Summary
Drosophila и системы гемопоэтические млекопитающих имеют много общих черт, что делает Drosophila привлекательную генетическую модель для изучения кроветворения. Здесь показано, рассечение и монтаж основного личиночной кроветворной органа для иммуногистохимии. Мы также опишем методы для анализа различных личиночной кроветворных отсеков, включая циркулирующих гемоцитов и скального кристаллических ячеек.
Abstract
Многие параллели существуют между дрозофилы и кроветворных систем млекопитающих, хотя дрозофила не хватает лимфоидного , которые характеризуют млекопитающих адаптивного иммунитета. Дрозофилы и гемопоэз млекопитающих происходят в пространстве и во времени различных фаз для получения нескольких клеточных клонов в крови. Обе системы поддерживают резервуары кровяных клеток-предшественников, с которым для расширения или замены зрелых родословных. Кроветворной системы позволяет дрозофилы и млекопитающих , чтобы реагировать на них и адаптироваться к иммунным вызовам. Важно отметить, что транскрипционные регуляторы и сигнальные пути, которые контролируют генерацию, техническое обслуживание и функции кроветворной системы сохраняются от мух до млекопитающих. Эти сходства позволяют дрозофилы , которые будут использоваться для генной модели развития кроветворной и болезни.
Здесь мы подробно анализы , чтобы исследовать кроветворную систему личинок дрозофилы. Вчастности, мы опишем методы измерения количества клеток крови и концентрацию, визуализируйте определенную зрелую линию в естественных условиях, а также выполнять иммуногистохимии на клетки крови в обращении и в кроветворной органе. Эти анализы могут выявить изменения в экспрессии генов и клеточных процессов, включая сигнализацию, выживание, пролиферации и дифференцировки и может быть использован для исследования различных вопросов, касающихся кроветворение. В сочетании с генетическими инструментов , имеющихся у дрозофилы, эти анализы могут быть использованы для оценки кроветворной системы при определенных генетических изменений. Хотя конкретно не указано здесь, эти анализы также могут быть использованы для изучения влияния экологических изменений, таких как инфекции или диеты, на кроветворной системы.
Introduction
Сложные механизмы, регулирующие факторы транскрипции и сигнальные пути, которые координируют развитие кроветворной системы и что неисправность в гематологических заболеваний остаются плохо понятыми. Эти факторы транскрипции и сигнальные пути, а также их регулирование, высоко консервативны между дрозофилы и кроветворения у млекопитающих 1-5. Таким образом, система гемопоэтических дрозофилы представляет собой отличную генетическую модель для определения молекулярных механизмов , контролирующих кроветворение и основные гематологические заболевания.
Подобно млекопитающих, дрозофилы генерировать клетки крови, называемые гемоцитов, в пространстве и во времени различных фаз кроветворения. Традиционно Drosophila кроветворения считалось ограничивается фазами в эмбриональном мезодермы и в личиночной лимфатических желез. Недавние исследования свидетельствуют о том, что кроветворение происходит также в личиночной скального CLUSTERS и у взрослых живота 6-8. Все гемопоэтические фазы производят два типа зрелых гемоцитов: плазматоцитами и кристаллических ячеек. Плазматоциты являются макрофагами, как клетки, участвующие в фагоцитозе, врожденного иммунитета и заживления ран. Хрустальные клетки содержат про-phenoloxidases необходимые для меланизации, реакции, используемой в насекомых иммунных реакций и заживление ран. Личинки кроветворение может формировать третий зрелый тип гемоцитов, называемый lamellocyte, в ответ на определенные иммунные проблемы , такие как паразитоид осы инфекции 9,10. Lamellocytes большие, прилипшие клетки , которые функционируют в сочетании с плазматоцитами и кристаллических ячеек, чтобы инкапсулировать и нейтрализовать оса яиц , откладываемых у личинок дрозофилы. При отсутствии паразитированием, lamellocytes не встречаются у личинок дикого типа. Меланотический массы напоминают melanized, инкапсулированные оса яйца; многие мутантные штаммы Drosophila развиваются меланотический массы при отсутствии паразитирования. Присутствие lamellocytes и / или меланотический массы могут свидетельствовать о гемопоэтических нарушений. На самом деле, меланотический масса фенотип была использована для идентификации генов и путей , участвующих в кроветворении 11-14.
Личиночной гемопоэтических система является наиболее широко изучены на сегодняшний день. Она состоит из форменных циркулирующих в гемолимфе, сидячие гемоцитов кластеры узорчатый под кутикулой и гемоцитов проживающих в лимфатической железе. Лимфатических желез представляет собой ряд двусторонних лепестков, прикрепленных к спинным судна. Каждый первичный мочка лимфатических желез делится на три основные зоны. Наиболее удаленный от центра зоны известна как корковой зоны и содержит созревание гемоцитов. Самая внутренняя зона называется костномозговой зона и состоит из покоящихся предшественников гемоцитов. Третья зона, задняя сигнальным центром, является небольшая группа клеток у основания уплотнение лимфатических узлов, которые действуют как клеточноподобного ниши стволовых клеток. Ранние работы установили критические функции для Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 и Бескрылый 21 активность регулировать развитие личиночной лимфатических желез. Более поздние исследования показали , что ВМР 22, FGF-Ras 23, и Бегемот 24,25 сигнализации также функционируют в личиночной лимфатических желез.
Четыре личиночных гемопоэтические анализы , описанные здесь , описывают 1) измерение циркулирующей концентрации гемоцитов, определяемый как количество ячеек в единице объема, 2) выделение и фиксация циркулирующих гемоцитов для иммуногистохимии, 3) визуализации кристаллических клеток в живом организме , и 4) рассечения, фиксация, и монтаж лимфатических желез для иммуногистохимии. Эти анализы могут быть использованы в качестве гемопоэтических считываний для оценки функции и положения сигнальных путей в личиночной кроветворной системы. Хотя эти методы были использованы ранее в этой области, визуальной документации этих анализов началось лишь недавно 8,26-30. Несколько публикаций, цитируемые здесь помощьFul ресурсы , описывающие подобные методы и гемопоэтические маркеры 26,31-33. Кроме того, Троль и Viking являются полезными маркерами лимфы базальной мембраны железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Циркуляционный гемоцитов Концентрация
- Для получения личинок примерно той же стадии развития для этого анализа, ограничивают сбор яиц, позволяя самки откладывают яйца в течение фиксированного периода времени 2 - 6 ч.
- Сбор личинок в препаровальная ванночка лунки , заполненные 1x фосфатным буферным раствором (PBS, таблица 1).
- Для каждого личинкой, поместите 10 мкл 1x PBS в микроцентрифужных пробирку на льду и 10 мкл 1x PBS на чистую рассекает площадку. Поместите рассекает площадку на освещенной стереомикроскопа основания.
- Сушат индивидуальную личинку, разместив его на ткань вытирать перед передачей его в капле PBS на рассечение площадку.
- Используя пару щипцов, осторожно разорвать и осторожно переверните кутикулу, чтобы освободить гемолимфы.
Примечание: Следите за тем, чтобы не царапать или ткнуть кутикулу , так как это потенциально может освободить сидячих гемоцитов 29. - Используя пипетку, соберите гемолимфы из рассекает площадки. Избегайте сотрудничестваllecting личиночной мусора, таких как жир тела.
- Добавьте гемолимфы в микроцентрифужных пробирку и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
Примечание: Несколько образцов могут быть собраны сразу и держали на льду в течение одного часа. - Дополнительно: Смешайте трипанового синего с образцом гемолимфы в равных частях с красителем и исключить мертвые клетки. Граф клеток в течение 3 мин при добавлении трипанового синего, так как он токсичен для клеток.
- Смешайте образец с помощью пипетки вверх и вниз перед загрузкой 10 мкл в гемоцитометра камеру.
- При использовании автоматизированной счетчика клеток, установить соответствующие параметры для размера ячейки и округлости. Например, установить минимальный размер ячейки 2 мкм, максимальный размер ячейки 22 мкм, а округлость 75 - 80% округлость для обнаружения нормальные, круглые гемоцитов 34. Поэкспериментируйте с различными параметрами для обнаружения больших и веретенообразные гемоцитов, такие как lamellocytes. В качестве альтернативы, используйте гемоцитометра вручную рассчитывать гемоцитов.
2. Circulating гемоцитов Immunohistochemistry
- Для получения личинок примерно той же стадии развития для этого анализа, ограничивают сбор яиц, позволяя самки откладывают яйца в течение фиксированного периода времени 2 - 6 ч.
- Поместите один покровное в каждую лунку 6-ти или 12-луночный планшет.
Примечание: Площадь покровные (22 мм) подходят в 6-луночные планшеты и круглыми покровные (диаметром 18 мм) подходят в 12-луночные планшеты. - Сбор личинок в рассекает блюдо скважин, заполненных 1x PBS.
- Поместите 5 мкл 1X PBS в центре каждого покровное.
- Поместите пластину на освещенной стереомикроскопа основания.
- Сушат индивидуальную личинку на ткань вытирать, а затем поместить в PBS на покровное.
- Используя пару щипцов, мягко слезу и осторожно переверните кутикулу. Перед удалением личиночной туши, использовать его для распространения гемолимфы равномерно.
Примечание: Следите за тем, чтобы не царапать или ткнуть кутикулу , так как это потенциально может освободить сидячих гемоцитов 29. - Repeaт для всех личинок, собирая гемолимфе одной личинкой на покровное. Разрешить гемоцитов придерживаться покровные в течение 5 -. 8 мин при комнатной температуре RT не должна превышать 30 мин до фиксации.
- Исправление гемоцитов путем добавления 5 мкл 7,5% формальдегида (таблица 1) для каждого покровное в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Вымойте покровные три раза 1x PBS. Совет пластины и аспирация PBS после каждой промывки. Для того, чтобы предотвратить стекание раствора пермеабилизации на следующей стадии, использовать отсасыватель для удаления избытка PBS от периметра покровные.
- Добавьте 100 мкл раствора пермеабилизации (таблица 1) на каждом покровном стекле в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Совет и осторожно нажмите на тарелку, чтобы Аспирируйте решение пермеабилизирующего.
- Развести первичное антитело с раствором антитела (таблица 1) в соответствии со спецификацией поставщика. Добавьте по крайней мере, 500 мкл раствора первичной антитела на покровных стеклах в 12-луночные планшеты.Добавьте по крайней мере 1,5 мл в 6-луночные планшеты. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи.
- Удалить раствор первичного антитела и промыть покровные с 1x PBS в течение 10 мин на орбитальном шейкере, в три раза.
- Разведите вторичные антитела с раствором антитела в соответствии со спецификацией поставщика. Добавьте по крайней мере, 500 мкл раствора вторичного антитела к покровные в 12-луночные планшеты. Добавьте по крайней мере, 1,5 мл на 6-луночных планшетах. Выдержите в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре.
- Удаления раствора вторичного антитела и мыть покровные с 1x PBS в течение 10 мин на орбитальном шейкере, как на стадии 2.10, в три раза.
- В течение стадий промывки, чистый предметные стекла микроскопа с 70% -ным этанолом (таблица 1) с использованием салфетками ткани. Для каждого покровное, поместите 5 мкл буфера монтажа (таблица 1) на предметном стекле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два покровные помещаются на одном слайде. - Аспирируйте окончательной промывки PBS.
- Используйте пинцет, чтобы аккуратно удалите покровные из пластин и место, инвerted, на верхней части крепежной буфера.
Примечание: Предметные можно хранить при температуре 4 ° С до визуализации. Максимальное время хранения зависит от стабильности антител, используемых. 6- и 12-луночные планшеты можно промыть и использовать повторно.
3. В Vivo кристаллической ячейки меланизации
- Для получения личинок примерно той же стадии развития для этого анализа, ограничивают сбор яиц, позволяя самки откладывают яйца в течение фиксированного периода времени 2-6 часов.
- Перед началом установите источник нагрева при температуре 60 ° C.
Примечание: амплификатор программа 60 ° С в течение 10 мин (с последующим C проведет 25 °) работает лучше всего, но водяная баня или другого источника тепла, достаточно тех пор, пока тепло распределяется последовательно и равномерно по каждой личинке. - Сбор личинок в рассекает блюдо скважин , заполненных 1x PBS (таблица 1).
- Поочередно, сухой личинка на ткани протирать и место в нижней части трубки, ПЦР. Поместите каждую личинкув отдельной ПЦР-пробирку. (Смотрите рисунок 3A.)
- Для получения стабильных результатов убедитесь, что личинки во время пребывания в нижней части пробирки для ПЦР путем охлаждения личинок в пробирках при 4 ° С в течение 10 - 15 мин и / или аккуратным постукиванием пробирки перед нагреванием.
- Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер (или водяной бане). Нагревают при 60 ° С в течение 10 мин.
- Осторожно удалите личинки из пробирки ПЦР в рассекает блюдо лунки, заполненные свежей 1x PBS.
- Сухие личинки на ткани вытереть и расположить на плоскую поверхность для работы с изображениями под стереомикроскопа.
- Оценка изображения личинок вслепую несколькими лицами.
