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Developmental Biology

तरीके लसीका ग्रंथि और hemocytes में जांच Published: November 28, 2016 doi: 10.3791/54544
Automatic Translation
1,2, 1,2
1The Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Oncological Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoietic सिस्टम कई आम सुविधाओं का हिस्सा है, hematopoiesis अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक ड्रोसोफिला आनुवंशिक मॉडल बना रही है। यहाँ हम विच्छेदन और immunohistochemistry के लिए प्रमुख लार्वा hematopoietic अंग के बढ़ते प्रदर्शित करता है। हम यह भी घूम hemocytes और बिना डंठल क्रिस्टल कोशिकाओं सहित विभिन्न लार्वा hematopoietic डिब्बों की परख के लिए विधियों का वर्णन।

Abstract

कई समानताएं ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoietic प्रणालियों के बीच मौजूद हैं, भले ही ड्रोसोफिला लसीकावत् वंश कि स्तनधारी प्रतिरक्षा अनुकूली को चिह्नित की कमी है। ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoiesis spatially और अस्थायी अलग चरणों में होते हैं कई रक्त सेल प्रजातियों के उत्पादन के लिए। दोनों प्रणालियों रक्त कोशिका पूर्वज जो साथ विस्तार या परिपक्व प्रजातियों को बदलने के लिए के जलाशयों बनाए रखें। Hematopoietic प्रणाली ड्रोसोफिला और स्तनधारियों के लिए प्रतिक्रिया करने और प्रतिरक्षा चुनौतियों के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, transcriptional नियामकों और संकेत मार्ग है कि उत्पादन, रखरखाव, और hematopoietic प्रणाली के समारोह को नियंत्रित स्तनधारियों के लिए मक्खियों से संरक्षित कर रहे हैं। इन समानताओं ड्रोसोफिला आनुवंशिक रूप से मॉडल hematopoietic विकास और रोग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं।

यहाँ हम विस्तार assays ड्रोसोफिला लार्वा की hematopoietic प्रणाली की जांच करने के लिए। मेंविशेष रूप से, हम, रक्त कोशिका की संख्या और एकाग्रता को मापने विवो में एक विशिष्ट परिपक्व वंश कल्पना है, और संचलन में और hematopoietic अंग में रक्त कोशिकाओं पर immunohistochemistry प्रदर्शन करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार। ये assays जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और संकेतन, अस्तित्व, प्रसार, और भेदभाव सहित सेलुलर प्रक्रियाओं प्रकट कर सकते हैं और hematopoiesis संबंधित प्रश्नों की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रोसोफिला में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, इन assays परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तन पर hematopoietic प्रणाली का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि विशेष रूप से यहां नहीं उल्लिखित, इन assays भी इस तरह के संक्रमण या आहार के रूप में पर्यावरण परिवर्तन, के प्रभाव, hematopoietic प्रणाली पर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

जटिल प्रतिलेखन कारक और संकेत रास्ते कि hematological रोगों में hematopoietic प्रणाली के विकास और कहा कि खराबी के समन्वय के विनियमन तंत्र खराब समझ रहते हैं। ये प्रतिलेखन कारक है और संकेत दे रास्ते के साथ-साथ उनके विनियमन, अत्यधिक ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoiesis 1-5 के बीच संरक्षित कर रहे हैं। इस प्रकार ड्रोसोफिला hematopoietic प्रणाली hematopoiesis और अंतर्निहित hematological रोगों को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है।

स्तनधारियों के लिए इसी प्रकार, ड्रोसोफिला hematopoiesis की spatially और अस्थायी अलग चरणों में रक्त कोशिकाओं, hemocytes कहा जाता है, उत्पन्न करते हैं। परंपरागत रूप से, ड्रोसोफिला hematopoiesis भ्रूण mesoderm में और लार्वा लसीका ग्रंथि में चरणों के लिए प्रतिबंधित किया गया था। कि hematopoiesis भी लार्वा बिना डंठल CLU में होता है हाल के अध्ययनों से सबूत उपलब्ध करानेsters और 6-8 पेट वयस्क में। plasmatocytes और क्रिस्टल कोशिकाओं: सभी hematopoietic चरणों परिपक्व hemocytes के दो प्रकार का उत्पादन। Plasmatocytes phagocytosis, सहज प्रतिरक्षा, और घाव भरने में शामिल मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह कर रहे हैं। क्रिस्टल कोशिकाओं समर्थक phenoloxidases melanization, कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और घाव भरने में इस्तेमाल के लिए एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक होते हैं। लार्वा hematopoiesis एक तिहाई परिपक्व hemocyte प्रकार उत्पन्न कर सकते हैं, एक lamellocyte बुलाया ऐसे परजीवी ततैया संक्रमण 9,10 के रूप में कुछ प्रतिरक्षा चुनौतियों के जवाब में। Lamellocytes बड़े, पक्षपाती कोशिकाओं कि समारोह, plasmatocytes और क्रिस्टल कोशिकाओं के साथ संयोजन के रूप में, encapsulate और ड्रोसोफिला लार्वा में रखी ततैया अंडे को बेअसर करने के लिए कर रहे हैं। parasitization के अभाव में, lamellocytes जंगली प्रकार लार्वा में नहीं पाए जाते हैं। Melanotic जनता melanized, समझाया ततैया अंडे जैसे लगते हैं; कई उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला उपभेदों parasitization के अभाव में melanotic जनता का विकास। lamello की उपस्थितिcytes और / या melanotic जनता hematopoietic असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। वास्तव में, बड़े पैमाने पर melanotic phenotype जीन और रास्ते hematopoiesis 11-14 में शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

लार्वा hematopoietic प्रणाली सबसे बड़े पैमाने पर तारीख करने के लिए अध्ययन किया है। यह hemolymph में घूम hemocytes के शामिल है, बिना डंठल hemocyte समूहों छल्ली तहत नमूनों, और hemocytes लसीका ग्रंथि में रहने वाले। लसीका ग्रंथि द्विपक्षीय पृष्ठीय पोत से जुड़ी पालियों की एक श्रृंखला है। लसीका ग्रंथि के प्रत्येक प्राथमिक पालि तीन मुख्य क्षेत्रों में विभाजित है। सबसे बाहरी क्षेत्र cortical क्षेत्र के रूप में जाना जाता है और hemocytes परिपक्व होता है। अंतरतम क्षेत्र दिमाग़ी क्षेत्र कहा जाता है और मौन hemocyte व्यापारियों के शामिल है। तीसरे जोन, पीछे संकेत केंद्र, लसीका ग्रंथि है कि एक स्टेम सेल की तरह आला के रूप में कार्य के आधार पर कोशिकाओं का एक छोटा सा समूह है। प्रारंभिक कार्य पायदान 15-18 के लिए महत्वपूर्ण कार्यों की स्थापना 19,20, जे ए-स्टेट 18, और 21 Wingless गतिविधि लार्वा लसीका ग्रंथि विकास को विनियमित करने के लिए। हाल के अध्ययनों ने दिखा दिया है कि बीएमपी 22, FGF-रास 23, और हिप्पो 24,25 सिगनल भी लार्वा लसीका ग्रंथि के भीतर कार्य करते हैं।

चार लार्वा hematopoietic यहाँ रेखांकित assays 1) घूम hemocyte एकाग्रता, प्रति इकाई मात्रा कोशिकाओं की संख्या के रूप में परिभाषित मापने, 2) को अलग-थलग और फिक्सिंग immunohistochemistry के लिए घूम hemocytes, 3) विवो में क्रिस्टल कोशिकाओं visualizing, और 4) विदारक, फिक्सिंग, और बढ़ते वर्णन लसीका ग्रंथियों immunohistochemistry के लिए। ये assays hematopoietic readouts कार्यों और लार्वा hematopoietic प्रणाली में रास्ते के संकेत के नियमों का आकलन करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन तरीकों के क्षेत्र में पहले से इस्तेमाल किया गया है, इन assays के दृश्य प्रलेखन हाल ही में 8,26-30 शुरू हो गया है। यहाँ उद्धृत कई प्रकाशनों मदद कर रहे हैंful संसाधनों इसी तरह के तरीकों और hematopoietic मार्कर 26,31-33 का वर्णन है। इसके अतिरिक्त, Trol और वाइकिंग लसीका ग्रंथि तहखाने झिल्ली के उपयोगी मार्करों हैं।

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Protocol

1. परिसंचारी hemocyte एकाग्रता

  1. 6 घंटा - इस परख के लिए लगभग एक ही विकास मंच के लार्वा को प्राप्त करने के लिए, महिलाओं 2 के एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे देना करने की अनुमति देकर अंडा संग्रह सीमित।
  2. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 1 टेबल) के साथ भरा पकवान कुओं विदारक में लार्वा लीजिए।
  3. प्रत्येक लार्वा के लिए, बर्फ पर एक microcentrifuge ट्यूब में पीबीएस 1x 10 μl और एक साफ विदारक पैड पर पीबीएस 1x 10 μl जगह है। एक प्रबुद्ध stereomicroscope आधार पर विदारक पैड रखें।
  4. एक ऊतक पर रखकर एक व्यक्ति के लार्वा सूखी विच्छेदन पैड पर एक पीबीएस ड्रॉप करने के लिए इसे स्थानांतरित करने से पहले साफ कर लें।
  5. संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग, धीरे खुला आंसू और ध्यान से छल्ली hemolymph जारी करने के लिए पलटना।
    नोट: देखभाल परिमार्जन या छल्ली प्रहार के रूप में इस संभावित बिना डंठल hemocytes 29 जारी कर सकता करने के लिए नहीं ले लो।
  6. एक pipet का उपयोग करना, विदारक पैड से hemolymph इकट्ठा। सह बचेंइस तरह के वसा शरीर के रूप में लार्वा मलबे llecting।
  7. एक microcentrifuge ट्यूब hemolymph जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    नोट: कई नमूने एक बार में एकत्र किया जा सकता है और एक घंटे तक के लिए बर्फ पर रखा।
  8. वैकल्पिक: बराबर भागों में hemolymph नमूना डाई और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के साथ Trypan नीले रंग मिलाएं। क्योंकि यह कोशिकाओं को विषाक्त है Trypan नीले जोड़ने के 3 मिनट के भीतर कोशिकाओं की गणना।
  9. ऊपर pipetting द्वारा और एक hemocytometer कक्ष में 10 μl लोड करने से पहले नीचे नमूना मिक्स।
  10. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करते हैं, तो सेल आकार और घेरा के लिए उपयुक्त मानकों की स्थापना की। 80% गोलाई सामान्य, गोल hemocytes 34 का पता लगाने के लिए - उदाहरण के लिए, 2 माइक्रोन की एक न्यूनतम सेल आकार, 22 माइक्रोन की एक अधिकतम सेल आकार, और 75 का एक घेरा निर्धारित किया है। विभिन्न मापदंडों के साथ प्रयोग ऐसे lamellocytes के रूप में बड़ा है और धुरी के आकार hemocytes, पता लगाने के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक hemocytometer का उपयोग मैन्युअल hemocytes गिनती करने के लिए।

2. परिculating hemocyte Immunohistochemistry

  1. 6 घंटा - इस परख के लिए लगभग एक ही विकास मंच के लार्वा को प्राप्त करने के लिए, महिलाओं 2 के एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे देना करने की अनुमति देकर अंडा संग्रह सीमित।
  2. एक 6 या 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एक coverslip रखें।
    नोट: स्क्वायर coverslips (22 मिमी) 6 अच्छी तरह प्लेटें और दौर coverslips (18 मिमी व्यास) में फिट 12 अच्छी तरह प्लेटों में फिट बैठते हैं।
  3. 1x पीबीएस के साथ भरा पकवान कुओं विदारक में लार्वा लीजिए।
  4. प्रत्येक coverslip के केंद्र में 5 μl 1x पीबीएस रखें।
  5. एक प्रबुद्ध stereomicroscope आधार पर थाली रखें।
  6. एक ऊतक पर एक व्यक्ति के लार्वा सूखी पोंछे और फिर coverslip पर पीबीएस में जगह है।
  7. संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग, धीरे आंसू और ध्यान से छल्ली पलटना। लार्वा शव को हटाने से पहले, यह उपयोग में समान रूप से hemolymph प्रसार करने के लिए।
    नोट: देखभाल परिमार्जन या छल्ली प्रहार के रूप में इस संभावित बिना डंठल hemocytes 29 जारी कर सकता करने के लिए नहीं ले लो।
  8. repeaसभी लार्वा के लिए टी, coverslip प्रति एक लार्वा के hemolymph का संग्रह। Hemocytes 5 के लिए coverslips का पालन करने की अनुमति दें -। कमरे के तापमान आरटी पर 8 मिनट निर्धारण से पहले 30 मिनट से अधिक नहीं है।
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रत्येक coverslip के लिए 7.5% formaldehyde (तालिका 1) के 5 μl जोड़कर hemocytes को ठीक करें।
  10. धो 1x पीबीएस के साथ तीन बार coverslips। प्लेट युक्ति और प्रत्येक धोने के बाद पीबीएस aspirate। अगले चरण में permeabilization समाधान की रन ऑफ रोकने के लिए, coverslips की परिधि से अतिरिक्त पीबीएस दूर करने के लिए खींचने की मशीन का उपयोग करें।
  11. आरटी पर 20 मिनट के लिए प्रत्येक coverslip के लिए 100 μl permeabilization समाधान (तालिका 1) जोड़ें।
  12. युक्ति और धीरे प्लेट permeabilization समाधान निकालना नल।
  13. एंटीबॉडी समाधान (तालिका 1) प्रदाता की विशेषताओं के अनुसार के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। 12 अच्छी तरह से प्लेटों में कम से कम 500 μl coverslips के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें।6 अच्छी तरह प्लेटों में कम से कम 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं।
  14. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और एक कक्षीय प्रकार के बरतन, तीन बार 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ coverslips धो लें।
  15. प्रदाता की विशेषताओं के अनुसार एंटीबॉडी समाधान के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी पतला। 12 अच्छी तरह प्लेटें में coverslips करने के लिए कम से कम 500 μl माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए कम से कम 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  16. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और coverslips 2.10 कदम, तीन बार के रूप में एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस से धो लें।
  17. धोने कदम के दौरान साफ कांच माइक्रोस्कोप 70% इथेनॉल (तालिका 1) ऊतक पोंछे का उपयोग के साथ स्लाइड। प्रत्येक coverslip के लिए, कांच स्लाइड पर 5 μl बढ़ते बफर (तालिका 1) जगह है।
    नोट: दो coverslips एक स्लाइड पर फिट बैठते हैं।
  18. अंतिम पीबीएस धोने aspirate।
  19. संदंश का प्रयोग सावधानी से प्लेट और जगह, चालान से coverslips दूर करने के लिएerted, बढ़ते बफर के शीर्ष पर।
    नोट: खुर्दबीन स्लाइड इमेजिंग के लिए पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। अधिकतम भंडारण के समय इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की स्थिरता पर निर्भर करता है। 6 और 12 अच्छी तरह प्लेटें rinsed और पुन: उपयोग किया जा सकता है।

3. विवो क्रिस्टल सेल melanization में

  1. इस परख के लिए लगभग एक ही विकास मंच के लार्वा को प्राप्त करने के लिए, महिलाओं के 2-6 घंटे की एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे देना करने की अनुमति देकर अंडा संग्रह सीमित।
  2. शुरुआत से पहले, 60 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग स्रोत निर्धारित किया है।
    नोट: 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के एक थर्मल साइक्लर कार्यक्रम (एक 25 डिग्री सेल्सियस पकड़ के बाद) सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन जैसा कि गर्मी लगातार और समान रूप से प्रत्येक लार्वा पर वितरित किया जाता है कि एक पानी के स्नान या अन्य हीटिंग स्रोत के रूप में लंबे समय के लिए पर्याप्त है।
  3. 1x पीबीएस (तालिका 1) के साथ भरा पकवान कुओं विदारक में लार्वा लीजिए।
  4. एक समय में एक, सूखी एक ऊतक पर एक लार्वा एक पीसीआर ट्यूब के नीचे पोंछे और जगह। प्रत्येक लार्वा रखेंएक अलग पीसीआर ट्यूब में। (चित्रा 3A देखें।)
  5. अनुरूप परिणाम के लिए, यह सुनिश्चित पीसीआर नलियों के तल पर कि लार्वा रहने के लिए 10 4 डिग्री सेल्सियस पर नलियों में लार्वा द्रुतशीतन द्वारा - 15 मिनट और / या धीरे ट्यूबों दोहन हीटिंग से पहले।
  6. थर्मल साइक्लर (या पानी से स्नान) में पीसीआर ट्यूबों रखें। 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी।
  7. ध्यान से ताजा 1x पीबीएस के साथ भरा पकवान कुओं विदारक में पीसीआर ट्यूब से लार्वा को हटा दें।
  8. एक ऊतक पर सूखी लार्वा पोंछे और एक stereomicroscope के तहत इमेजिंग के लिए एक फ्लैट सतह पर व्यवस्था।
  9. लार्वा की छवियों स्कोर आँख बंद करके कई व्यक्तियों द्वारा।

4. लारवल लसीका ग्रंथि Immunohistochemistry

नोट: लसीका ग्रंथि थोड़ा पृष्ठीय पक्ष पर मस्तिष्क के नीचे एक लार्वा के पूर्वकाल छोर से लगभग एक तिहाई लंबाई स्थित है। (चित्रा 3 बी में तीर देखें।) लसीका ग्रंथि पृष्ठीय पोत flanks और सबसे आसानी से मुंह हू से जुड़ी विच्छेदित हैकेएस या मस्तिष्क के लिए। जंगली प्रकार, तीसरे instar लसीका ग्रंथियों बहुत छोटे संरचनाओं हैं; लंबाई में 200 माइक्रोन - प्राथमिक पालियों लगभग 100 हैं। (चित्रा -4 ए देखें।)

  1. 6 घंटा - इस परख के लिए लगभग एक ही विकास मंच के लार्वा को प्राप्त करने के लिए, महिलाओं 2 के एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे देना करने की अनुमति देकर अंडा संग्रह सीमित।
  2. लसीका ग्रंथि विच्छेदन
    1. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर (तालिका 1) जोड़ें।
    2. 0.1% PBST (तालिका 1) की 1 बूंद प्रत्येक अच्छी तरह से एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipet का उपयोग करने के लिए जोड़ें।
      नोट: डिटर्जेंट, इस तरह के बीच 20 के रूप में, सतह तनाव कम करने के लिए जोड़ा जाता है ऊतक अच्छी तरह से नीचे सिंक करने की इजाजत दी।
    3. प्लेट बर्फ पर फ्लैट रखें।
    4. 1x पीबीएस के साथ भरा पकवान कुओं विदारक में लार्वा लीजिए।
    5. एक प्रबुद्ध stereomicroscope आधार पर एक साफ विदारक पैड रखें। smal जगह के लिए एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipet का प्रयोग करेंएल पैड पर 0.01% PBST (तालिका 1) के चला जाता है। विच्छेदन के लिए एक PBST ड्रॉप करने के लिए एक लार्वा स्थानांतरण।
    6. संदंश की एक जोड़ी लगभग पीछे अंत से एक-चौथाई लंबाई, पृष्ठीय पक्ष के साथ लार्वा पकड़ो।
    7. हड़पने के लिए छल्ली तुरंत संदंश कि लार्वा धारण कर रहे हैं के लिए पूर्वकाल संदंश की एक और जोड़ी का प्रयोग करें। धीरे पूर्वकाल अंत की ओर छल्ली खींच जब तक मुंह हुक सामने आ रहे हैं।
      ध्यान दें: उद्देश्य किसी भी आंतरिक संरचनाओं के बिना परेशान छल्ली छील करने के लिए है।
    8. छल्ली जारी है और दो में कटौती करने के लिए लार्वा दोनों संदंश का उपयोग करें। PBST बूंद से पीछे अंत निकालें।
      नोट: छल्ली मुंह हुक करने के लिए सभी तरह से छील नहीं करता है, तो दो में लार्वा में कटौती और पीछे के अंत को हटा दें। छल्ली के किनारे पकड़ है, और खोलने के माध्यम से मुँह हुक करने के लिए धक्का संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। इस छल्ली पलटना और बेनकाब मुंह हुक होगा। यह एक altern के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताविच्छेदन विधि खाया के रूप में अच्छी तरह से।
    9. स्थिरता के लिए छल्ली (या तो उदर छल्ली, पृष्ठीय छल्ली फ्लैप, या दोनों) के लिए नीचे पिन संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करें।
    10. उजागर मुंह हुक हड़पने के लिए और धीरे से उन्हें बाहर खींच संदंश की एक और जोड़ी का प्रयोग करें।
      नोट: यह आंतरिक संरचनाओं से छल्ली अलग कर देगा। आदर्श रूप में, नेत्र / antennal imaginal डिस्क, मस्तिष्क, अंगूठी ग्रंथि है, और लसीका ग्रंथि पृष्ठीय पोत flanking मुंह हुक से जुड़ी रहेगी।
    11. अभी भी मुंह हुक धारण करते हुए, ध्यान से इस तरह लार ग्रंथियों, वसा शरीर, और आंत के रूप में अवांछित संरचनाओं को हटा दें।
      ध्यान दें: मस्तिष्क मुंह हुक से अलग करती हैं, लसीका ग्रंथि अभी भी से जुड़ी है और मस्तिष्क के साथ एकत्र किया जा सकता है। इस मामले में, उदर तंत्रिका कॉर्ड के बजाय मुंह हुक पकड़ो।
    12. मुंह हुक या संभाल के रूप में उदर तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग करना, विच्छेदित जटिल बर्फ पर अच्छी तरह से करने के लिए लसीका ग्रंथि युक्त हस्तांतरण। 30 मिनट से अधिक नहीं हैनिर्धारण से पहले।
  3. फिक्सेशन और immunohistochemistry
    1. stereomicroscope आधार पर 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
    2. एक P200 पिपेट का प्रयोग सावधानी से अच्छी तरह से PBST हटा दें।
      नोट: खाली, पड़ोसी कुओं अस्थायी रूप से अपशिष्ट जमा करने के लिए उपयोगी होते हैं।
    3. धीरे अच्छी तरह से नीचे की ओर 200 μl 3.7% formaldehyde (तालिका 1) जोड़ सकते हैं और थाली ज़ुल्फ़ सुनिश्चित करने के लिए कि विच्छेदित ऊतकों पूरी तरह से डूबे हुए हैं।
    4. 30 मिनट के लिए बर्फ थाली लौटें। लसीका ग्रंथियों फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओं) को व्यक्त करते हैं, तो प्लेट photobleaching को रोकने के लिए कवर रखने के लिए।
    5. एक P200 पिपेट का प्रयोग सावधानी से लगानेवाला हटा दें।
    6. अच्छी तरह से करने के लिए 200 μl 1x पीबीएस जोड़ने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली रखकर धो लें। एक P200 पिपेट का प्रयोग सावधानी से पीबीएस हटा दें।
      नोट: फिक्स्ड लसीका ग्रंथियों लसीका ग्रंथियों तक पीबीएस में बर्फ पर छोड़ा जा सकता है के लिए सभी प्रयोगात्मक शर्तों रहे हैं घissected और तय की।
    7. दोहराएँ धोने दो बार कदम।
    8. 200 μl permeabilization समाधान (तालिका 1) अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। आरटी पर 45 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली सेट करें।
      नोट: 45 मिनट "सोने के मानक 'लसीका ग्रंथि permeabilization के लिए है, लेकिन लेखकों केवल 20 मिनट के बाद सफलता है।
    9. एक P200 विंदुक के साथ समाधान निकालें।
    10. एंटीबॉडी समाधान (तालिका 1) प्रदाता की विशेषताओं के अनुसार के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। अच्छी तरह से करने के लिए 300 μl प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित ऊतकों पूरी तरह से डूबे हुए हैं। 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं।
    11. प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने के लिए एक P200 पिपेट का प्रयोग करें।
    12. अच्छी तरह से करने के लिए 200 μl 1x पीबीएस जोड़ने और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली रखकर धो लें। एक P200 पिपेट का प्रयोग सावधानी से पीबीएस हटा दें।
    13. दोहराएँ धोने दो बार कदम।
    14. माध्यमिक एक पतलाप्रदाता की विशेषताओं के अनुसार एंटीबॉडी समाधान के साथ ntibody। अच्छी तरह से करने के लिए 300 μl माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित ऊतकों पूरी तरह से डूबे हुए हैं। आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर सेते हैं।
    15. माध्यमिक एंटीबॉडी हटाने और कदम 4.3.12 और 4.3.13 में वर्णित के रूप में धोने के लिए एक P200 पिपेट का प्रयोग करें। अंतिम धोने के बाद पीबीएस न निकालें।
  4. ग्रंथि बढ़ते लसीका
    1. स्वच्छ कांच माइक्रोस्कोप 70% इथेनॉल (तालिका 1) और ऊतक पोंछे का उपयोग स्लाइड।
    2. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, कांच की स्लाइड पर बढ़ते बफर (तालिका 1) की एक बूंद जगह है।
      नोट: दो की स्थिति एक स्लाइड पर फिट बैठते हैं। बफर मात्रा बढ़ते पर लसीका ग्रंथियों की संख्या मुहिम शुरू हो निर्भर करता है। 20 लसीका ग्रंथियों, 10 के लिए 1 μl - - 12, और 5 या उससे कम के लिए 0.5 μl लगभग 18 के लिए 2 μl का प्रयोग करें।
    3. एक प्रबुद्ध stereomicroscope आधार पर खुर्दबीन स्लाइड रखें।
    4. एक समय में दो की स्थिति के लिए, लसीका ग्रंथियों के सभी अच्छी तरह से बढ़ते बफर करने के लिए संदंश के साथ एक संभाल के रूप में मुंह हुक या उदर तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग कर हस्तांतरण।
    5. अंतरिक्ष विच्छेदित एक परिपत्र या आयताकार आकार में समान रूप से ऊतकों, इस प्रक्रिया में बढ़ते बफर फैल गया।
    6. विच्छेदित ऊतकों से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत रूप से, पृष्ठीय पोत के तहत संदंश की एक टोंग स्लाइड और धीरे बढ़ते बफर की परिधि की ओर खींच।
      नोट: यह लसीका विच्छेदित ऊतकों के बाकी हिस्सों से बाहर ग्रंथि और कांच पर लसीका ग्रंथि समतल आकर्षित करेगा।
    7. संदंश की एक टोंग और एक काटने का कार्य गति का उपयोग करना, लसीका ग्रंथि और दिमाग के बीच पृष्ठीय पोत काटा।
    8. बफर की सबसे बाहरी किनारे पर, लसीका ग्रंथि के विपरीत पक्ष को विच्छेदित ऊतकों के बाकी ले जाएँ।
      नोट: अवांछित विच्छेदित ऊतकों अंततः लसीका ग्रंथियों के चारों ओर एक परिधि फार्म और जो पर एक सहायता के रूप में काम करेगाज coverslip आराम करेंगे।
    9. दोहराएँ जब तक लसीका ग्रंथियों के सभी विच्छेदित ऊतकों से अलग हो रहे हैं, अवांछित विच्छेदित ऊतकों केंद्र में जगह में से एक आरक्षित।
    10. दो उंगलियों के बीच एक coverslip लो। जाँच करें कि coverslip धूल और उंगलियों के निशान से मुक्त है। यदि आवश्यक हो, एक ऊतक पोंछ का उपयोग और 70% इथेनॉल coverslip साफ करने के लिए।
    11. यह सुनिश्चित करना कि coverslip के किनारे गिलास स्लाइड के किनारे के समानांतर है, ध्यान से बढ़ते बफर खत्म coverslip कम।
      नोट: खुर्दबीन स्लाइड इमेजिंग के लिए पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। अधिकतम भंडारण के समय इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की स्थिरता पर निर्भर करता है। 24 अच्छी तरह प्लेटें rinsed और पुन: उपयोग किया जा सकता है।

5. इमेजिंग

  1. छवि hemocytes तय की और निर्माता के ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार 20X या उच्च बढ़ाई एक उचित मानक प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन पर लसीका ग्रंथियों मुहिम शुरू की। एक स्टैंड पर छवि पूरे लार्वा2X बढ़ाई अर्द stereomicroscope निर्माता के ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार।
  2. अगर वांछित deconvolution के लिए सॉफ्टवेयर प्रदाता के निर्देशों का पालन करें।
उपाय रचना भंडारण टिप्पणियाँ
1x पीबीएस 200 मिलीग्राम / एल पोटेशियम क्लोराइड कमरे का तापमान
200 मिलीग्राम / एल पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार
8000 मिलीग्राम / एल सोडियम क्लोराइड
1,150 मिलीग्राम / एल सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय
DH 2 हे
लगानेवाला 3.7% या 1x पीबीएस में 7.5% formaldehyde अंधेरे में कमरे के तापमान संक्रामक विषैला होता है।
Permeabilization समाधान / एंटीबॉडी मंदक 0.4% ट्राइटन 4 डिग्री सेल्सियस मानक सूत्र 0.4% ट्राइटन उपयोग करता है लेकिन लेखकों 0.1% बीच 20 उपयोग सफलता के साथ। 'प्रदाताओं की सिफारिश की सांद्रता अनुसार प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर करने के लिए प्रयोग करें।
5% गोजातीय सीरम albumin, सामान्य बकरी सीरम, या सामान्य गधा सीरम
1x पीबीएस
70% इथेनॉल 70% dH2O में 200 प्रमाण इथेनॉल कमरे का तापमान
बढ़ते बफर 0.5% N-propyl gallate अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस एन-propyl gallate हानिकारक है। DAPI एक उत्परिवर्तजन है।
80% ग्लिसरॉल
वैकल्पिक: 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)
1x पीबीएस
0.1% PBST 0.1% बीच 20 1x पीबीएस में कमरे का तापमान
0.01% PBST 0.1% PBST के 1:10 कमजोर पड़ने कमरे का तापमान

तालिका 1 समाधान इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया।

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Representative Results

Hemocyte एकाग्रता परिसंचारी

Hemocyte संख्या लार्वा विकास 35 के दौरान वृद्धि हुई है। कि इस विधि hemocyte संख्या और एकाग्रता में मतभेद का पता लगाता है उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, जैविक कारण के बावजूद, हम देरी और गैर देरी लार्वा के hemocyte सांद्रता मापा। Prothoracicotropic हार्मोन (ptth) ptth उत्पादक न्यूरॉन्स (ptth> गंभीर) के आनुवंशिक पृथक से की हानि लार्वा विकास 36 में देरी पैदा करता है। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, hemocyte सांद्रता कम से कम 8 अलग-अलग 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया लार्वा के लिए प्रोटोकॉल 1 में वर्णित के रूप में मापा गया। एक 2 घंटा अंडा संग्रह के बाद 120 मानव संसाधन में देरी लार्वा प्रति औसत hemocyte एकाग्रता (ptth> गंभीर) नियंत्रण लार्वा (ptth) प्रति औसत hemocyte एकाग्रता से कम है। केवल 9 दिनों के बाद प्रति नियंत्रण की है कि देरी लार्वा दृष्टिकोण औसत hemocyte एकाग्रता (करता है 37 प्रकाशित किया गया है।

एक स्वचालित सेल काउंटर से ली गई छवियाँ एक साफ, वांछनीय hemolymph नमूना और मलबे, जो गलत माप (चित्रा 1 सी) को जन्म दे सकता युक्त एक नमूना दिखाने के लिए। न्यूनतम और अधिकतम सेल आकार क्रमश: 2 माइक्रोन और 22 माइक्रोन के लिए निर्धारित किया गया। घेरा 75-80% गोलाई के लिए स्थापित किया गया था। इन मानकों के दिशा निर्देशों के रूप में इरादा कर रहे हैं और अनुभव से अनुकूलित किया जाना चाहिए।

Hemocyte Immunohistochemistry परिसंचारी

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त परिसंचारी hemocytes, एकत्र किए गए थे तय है, और incubated plasmatocyte विशिष्ट एंटीबॉडी (P1a और P1b, इस्तवान Ando), 31 का एक मिश्रण के साथ प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में(चित्रा 2)। छवि एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर लिया गया था और अनछुए और विवश चलने का deconvolution के बाद दिखाया गया है। इस उदाहरण में, deconvolution काफी छवि गुणवत्ता में सुधार नहीं किया।

विवो क्रिस्टल सेल melanization में

लार्वा प्रोटोकॉल 3 (चित्रा 3) के रूप में वर्णित पीसीआर नलियों से पहले गर्मी प्रेरित क्रिस्टल सेल melanization के नीचे रखा गया था। लाल तीर नलियों जिसमें लार्वा नीचे से बहुत दूर हैं और असमान गर्म किया जा सकता है का संकेत मिलता है। व्यक्तिगत लार्वा भर में गर्मी के असमान वितरण लार्वा के भीतर क्रिस्टल कोशिकाओं के melanization में परिवर्तनशीलता बढ़ा सकते हैं।

एक जंगली प्रकार लार्वा एक मानक stereomicroscope पर imaged गर्मी प्रदर्शन के बाद बिना डंठल समूहों में melanized क्रिस्टल कोशिकाओं की खासियत पैटर्न (पता चलता हैचित्रा 3 बी)। लसीका ग्रंथि में Melanized क्रिस्टल कोशिकाओं कभी कभी देखा जाता है।

लार्वा लसीका ग्रंथि Immunohistochemistry

तीसरे instar लार्वा लसीका ग्रंथियों, विच्छेदित कर रहे थे तय है, और घुड़सवार प्रोटोकॉल 4 में वर्णित के रूप में एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर लिया छवि प्राथमिक और माध्यमिक लसीका ग्रंथि पृष्ठीय पोत (चित्रा 4 ए) flanking पालियों पता चलता है।

एक लसीका ग्रंथि जिसमें मस्तिष्क का क्षेत्र और पीछे संकेत केंद्र आनुवंशिक रूप से बढ़ाया नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EBFP2) और GFP के साथ चिह्नित किया गया, क्रमशः, के रूप में पायदान intracellular डोमेन के खिलाफ एक एंटीबॉडी (C17.9C6, विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक) के साथ सना हुआ था प्रोटोकॉल में वर्णित 4. जेड ढेर छवियों एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर ले जाया गया। एक भी अधिकतम int ensity प्रक्षेपण छवि अनछुए और विवश चलने का deconvolution (चित्रा 4 बी) के बाद प्रकट होता है। इस उदाहरण में, deconvolution काफी गुणवत्ता और छवि का विस्तार सुधार हुआ है।

आकृति 1
चित्रा 1. hemocyte एकाग्रता। ए) मानक ड्रोसोफिला मध्यम के एक हिस्से को हटा दिया गया था परिसंचारी (दाएं) एक 2 घंटा अंडा संग्रह अवधि। बी) के प्रति विकासात्मक देरी लार्वा औसत hemocyte एकाग्रता (ptth> गंभीर) की तुलना में कम था के दौरान अंडे बिछाने बढ़ावा देने के लिए नियंत्रण लार्वा (ptth) अंडे बिछाने (AEL) के बाद 120 मानव संसाधन के प्रति औसत hemocyte एकाग्रता। देरी लार्वा प्रति औसत hemocyte एकाग्रता नियंत्रण के स्तर का दरवाजा खटखटाया 9 दिनों AEL। त्रुटि सलाखों के बिना (बाएं) और (दाएं) मलबे ± SEM सी) Hemolymph नमूने प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों 0.1 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं।href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. घूम hemocyte Immunohistochemistry। Hemocytes आनुवंशिक रूप से व्यक्त GFP एकत्र की है और एक coverslip करने के लिए तय किया गया। एक plasmatocyte विशिष्ट एंटीबॉडी दाग ​​plasmatocytes (लाल) के लिए इस्तेमाल किया गया था। DAPI धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है। अनछुए छवि एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (बाएं) के साथ लिया। deconvolution (दाएं) के बाद एक ही छवि। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. विवो में ए) लार्वा हीटिंग से पहले पीसीआर नलियों में व्यक्तिगत रूप से रखा गया था। । लाल तीर लार्वा कि) ट्यूबों के नीचे बी हीटिंग के बाद एक ठेठ क्रिस्टल सेल melanization पैटर्न है, जो कभी कभी लसीका ग्रंथि (तीर से पता चलता है पर नहीं हैं संकेत मिलता है; पृष्ठीय पक्ष दिखाया गया है, पूर्वकाल छोड़ दिया है)। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. लारवल लसीका ग्रंथि Immunohistochemistry। ए) एक तिहाई instar लार्वा लसीका पृष्ठीय पोत (डीवी), प्राथमिक पालियों (1 °), और माध्यमिक पालियों (2 °) दिखा ग्रंथि का एक डीआईसी छवि। स्केल बार माइक्रोन। 100 बी) के एक प्रतिनिधि तीसरे instar लार्वा लसीका ग्रंथि च का प्रतिनिधित्व करता हैROM एक लार्वा आनुवंशिक रूप से मस्तिष्क का क्षेत्र और पीछे संकेत केंद्र में GFP में EBFP2 व्यक्त। लसीका ग्रंथि पायदान intracellular डोमेन (लाल) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था। अनछुए छवि एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (ऊपर) के साथ लिया। deconvolution (नीचे) के बाद एक ही छवि। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आनुवंशिक या पर्यावरण परिवर्तन करने पर, चार विधियों यहाँ वर्णित व्यक्तिगत रूप से या संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के संकेत दे, अस्तित्व, प्रसार, और भेदभाव के रूप में hematopoiesis दौरान विशिष्ट प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए ड्रोसोफिला hematopoiesis एक गतिशील प्रक्रिया है। पशु प्रति hemocytes की संख्या 35 से बढ़ जाती है और लसीका ग्रंथि की संरचना और जीन अभिव्यक्ति के विकास के दौरान बदलता है 32। इन assays प्रदर्शन करने से पहले, इसलिए, यह समय की एक निश्चित राशि के लिए अंडे देना और वांछित लार्वा विकास मंच पुष्टि करने के लिए महिलाओं की अनुमति देकर अंडा संग्रह को प्रतिबंधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। छोटा अंडा संग्रह (कम से कम 6 घंटा) या उदाहरण है जिसमें महिलाओं को अस्वस्थ या दुर्लभ हैं के लिए के लिए, अंडे बिछाने भोजन में दरारों बनाने के लिए प्रोत्साहित किया जा सकता है। यह एक इथेनॉल-साफ रंग के साथ भोजन के एक हिस्से को हटाने के द्वारा पूरा किया जा सकता है। अतिरिक्त तरल भोजन में जम जाता है, तो उपयोग ऊतक सोख पोंछेतरल। (चित्रा 1 ए देखें।)

हम अकेले हैं, यहाँ वर्णित विधियों सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, घूम hemocyte एकाग्रता को मापने hemocyte अस्तित्व या प्रसार में परिवर्तन को दर्शाता है लेकिन hemocyte वंश वितरण या किसी भी वंश व्यवधान कि आनुवंशिक या पर्यावरण परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकता है के बारे में कोई जानकारी नहीं है। इसके विपरीत, घूम hemocytes की immunohistochemistry hemolymph में विशिष्ट hemocyte प्रजातियों में है, लेकिन केवल, रिश्तेदार, निरपेक्ष नहीं की संख्या में परिवर्तन का पता चलता है। विवो में क्रिस्टल सेल melanization के रूप में क्रिस्टल सेल वितरण चर रहा है और बिना डंठल hemocytes गतिशील 8,10 हैं quantitate के लिए मुश्किल है। दरअसल, कई व्यक्तियों आँख बंद करके क्रिस्टल सेल melanization स्कोर करना चाहिए। अंत में, टिप्पणियों से एक hemocyte डिब्बे में बनाया जरूरी अन्य डिब्बों में सही पकड़ नहीं सकता है।

जब एक साथ इस्तेमाल किया, इन assays जीन भेद करने के लिए लागू किया जा सकताटिक परिवर्तन है कि उन है कि जीन की अभिव्यक्ति या भेदभाव को विनियमित से प्रसार या अस्तित्व को विनियमित। उदाहरण के लिए, एक आनुवंशिक परिवर्तन hemocytes के प्रसार में वृद्धि कर सकते हैं कि इस तरह के hemocyte एकाग्रता बढ़ जाती है लेकिन hemocyte प्रजातियों के रिश्तेदार अनुपात में ही रहता है। वैकल्पिक रूप से, एक आनुवंशिक परिवर्तन समग्र hemocyte एकाग्रता पर कोई प्रभाव के साथ विशिष्ट प्रजातियों में hemocyte भेदभाव में परिवर्तन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। क्रिस्टल सेल की आबादी को जल्दी और आसानी से पूछताछ की जा सकती है, इन विवो melanization विधि का उपयोग आनुवंशिक स्क्रीन और आनुवंशिक बातचीत के अध्ययन की सुविधा। इस विधि आनुवंशिक अध्ययनों कि prophenoloxidase 1 (PPO1, यह भी कहा जाता है काले कोशिकाओं, ई.पू.) का उपयोग उत्परिवर्ती alleles या प्रतिरक्षाऊतकरसायन assays कि क्रिस्टल सेल विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग के साथ मंडन में इस्तेमाल किया जा सकता है। लार्वा लसीका ग्रंथि hematopoietic सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में इसी तरह के सवालों को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बहुतसंकेत दे रास्ते की स्थापना और लसीका ग्रंथि और उसके प्रमुख क्षेत्रों को बनाए रखने में शामिल कर रहे हैं। प्रत्येक जोन अलग जीन अभिव्यक्ति और लार्वा hematopoiesis में कार्य किया है। इसके अतिरिक्त, लसीका ग्रंथि का उपयोग लसीका ग्रंथि क्षेत्र या लसीका ग्रंथि hemocytes भीतर स्वायत्त और गैर-स्वायत्त कार्यों प्रकट कर सकते हैं।

ड्रोसोफिला hematopoiesis के अध्ययन के लिए प्रासंगिक तरीकों व्यापक पाठ आधारित संसाधनों में हाल ही में 26,27 संकलित किया गया है। हालांकि क्षेत्र के लिए अपरिहार्य है, इन संसाधनों के दायरे में सीमित कर रहे हैं। hemocyte एकाग्रता को मापने के लिए तरीके, उदाहरण के लिए, शामिल नहीं थे। लिखित तरीकों, विशेष रूप से उन का वर्णन विच्छेदन तकनीक, जल्दी में महारत हासिल करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अतिरिक्त योगदान बनाया गया है दृश्य संसाधनों के तरीकों के साथ सहायता के लिए उपलब्ध कराने, लेकिन अभी भी संख्या में और गुंजाइश 28,29 में सीमित थे। तरीकों यहाँ वर्णित है, जबकि यह भी व्यापक नहीं, संसाधनों avai करने के लिए जोड़ड्रोसोफिला hematopoiesis के अध्ययन में सहायता करने के लिए सक्षम।

हम संशोधनों और मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए विकल्प प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, वहाँ एक स्वचालित सेल काउंटर के बजाय वृद्धि की गति, आराम, और निष्पक्षता सहित एक मैनुअल hemocytometer, साथ hemocyte एकाग्रता को मापने के लिए कई फायदे हैं। हमारे अनुभव में, क्रिस्टल सेल दृश्य के लिए लार्वा गर्म करने के लिए एक पानी के स्नान का उपयोग कर व्यापक रूप से चर परिणाम में हुई है, खासकर अगर लार्वा शीशियों जिसमें वे उठा रहे हैं में गरम कर रहे हैं। व्यक्तिगत पीसीआर नलियों में ताप लार्वा कम चर और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सामने आए। लसीका ग्रंथि विच्छेदन विधि यहाँ वर्णित है, हालांकि पहले से एक प्रश्न के लिखित प्रोटोकॉल 26 में उल्लिखित, मौजूदा दृश्य संदर्भ 28 के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। अंत में, यदि एक confocal खुर्दबीन के लिए उपयोग सीमित है, हमारा सुझाव है कि मानक प्रतिदीप्ति छवियों के deconvolution confocal छवियों के लिए एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है। Deconvolutiएल्गोरिदम पर या तो उसे हटाने या पुन: असाइन बाहर का ध्यान केंद्रित पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा कर लिया प्रकाश, संकल्प में सुधार और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश के उन्मूलन के लिए सिद्धांत रूप में इसी तरह के विपरीत, और 2-आयामी और 3 करने के लिए लागू किया जा सकता आयामी (जेड ढेर) छवियों। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, के रूप में यहाँ का प्रदर्शन, deconvolution नाटकीय रूप से पारंपरिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ लिया छवियों में सुधार कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS tablets MP Biomedicals 2810305
dissecting dish Corning 7220-85
microcentrifuge tube Denville C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit Krayden (distributed through Fisher) NC9644388 (Fisher catalog number) Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope Morrell Instruments (Nikon distributor) mna42000, mma36300 Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe VWR 82003-820
forceps Electron Microscopy Sciences 72700-DZ
p200 pipette Eppendorf 3120000054
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
hemocytometer Hausser Scientific 3200
trypan blue stain Life Technologies T10282
formaldehyde Fisher BP531-500
Triton Fisher BP151-500
Tween 20 Fisher BP337-500
bovine serum albumin Rocky Mountain Biologicals BSA-BSH-01K
normal goat serum Sigma G9023-10ML
normal donkey serum Sigma D9663-10ML
200 proof ethanol VWR V1001
N-propyl gallate MP Biomedicals 102747
glycerol VWR EM-4750
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) Fisher 62248
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
microscope cover glass, 22 mm square Fisher 12-544-10
microscope cover glass, 18 mm circular Fisher 12-545-100
glass microscope slides Fisher 22-034-980
thermal cycler Eppendorf E950010037 Mastercycler EP Gradient S
PCR tubes USA Scientific 1402-2700
24-well plate Corning 351147
disposable transfer pipet Fisher 13-711-9AM
fluorescence microscope Zeiss Axio Imager.Z1

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 117, लसीका ग्रंथि hemocyte रक्त कोशिका क्रिस्टल सेल hemocyte एकाग्रता immunohistochemistry immunofluorescence melanization melanotic जनता लार्वा
तरीके लसीका ग्रंथि और hemocytes में जांच<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा
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Reimels, T. A., Pfleger, C. M.… More

Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (117), e54544, doi:10.3791/54544 (2016).

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