande för detta tvåfärgad strategi är att identifiera secondary antikroppar som är mycket specifika för antingen IgG- eller IgM-isotyper. De sekundära antikropparna som används känner igen Fc-delen av IgG eller IgM och inte korsreagerar med varandra. Separera IgG och IgM signaler är viktigt med tanke på de olika funktionerna av dessa antikroppar i immunsvar. Till exempel är IgM produceras vid högre nivåer av B1 celler och är typiskt en markör för en tidig immunsvar. Å andra sidan, är IgG en markör för en senare immunsvar, som utvecklas som ett resultat av klass omkoppling 14. Genom att detektera IgG- och IgM-signaler separat, är det också möjligt att identifiera IgM reumatoida faktorer i patientprover (dvs IgM immunglobuliner som binder till IgG som har fläckades på matrisen). Genom att stänka olika delar av antikroppar (t ex Fc kontra Fab), bindning av reumatoid faktor till olika IgG-antikroppsepitoper kan kvantifieras. Med tillgång till skannrar med mer än två lasrar, ytterligare andraAry antikroppar kan läggas till den nuvarande sekundär antikropp paret att identifiera bindning av IgA, IgD eller IgE-antikroppar. Sekundära antikroppar kan också identifieras som skulle möjliggöra identifiering av separata IgG-subklasser (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) bundna till antigener på en enda rad.

Sammanfattningsvis är antigenet microarray-tekniken en robust teknik gör det möjligt att med hög genomströmning karakterisering av serumautoantikroppar. Denna teknik är mycket anpassningsbar och känslig. Den fluorescerande baserade detektionssystem har optimerats för både människa och mus studier och tillåter samtidig detektion av IgG- och IgM-antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ribosomal P0 Diarect 14100 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgG Jackson Immuno 009-000-003 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
human IgM Jackson Immuno 009-000-012 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgG Sigma-Aldrich I5381 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
mouse IgM Biolegend 401601 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
double-stranded DNA Sigma-Aldrich D1626 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
single-stranded DNA Sigma-Aldrich D8899 dilute to 0.2 mg/ml in PBS
microarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro many types of arrayers are suitable
solid printing pins Arrayit Corporation SSP015
software for robotic microarrayer Virtek Chipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad) GVS Northa America 10485317
FAST frame GVS Northa America 10486001
FAST incubation chambers (2 Pad) GVS Northa America 10486242
384 well plates Whatman 7701-5101
plate sealers VWR 60941-062
foil plate covers VWR 60941-124
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Fetal calf serum Invitrogen 12483020
Cy3 goat anti-human IgG Jackson Immuno 109-165-096 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgM Jackson Immuno 109-175-129 use working stock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgG Jackson Immuno 115-165-071 use working stock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgM Jackson Immuno 115-175-075 use working stock in 50% glyercol
Microarray Scanner Molecular Devices Axon 4200A
Microarray software Molecular Devices Genepix 6.1
Clustering software eisenlab.org Cluster 3.0
Heatmap software eisenlab.org Treeview 1.60
Microarray statistical software Stanford University SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224 (2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555 (2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).
Generation av två färger Antigen Microarrays för samtidig detektion av IgG och IgM autoantikroppar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).More

Chruscinski, A., Huang, F. Y. Y., Ulndreaj, A., Chua, C., Fehlings, M., Rao, V., Ross, H. J., Levy, G. A. Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies. J. Vis. Exp. (115), e54543, doi:10.3791/54543 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter