Summary
초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
많은 유사점. 초파리 포유류 적응 면역 특성화 림프 혈통 부족에도 초파리 및 포유류 조혈 시스템 간에는 초파리 및 포유류 조혈 여러 혈액 세포 계통을 생성 시공간적 가지 단계에서 발생한다. 두 시스템 확장하거나 성숙한 계통을 대체 할 수있는 혈액 세포 전구 세포의 저수지를 유지한다. 조혈 시스템은 초파리와 포유류에 대응하는 면역 도전에 적응 할 수 있습니다. 중요한 것은, 생성, 유지 보수 및 조혈 시스템의 기능을 조절하는 전사 규제 및 신호 전달 경로는 포유류에 파리에서 보존된다. 이러한 유사성은 초파리 유전자 모델 개발 및 조혈 질환에 사용될 수 있도록.
여기에 우리 세부 분석은 초파리 애벌레의 조혈 시스템을 검사합니다. 에서특히, 우리는 혈액 세포 수와 농도를 측정하는 생체 내에서 특정 성숙한 혈통 시각화 및 순환과 조혈 기관의 혈액 세포에서 면역 조직 화학 법을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 유전자 발현의 변화 및 신호, 생존, 증식 및 분화를 포함하는 세포 과정을 공개하고 조혈에 대한 질문의 다양성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 초파리 가능한 유전 도구와 결합 된 분석 방법은 정의 된 유전자 변형시의 조혈 시스템을 평가할 수있다. 특히 여기에 설명되지는 않았지만, 이러한 분석법은 조혈 시스템의 감염이나식이 요법 등의 환경 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다.
Introduction
혈액 학적 질환의 조혈 시스템의 개발 및 그 고장 좌표 전사 인자 및 신호 전달 경로를 조절 복잡한 메커니즘이 제대로 이해 남아. 이러한 전사 인자 및 신호 경로뿐만 아니라, 그 조절은 매우 초파리 및 포유류 조혈 1-5 사이에 보존된다. 따라서 초파리 조혈 시스템은 조혈 및 기저 혈액 질환을 제어하는 분자 메커니즘을 정의하는 우수한 유전 모델을 나타낸다.
포유 동물과 유사하게, 초파리는 조혈의 공간적 및 시간적으로 별개의 단계에서 혈구 불리는 혈액 세포를 생성. 전통적으로, 초파리의 조혈는 배아 중배엽과 애벌레 림프 글 랜드에서 단계로 제한 될 것으로 생각되었다. 조혈 또한 애벌레 정착 클러에서 발생하는 최근의 연구는 증거를 제공sters과 6-8 복부 성인이다. plasmatocytes 및 액정 셀 모든 조혈 상 성숙 혈구 세포의 두 가지 유형을 생성한다. Plasmatocytes은 식균 작용, 선천성 면역, 및 상처 치유에 관여하는 대 식세포와 같은 세포이다. 크리스탈 세포는 melanization, 곤충 면역 반응 및 상처 치유에 사용되는 반응에 필요한 프로 phenoloxidases가 포함되어 있습니다. 제 성숙한 혈구 유형을 생성 할 수 있습니다 애벌레 조혈는 같은 포식 기생자 말벌 감염 9,10와 같은 특정 면역 도전에 대응하는 lamellocyte을했다. Lamellocytes는 캡슐화와 초파리 유충에 누워 말벌 알을 중화, plasmatocytes 및 결정 세포와 함께, 작동 큰, 부착 세포이다. 기생가 없을 lamellocytes는 야생형 유충에서 발견되지 않는다. Melanotic 대중 흑화, 캡슐 말벌 달걀을 닮은; 많은 초파리 돌연변이 균주 기생의 부재 melanotic 질량을 개발한다. lamello의 존재cytes 및 / 또는 melanotic 대중은 조혈 이상을 표시 할 수 있습니다. 사실, melanotic 질량 표현형 조혈 11-14에 관여하는 유전자 및 경로를 식별하는데 사용되었다.
애벌레 조혈 시스템은 가장 광범위하게 최신 연구이다. 그것은 체액의 순환 혈구 세포로 구성되어, 고착 혈구의 표피 아래 패턴 클러스터 및 혈구 세포는 림프 글 랜드에 거주. 림프 글 랜드는 등의 용기에 부착 된 양자 로브 시리즈입니다. 림프 글 랜드의 각 주 로브는 세 가지 주요 영역으로 구분된다. 가장 바깥 쪽 영역은 대뇌 피질의 영역으로 알려져 있으며, 혈구 세포를 성숙 포함되어 있습니다. 가장 안쪽 영역은 골수 영역이라고하며 대기 혈구 전구 물질로 구성된다. 제 3 구역, 후방 센터 시그널링은 줄기 세포와 같은 틈새로 작용 임파선 기지에서 세포의 작은 그룹이다. 초기 작품은 노치 15-18위한 중요한 기능을 설립 19, 20, JAK-STAT (18), 및 날개없는 21 활동은 애벌레 림프 글 랜드 개발을 조절합니다. 최근의 연구는 BMP (22), FGF-라스 (23), 그리고 마 24, 25 신호는 애벌레 림프 글 랜드 내에서 작동하는지 증명하고있다.
여기에 설명 된 네 유생 조혈 분석 1) 단위 부피 당 세포 수를 의미 순환 혈구 농도를 측정, 2) 분리 및 정착 3) 생체 내에서 액정 셀을 시각화 면역 대한 혈구 세포를 순환하고, 4), 고정 해부 및 장착 설명 림프는 면역 조직 화학에 대한 글 랜드. 이러한 분석은 함수 및 애벌레 조혈 시스템에서 신호 전달 경로의 규제를 평가하는 조혈 판독로서 사용될 수있다. 이러한 방법은 필드에서 이전에 사용되었지만, 이러한 분석법 시각 문서 최근 8,26-30 시작했다. 여기에 인용 된 여러 출판물에 도움된다유사한 방법 및 조혈 마커 26,31-33을 설명 FUL 자원. 또한, 트롤과 바이킹은 림프 글 랜드 기저막의 유용한 지표이다.
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Protocol
1. 순환 혈구 농도
- 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다.
- 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 표 1) 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다.
- 각각의 애벌레를 들어, 얼음에 microcentrifuge 관에 PBS 1X 10 μl의 깨끗한 해부 패드에 PBS 1X 10 μl를 배치합니다. 조명 실체베이스에 해부 패드를 놓습니다.
- 조직에 배치하여 각각의 유충을 건조는 해부 패드에 PBS 드롭에 전송하기 전에 닦아주십시오.
- 포셉 한 쌍을 사용하여 부드럽게 열고 눈물 조심스럽게 체액을 해제 할 수있는 표피를 반전.
참고 : 긁어 또는이 잠재적으로 정착 혈구 세포 (29)를 방출 수로 표피를 잽주의 바랍니다. - 피펫을 사용하여 해부 패드로부터의 체액을 수집한다. 공동 피이러한 지방 본문으로 애벌레 파편을 llecting.
- 미세 원심 튜브에 체액을 추가로 pipetting 아래로 섞는다.
주의 : 샘플을 여러 번에 수집 시간까지 얼음 상에 유지 될 수있다. - 옵션 : 염색과 죽은 세포를 제외 균등의 체액 샘플과 트리 판 블루를 섞는다. 이 세포에 독성이 있기 때문에 트리 판 블루를 추가의 3 분 이내에 세포를 계산합니다.
- 최대 피펫 팅에 의해 아래로 혈구 실에 10 μl를로드하기 전에 샘플을 섞는다.
- 자동 세포 계수기를 사용하는 경우, 셀 크기 및 원형에 대한 적절한 매개 변수를 설정합니다. 통상 둥근 혈구 세포 (34)를 검출하기 위해 80 %의 원형 - 예를 들어, 2 μm의 최소 셀 크기 22 ㎛의 최대 셀 크기 및 (75)의 원형도를 설정한다. 다른 매개 변수를 실험은 lamellocytes으로 더 큰 스핀들 모양의 혈구 세포를 감지합니다. 또한, 수동 혈구 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
2. CIRculating 혈구 면역 조직 화학
- 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다.
- 6- 또는 12 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 coverslip를 놓습니다.
참고 : 광장 된 커버 (22mm) 6 웰 플레이트 라운드 커버 슬립 (18mm 직경)에 맞는 12 웰 플레이트에 적합. - 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다.
- 각 커버 슬립의 중심에 5 μL 1X PBS를 놓습니다.
- 조명 실체베이스에있는 플레이트에 놓습니다.
- 닦아 조직의 개별 애벌레를 건조 후 커버 슬립에 PBS에 배치합니다.
- 포셉 한 쌍을 사용하여 부드럽게 찢어 조심스럽게 표피를 반전. 애벌레 시체를 제거하기 전에 균일하게 체액을 전파하는 데 사용합니다.
참고 : 긁어 또는이 잠재적으로 정착 혈구 세포 (29)를 방출 수로 표피를 잽주의 바랍니다. - Repea커버 슬립 당 하나의 유충의 체액을 수집, 모든 애벌레에 대한 마에. 혈구 세포 5에 대한 커버 슬립을 준수 할 수 있도록 허용 -. 실내 온도 실온에서 8 분 고정하기 전에 30 분을 초과하지 마십시오.
- 실온에서 15 분 동안 각 커버 슬립을 7.5 % 포름 알데히드 (표 1) 5 μl를 첨가하여 혈구 세포를 고정한다.
- 워시는 1X PBS로 3 회 된 커버. 판 팁 각 세척 후 PBS를 대기음. 다음 단계에서 permeabilization 솔루션의 실행 - 오프를 방지하기 위해, 커버 슬립의 경계에서 초과 PBS를 제거하는 흡입기를 사용합니다.
- 실온에서 20 분 동안 각 coverslip에 100 ㎕의 permeabilization 솔루션 (표 1)를 추가합니다.
- 팁 부드럽게 permeabilization 솔루션을 대기음 할 수있는 판을 누릅니다.
- 공급자의 사양에 따라 항체 용액 (표 1)과 차 항체를 희석. 12 웰 플레이트에서 적어도 500 μL를 커버 슬립 1 차 항체 솔루션을 추가합니다.6 웰 플레이트에서 적어도 1.5 ML을 추가합니다. 밤새 4 ° C에서 품어.
- 차 항체 용액을 제거하고 궤도 흔드는, 세 번에 10 분 동안 1X PBS로 된 커버를 세척한다.
- 공급자의 사양에 따라 항체 솔루션 차 항체를 희석. 12 웰 플레이트에서 커버 슬립 적어도 500 μL 차 항체 솔루션을 추가합니다. 6 웰 플레이트 적어도 1.5 ML을 추가합니다. RT에서 적어도 2 시간 동안 인큐베이션.
- 이차 항체 용액을 제거하고 단계 2.10, 세 번 같이 궤도 통에 10 분 동안 1X PBS로 된 커버를 세척한다.
- 세척 단계 동안 깨끗한 유리 현미경 조직 제거제를 사용하여 70 % 에탄올 (표 1)과 함께 슬라이드. 각 커버 슬립 들어 유리 슬라이드 5 μL 장착 완충액 (표 1)을 배치했다.
참고 : 두 개의 커버 슬립 한 슬라이드에 맞게. - 최종 PBS 세척을 대기음.
- 조심스럽게 접시와 장소, INV에서 커버 슬립을 제거하기 위해 집게를 사용하여장착 버퍼의 상단에, erted.
참고 : 현미경 슬라이드 이전 영상에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최대 축적 시간은 사용되는 항체의 안정성에 의존한다. 6- 12- 웰 플레이트를 세정하여 재사용 할 수있다.
생체 크리스탈 셀 Melanization 3.
- 이 분석에 대해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성 2-6 시간 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다.
- 시작하기 전에 60 ℃에서 가열 원을 설정한다.
주 : (25 ℃로 유지 하였다)를 10 분 동안 60 ° C의 열 순환기 프로그램은 잘 작동하지만, 상기 열은 각각 충 걸쳐 일관되고 균일하게 분포 될 때 수조 또는 다른 열원 긴로 충분하다. - 1X PBS (표 1) 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다.
- 한번에 하나는 조직에 유충이 PCR 튜브의 하단에 위치 닦아 건조. 각각의 유충을 배치별도의 PCR 튜브한다. (그림 3A를 참조하십시오.)
- 15 분 및 / 또는 부드럽게 전에 가열로 튜브를 눌러 - 일관성있는 결과를 들어, 10 4 ° C에서 튜브에서 애벌레를 차게하여 PCR 튜브의 바닥에 그 애벌레 숙박을 보장합니다.
- 열 자전거 타는 사람 (또는 물 목욕)에서 PCR 튜브를 놓습니다. 10 분 동안 60 ℃에서 가열한다.
- 조심스럽게 신선한 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부으로 PCR 튜브에서 애벌레를 제거합니다.
- 조직에 드라이 유충 닦아 실체 현미경에서 이미징을위한 평평한 표면에 배열합니다.
- 맹목적으로 여러 개인 애벌레의 이미지를 점수.
4. 애벌레 림프 글 랜드 면역 조직 화학
참고 : 임파선이 약간 지느러미 측의 두뇌 아래의 유충의 앞쪽 끝에서 약 3 분의 1 길이에 위치해 있습니다. (그림 3B에서 화살표를 참조하십시오.) 림프 글 랜드는 등의 용기를 옆구리 가장 쉽게 입 ~이 부착 해부한다KS 또는 뇌. 야생 형, 세 번째 령 임파선이 매우 작은 구조이다; 길이 200 μm의 - 주 로브는 약 100입니다. (그림 4A를 참조하십시오.)
- 6 시간 -이 분석을 위해 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면, 여성이 2의 고정 된 시간 동안 알을 낳기 수 있도록하여 달걀 수집을 제한 할 수 있습니다.
- 림프의 글 랜드 해부
- 각 실험 조건의 경우, 24 웰 플레이트의 한 웰에 PBS 1 배 1 ㎖ (표 1)를 추가합니다.
- 각 웰 일회용 전달 피펫을 사용하여 0.1 % PBST (표 1) 1 방울을 추가한다.
주 : 세제, 예컨대 트윈 (Tween) 20, 조직은 웰의 바닥에 가라 앉을 수 있도록 표면 장력을 낮추기 위해 추가된다. - 얼음에 플랫 플레이트를 놓습니다.
- 1X PBS 가득 접시의 우물을 해부에 애벌레를 수집합니다.
- 조명 실체베이스에 깨끗한 해부 패드를 놓습니다. 에 작은 배치 일회용 전송 피펫을 사용하여난 패드에 0.01 %의 PBST (표 1)을 삭제합니다. 해부에 대한 PBST 드롭 한 유충을 전송합니다.
- 후방 끝에서 하나의 약 포셉 한 쌍의 1/4 길이, 지느러미 쪽이 위로 유충을 잡아.
- 표피 즉시 유충을 잡고있는 집게에 전방 잡아 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 입 후크가 노출 될 때까지 조심스럽게 앞쪽 끝으로 표피를 잡아 당깁니다.
참고 : 목표는 내부 구조를 방해하지 않고 표피를 벗겨하는 것입니다. - 표피를 놓고 두 유충을 잘라 두 집게를 사용합니다. PBST 드롭의 후방 끝을 제거합니다.
참고 : 표피 입 후크에 모든 방법을 벗겨하지 않는 경우, 두 유충을 절감하고 후방 끝을 제거합니다. 표피의 가장자리를 개최하고, 개방을 통해 입 후크를 밀어 포셉의 다른 쌍을 사용하는 집게 한 쌍을 사용합니다. 이것은 표피를 반전 입 후크를 노출합니다. 이은 altern로서 사용될 수있다뿐만 아니라 절개 방법을 먹었다. - 안정성을 위해 표피 (중 복부 표피, 지느러미 표피 플랩, 또는 둘 다) 아래로 핀 집게 한 쌍을 사용합니다.
- 노출 된 입 후크를 잡아 조심스럽게 그들을 밖으로 끌어 포셉의 다른 쌍을 사용합니다.
참고 :이 내부 구조에서 표피를 분리합니다. 이상적으로는, 눈 / 더듬이 가상적인 디스크, 뇌, 링 글 랜드 및 지느러미 선박 측면 림프 글 랜드는 입 후크에 부착 된 상태로 유지됩니다. - 여전히 입 후크를 누른 상태에서 조심스럽게 예를 들면 침샘, 지방 본문 및 소장으로 원치 않는 구조를 제거합니다.
참고 : 뇌가 입 고리에서 분리하는 경우, 림프 글 랜드는 여전히에 부착 뇌에 수집 될 수 있습니다. 이 경우, 복부 신경 코드 대신 입 후크를 개최합니다. - 핸들과 입 후크 또는 복부 신경 코드를 사용하면. 얼음에 잘에 림프 글 랜드를 포함하는 해부 복잡한 전송 30 분을 초과하지 마십시오고정하기 전에.
- 고정 및 면역 조직 화학
- 실체베이스의 24 웰 플레이트를 놓습니다.
- 신중하게 잘에서 PBST를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
참고 : 빈, 이웃 우물 일시적으로 폐기물을 입금 유용하다. - 부드럽게 잘 측면 아래로 200 ㎕를 3.7 % 포름 알데히드 (표 1)를 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되는 것을 보장하기 위해 접시를 소용돌이 친다.
- 30 분 동안 얼음 접시를 돌려줍니다. 림프 분비가 형광 단백질 (들)을 표현하는 경우, 광표백을 방지하기 위해 커버 플레이트를 유지합니다.
- 주의 깊게 정착을 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
- 웰을 200 ㎕의 1X PBS를 첨가하여 실온에서 5 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 배치하여 세척 하였다. 조심스럽게 PBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
참고 : 모든 실험 조건이 거라고 있습니다에 대한 고정 임파선은 임파선까지 PBS에서 얼음에 남아있을 수 있습니다issected 고정. - 세척이 두 번 더 단계를 반복합니다.
- 잘 200 μl의 permeabilization 솔루션 (표 1)를 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 궤도 통에 접시를 설정합니다.
참고 : 45 분 림프 글 랜드 permeabilization의 "황금 표준"하지만 저자는 20 분 후 성공을. - P200 피펫으로 솔루션을 제거합니다.
- 공급자의 사양에 따라 항체 용액 (표 1)과 차 항체를 희석. 잘 300 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되어 있는지 확인합니다. 밤새 4 ° C에서 품어.
- 차 항체를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
- 웰을 200 ㎕의 1X PBS를 첨가하여 실온에서 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 배치하여 세척 하였다. 조심스럽게 PBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
- 세척이 두 번 더 단계를 반복합니다.
- 보조 희석공급자의 사양에 따라 항체 용액으로 ntibody. 잘 300 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 해부 조직이 완전히 침수되어 있는지 확인합니다. RT에서 적어도 2 시간 동안 오비탈 진탕 기에서 인큐베이션.
- 이차 항체를 제거하고 단계 4.3.12 및 4.3.13에 기술 된 바와 같이 씻어 P200 피펫을 사용합니다. 최종 세척 후 PBS를 제거하지 마십시오.
- 글 랜드 장착을 림프
- 청소 유리 현미경은 70 % 에탄올 (표 1)과 조직 와이프를 사용하여 슬라이드.
- 각 실험 조건에 대한 유리 슬라이드에 완충액 (표 1)를 장착 한 방울을 놓는다.
참고 : 두 조건은 하나의 슬라이드에 맞게. 버퍼 볼륨을 장착하면 임파선의 수를 장착 할 수에 따라 달라집니다. 20 임파선, 10 일 μL - - 12, 5 이하 0.5 ㎕의 약 18에 대한 2 μl를 사용합니다. - 조명 실체베이스의 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 한 번에 최대 두 가지 조건의 경우, 핸들로 입 후크 또는 복부 신경 코드를 사용하여 집게로 장착 버퍼에 우물에서 임파선을 모두 전송합니다.
- 공간 처리에서 장착 버퍼 확산 원형 또는 직사각형 균일 해부 조직.
- 해부 조직의 각각에 대해 개별적으로, 지느러미 용기 아래 포셉 한 통을 밀어 부드럽게 장착 버퍼의 주변쪽으로 당깁니다.
참고 :이 림프가 해부 조직의 나머지에서 밖으로 글 랜드와 유리에 림프 글 랜드를 평평하게 그릴 것입니다. - 하나 포셉의 통과 톱질 동작을 사용하여, 임파선과 뇌 사이의 지느러미 용기를 잘라.
- 버퍼의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 상기 임파선의 반대측에 해부 조직의 나머지를 이동.
참고 : 원치 않는 해부 조직은 결국 임파선 주위에 경계를 형성 whic에 따라 지원 될 것입니다커버 슬립이 휴식 할 시간. - 림프 분비 모두가 중앙에 배치 할 원치 않는 해부 조직 중 하나 예약, 해부 조직에서 분리 될 때까지 반복합니다.
- 두 손가락 사이에 커버 슬립을 가져 가라. 커버 슬립이 먼지와 지문이 없는지 확인합니다. 필요한 경우, 조직 닦아 사용하고 70 % 에탄올은 커버 슬립을 청소.
- 커버 슬립의 쪽이 유리 슬라이드의 가장자리에 평행 한 것을 보장 신중 장착 버퍼 위에 커버 슬립을 낮출.
참고 : 현미경 슬라이드 이전 영상에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최대 축적 시간은 사용되는 항체의 안정성에 의존한다. 24 웰 플레이트를 세정하여 재사용 할 수있다.
5. 이미지
- 이미지 혈구 세포를 고정 제조 업체의 운영 매뉴얼에 따라 20 배 이상 확대에 적절한 표준 형광 또는 공 초점 현미경에 임파선을 탑재. 스탠드에 이미지 전체 애벌레제조업체의 작동 설명서에 따라 2 배의 배율에서 ARD 실체.
- 원하는 경우, 디컨 볼 루션 소프트웨어 제공 업체의 지침을 따르십시오.
| 해결책 | 구성 | 저장 | 댓글 |
| 1X PBS | 200 ㎎ / ℓ 염화칼륨 | 실온 | |
| 200 ㎎ / ℓ 인산 칼륨 일 염기성 | |||
| 8,000 ㎎ / ℓ 염화나트륨 | |||
| 1,150 ㎎ / ℓ 인산 나트륨 | |||
| DH 2 O | |||
| 정착액 | 3.7 % 또는 7.5 %의 포름 알데히드 1X PBS에서 | 어둠 속에서 실온 | 포름 알데히드는 독성이있다. |
| Permeabilization 솔루션 / 항체 희석제 | 0.4 % 트리톤 | 4 ° C | 표준 공식은 0.4 % 트리톤를 사용하지만 저자는 성공 트윈 20 0.1 %를 사용합니다. 공급 업체의 권장 농도에 따라 기본 및 보조 항체를 희석하여 사용합니다. |
| 5 % 소 혈청 알부민, 정상 염소 혈청 또는 정상 당나귀 혈청 | |||
| 1X PBS | |||
| 70 % 에탄올 | dH2O 중에서 70 ~ 200 % 증거 에탄올 | 실온 | |
| 설치 버퍼 | 0.5 % n- 프로필 갈 레이트 | 어둠 속에서 4 ° C | n- 프로필 갈 레이트는 유해하다. DAPI는 돌연변이입니다. |
| 80 % 글리세롤 | |||
| 옵션 : 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌) | |||
| 1X PBS | |||
| 0.1 % PBST | 1X PBS에서 0.1 % 트윈 20 | 실온 | |
| 0.01 %의 PBST | 0.1 % PBST 1:10 희석 | 실온 |
이 의정서에 사용되는 표 1. 솔루션.
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Representative Results
혈구 농도 순환
혈구 수는 애벌레 개발 (35)에 걸쳐 증가한다. 이 방법은 혈구 수와 농도의 차이를 감지하는지 설명하기 위해, 상관없이 생물학적 원인, 우리는 지연 및 비 지연 유충의 혈구 농도를 측정 하였다. ptth 생산 뉴런 (ptth> 냉혹)의 유전 적 절제에 의해 prothoracicotropic 호르몬 (ptth)의 손실 애벌레 개발 (36)의 지연을 생산하고 있습니다. 25 ℃로 올려 8 이상의 개별 유충의 프로토콜 1에 기재된대로 각 유전자형 들어 혈구 농도를 측정 하였다. 2 시간 달걀 수집 후 120 시간에서 지연 유충 당 평균 혈구 농도는 (ptth> 냉혹 한)는 제어 유충 (ptth) 당 평균 혈구 농도보다 작다. 만 구일 후 그 컨트롤의 지연 유충의 접근 당 평균 혈구 농도를 (수행
자동 세포 계수기에서 촬영 한 이미지는 깨끗하고 바람직한 체액 샘플 및 부정확 한 측정 (그림 1C)로 이어질 수있는 파편을 포함하는 샘플을 보여줍니다. 최소 및 최대 셀 크기는 각각 2 μm의 22 μm의 설정 하였다. 원형은 75-80%의 원형으로 설정했다. 이러한 매개 변수는 가이드 라인으로 구성되어 경험적으로 최적화해야한다.
혈구 면역 조직 화학 순환
이 프로토콜에 설명 된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 순환 혈구 세포는 plasmatocyte 특이 항체 (P1A 및 P1B, 이스트 반 안도) (31)의 혼합물로 수집 수정 및 배양(그림 2). 이미지는 표준 형광 현미경 촬영하고 변경되지 않은 및 제약 반복적 디컨 볼 루션 후 표시됩니다. 이때, 컨벌루션 크게 화질이 개선되지 않았다.
생체 크리스탈 셀 Melanization에서
프로토콜 3 (도 3a)에 기재된 유충 전에 가열하는 유도 액정 셀 melanization PCR 용 튜브의 바닥에 넣었다. 빨간색 화살표는 애벌레가 너무 멀리 바닥에서하고 불균일하게 가열 될 수있는 튜브를 나타냅니다. 개별 애벌레에서 열이 고르지 못한 분포는 유충에서 결정 세포의 melanization의 변동성을 증가시킬 수있다.
표준 실체에 이미징 야생형 유충 열 노출 후 정착 클러스터의 흑화 액정 셀의 전형적인 패턴 (도시그림 3B). 림프 글 랜드에서 흑화 결정 세포는 종종 볼 수 있습니다.
애벌레 림프 글 랜드 면역 조직 화학
표준 형광 현미경에 찍은 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지는 지느러미 용기 (그림 4A)를 측면 일차 및 이차 림프 글 랜드 로브를 보여줍니다 프로토콜 4에 설명 된대로 세 번째 령 애벌레 임파선이 해부 고정 및 장착되었다.
골수 영역과 후방 신호 중심이 유 전적으로 강화 된 파란색 형광 단백질 (EBFP2)와 GFP로 표시된하는 림프 글 랜드는 각각 노치 세포 내 도메인에 대한 항체 (C17.9C6, 발달 연구 하이 브리 도마 은행)으로 염색했다 프로토콜에 설명 된 4 Z 스택 이미지를 표준 형광 현미경으로 촬영 하였다. 단일 최대 INT ensity 투사 이미지는 변경되지 않은 및 제약 반복적 디컨 볼 루션 (그림 4B) 이후에 나타납니다. 이때, 컨벌루션 크게 화질 및 세부 개선되었다.
그림 혈구 농도. A) 표준 초파리 매체의 일부를 순환 1. 제거 (오른쪽)가 2 시간 달걀 수집 기간. B) 발달 지연 유충 당 평균 혈구 농도)> 냉혹 한 (ptth보다 낮은했다 동안 달걀 누워 홍보하기 120 시간 달걀 누워 (AEL) 후 제어 유충 (ptth) 당 평균 혈구 농도. 지연 유충 당 평균 혈구 농도는 AEL 제어 레벨 9 일에 접근했다. 오차 막대는 왼쪽 (없이) 및 (오른쪽) 파편 ± SEM C)하는 Hemolymph 샘플을 나타냅니다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg"대상 = "_ 빈"HREF>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혈구 면역. 혈구 세포 유전자 발현 GFP 순환 그림 2. 수집 및 coverslip에 고정되었다. plasmatocyte 특정 항체는 얼룩 plasmatocytes (빨간색)에 사용되었다. DAPI 염색은 파란색으로 표시됩니다. 변경되지 않은 이미지는 형광 현미경 (왼쪽)와 함께 찍은. 디콘 볼 루션 (오른쪽) 후 동일한 이미지. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생체 내에서 그림 3 A) 애벌레 전에 가열 PCR 튜브에 각각 배치했다. . 빨간색 화살표는 튜브의 바닥 B) 가열 후 일반적인 액정 셀의 melanization 패턴, 때로는 화살표 림프 글 랜드를 (계시에없는 애벌레를 표시, 등의 측면, 전방)는 왼쪽이다 도시. 스케일 바 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 애벌레 림프 글 랜드 면역. A) 지느러미 용기 (DV), 주 로브 (1 °), 및 보조 로브 (2 °)를 보여주는 세 번째 령 애벌레 림프 글 랜드의 DIC 이미지입니다. 스케일 바는 100 μm의. B) 대표 셋째 령 애벌레 림프 글 랜드 F를 나타냅니다롬 유전자 후방 신호 중심의 수질 영역과 GFP의 EBFP2을 표현하는 애벌레. 림프 글 랜드는 노치 세포 내 도메인 (적색)에 대한 항체로 염색했다. 변경되지 않은 이미지는 형광 현미경 (위)로 촬영. 디컨 볼 루션 (아래) 후 같은 이미지. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유전 적 또는 환경 변화에 따라, 여기에 설명 된 네 가지 방법은 신호, 생존, 증식 및 분화와 같은 조혈 동안 별개 프로세스를 분석하기 위해 개별적으로 또는 함께 사용할 수 초파리 조혈 동적 프로세스이다.; 동물 당 혈구 세포의 수가 증가하고 35 임파선의 구조 및 유전자 발현이 발달 동안에 32를 변경한다. 이러한 분석을 수행하기 이전에, 따라서, 고정 된 시간에 대한 산란 원하는 유충 발달 단계를 확인 암컷시킴으로써 달걀 모음을 제한하는 것이 중요하다. 짧은 계란 컬렉션 (이하 6 시간) 또는 여성이 건강에 해로운 또는 부족한되는 인스턴스를 들어, 달걀 누워는 음식에 균열을 생성하여 격려 할 수있다. 이는 에탄올 세정 주걱 음식의 부분을 제거함으로써 달성 될 수있다. 를 초과하는 액체 식품에 축적 경우, 사용 조직을 흡수하기 위해 잎사귀액체. (그림 1A를 참조하십시오.)
혼자, 여기에 설명 된 방법은 한계가있다. 예를 들어, 순환 혈구 농도를 측정하는 혈구의 생존 또는 증식의 변화를 포착하지만, 혈구의 계보 배포 또는 유전 적 또는 환경 변화에 필연적 할 수있는 혈통 중단에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 반대로, 순환 혈구 세포의 면역 조직 화학은 체액의 특정 혈구 계통에 있지만, 절대, 상대하지 수의 변화를 보여준다. 생체 내에서, 액정 셀의 melanization은 액정 셀 분포가 가변적이고 정착 혈구 세포가 8,10 동적으로 정량하는 것이 어렵다. 오히려 여러 사람들은 맹목적으로 액정 셀의 melanization 점수를해야합니다. 마지막으로, 관찰은 반드시 다른 구획에 성립하지 않을 수 있습니다 하나의 혈구 실에서했다.
함께 사용될 때,이 분석은 유전자를 구별하기 위해 적용될 수있다유전자 발현 또는 분화를 조절하는 것과 증식 또는 생존을 조절 틱 변경. 예를 들어, 유전 적 변형은 혈구 농도가 증가하지만 혈구 계통의 상대적인 비율이 동일하게 유지되도록 혈구 세포의 증식을 증가시킬 수있다. 또는, 유전 적 변화는 전체 혈구 농도에 아무런 효과가 특정 계보에 혈구 분화의 변화를 홍보 할 수 있습니다. 결정 세포군은 생체 melanization 방법을 이용하여 유전자 스크린 유전자 상호 작용 연구를 용이하게 심문 빠르고 쉽게 할 수있다. 이 방법은 prophenoloxidase 1 (PPO1라고도 검정 세포, bc)를 이용하는 유전 연구 돌연변이 대립 유전자 또는 액정 셀 - 특이 적 항체를 이용하여 면역 조직 화학 분석법 확증에 사용될 수있다. 애벌레 림프 글 랜드는 조혈 세포 과정에 대한 비슷한 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 다수의신호 전달 경로를 설정하고 림프 글 랜드 및 주요 영역을 유지에 참여하고 있습니다. 각 영역은 애벌레 조혈의 고유 한 유전자 발현과 기능을 가지고있다. 또한, 림프 글 랜드를 이용하면 림프 글 랜드 지역 또는 림프 글 랜드 혈구 세포 내에서 자율이 아닌 자율적 인 기능을 표시 할 수 있습니다.
초파리의 조혈 연구를위한 관련 방법은 최근 26, 27 포괄적 인 텍스트 기반 리소스를 컴파일하고 있습니다. 필드에 필수 불가결하지만, 이러한 자원은 범위가 제한된다. 혈구 농도를 측정하는 방법은, 예를 들면, 포함되지 않았다. 작성 방법, 특히 기술 해부 기술은 빠르게 마스터에 도전 할 수있다. 추가 기여 방법을 지원하기 위해 시각적 자료를 제공되었습니다,하지만 여전히 수의 범위 (28, 29)에 제한되었다. 또한 포괄적이지, 자원 avai에 추가하면서 방법은 여기에 설명초파리의 조혈의 연구에 도움이 lable가.
우리는 수정 및 기존 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 예를 들어, 증가 된 속도, 용이성 및 객관성을 포함하는 자동 세포 계수기가 아닌 수동 혈구와 혈구 농도를 측정하는 여러 가지 이점이있다. 우리의 경험에 의하면, 액정 셀 시각화 유충 가열 수조를 사용하여 유충들이 발생되는 튜브에서 가열 특히 널리 변수 결과 결과. 개별 PCR 튜브에 열 유충은 적은 변수보다 재현 가능한 결과를 얻었다. 림프 글 랜드 해부 방법은 이전에 서면 프로토콜 (26)에 설명하지만, 여기에 설명 된 기존의 시각 참조 (28)에 대한 대안을 제공합니다. 공 초점 현미경에 대한 접근이 제한되어있는 경우 마지막으로, 우리는 표준 형광 이미지의 디컨 볼 루션은 공 촛점 이미지에 대한 적절한 대체 할 수 있음을 시사한다. Deconvoluti알고리즘을 제거하거나 광 종래 형광 현미경에 의하여 촬영 포커스 아웃 재 할당, 해상도 향상, 공 초점 현미경에 의한 포커스 아웃 광의 제거 원칙적 유사한 대비, 2 차원 및 3에 적용 할 수 있습니다 차원 (Z-스택) 이미지. 일부 응용 프로그램의 경우, 여기에 입증 된 바와 같이, 디컨 볼 루션 극적으로 기존의 형광 현미경으로 촬영 한 이미지를 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
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