4. Личинки лимфатический узел Immunohistochemistry
ПРИМЕЧАНИЕ: лимфатическая железа расположена примерно на одну треть длины от переднего конца личинки чуть ниже головного мозга на спинной стороне. (Смотри стрелку на рисунке 3B.) Лимфатические железы боковые поверхности спинного сосуда и наиболее легко рассекают прикреплен к рту Hooкс или в мозг. Дикого типа, третий Инстар лимфатические узлы очень маленькие структуры; первичные лепестка приблизительно 100 - 200 мкм в длину. (Смотрите рисунок 4A) .
- Для получения личинок примерно той же стадии развития для этого анализа, ограничивают сбор яиц, позволяя самки откладывают яйца в течение фиксированного периода времени 2 - 6 ч.
- лимфодиссекция железы
- Для каждого условия эксперимента, добавляют 1 мл 1X PBS (таблица 1) в одну лунку 24-луночного планшета.
- Добавьте 1 каплю 0,1% PBST (таблица 1) , в каждую лунку с помощью одноразовой передачи пипетку.
Примечание: моющее средство, такие как Tween 20, добавляется, чтобы снизить поверхностное натяжение, позволяя ткани опускаться на дно колодца. - Поместите пластину плоской на льду.
- Сбор личинок в рассекает блюдо скважин, заполненных 1x PBS.
- Поместите чистую рассекает площадку на освещенной стереомикроскопа основания. Используйте одноразовые пипетки передачи для размещения Смальл капли 0,01% PBST (таблица 1) на панели. Перенесите одну личинку к падению PBST для рассечения.
- Держите личинку с одной парой щипцов приблизительно длиной одной четверти от заднего конца, спинной стороной вверх.
- Используйте другую пару щипцов, чтобы захватить кутикула сразу впереди щипцами, которые держат личинку. Осторожно потяните кожицу к переднему концу, пока крючки рот не подвергаются.
Примечание: Цель состоит в том, чтобы очистить кожицу, не нарушая каких-либо внутренних структур. - Отпустите кутикулу и использовать оба щипцами, чтобы сократить личинку пополам. Снимите задний конец от падения PBST.
Примечание: Если кутикула не отслаивается весь путь к крюкам во рту, вырезать личинку пополам и удалить задний конец. Используйте одну пару щипцов, чтобы держать край кутикулы, а также использовать другую пару щипцов, чтобы подтолкнуть крючки рта через отверстие. Это позволит инвертировать кутикулу и разоблачить крючки во рту. Это может быть использовано в качестве Alternсъел метод рассечения, а также. - Используйте одну пару щипцов придавить кутикулу (либо вентральной кутикулы, спинной кутикулы лоскут, или оба) для обеспечения стабильности.
- Используйте другую пару щипцов, чтобы захватить открытые крючки рот и аккуратно вытяните их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет отделить кожицу от внутренних структур. В идеале, для глаз / усиковые имагинальные диски, мозг, кольцо железы, и фланговые спинного сосуда лимфатических желез будет оставаться прикрепленной к крюкам во рту. - В то время как все еще держа крючки рот, тщательно удалить нежелательные структуры, такие как слюнных желез, жирового тела и кишечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мозг отделяется от крюков рта, лимфатические железы все еще может быть присоединен к и собранным с мозгом. В этом случае, держите вентральный нервный тяж вместо крючков во рту. - Использование крючки рта или вентральный нервный тяж в качестве ручки, передать расчлененный комплекс , содержащий лимфатическую железу в скважину на льду. Не более 30 минПеред фиксацией.
- Закрепление и иммуногистохимии
- Поместите 24-луночного планшета на базе стереомикроскопа.
- Используйте P200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBST из колодца.
Примечание: Пустые, соседние скважины могут быть использованы для временного размещения отходов. - Осторожно добавьте 200 мкл 3,7% формальдегида (таблица 1) вниз в сторону колодца и водоворот пластины для того , чтобы рассеченные ткани полностью погружен в воду.
- Возвратить пластину на лед в течение 30 мин. Если лимфатические узлы выразить флуоресцентный белок (белки), держать пластину, покрытую, чтобы предотвратить фотообесцвечивания.
- Используйте P200 пипетки, чтобы тщательно удалить закрепитель.
- Промыть путем добавления 200 мкл 1X PBS к колодцу и помещая пластину на орбитальном шейкере в течение 5 мин при комнатной температуре. Используйте P200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBS.
Примечание: Фиксированный лимфатические узлы не могут быть оставлены на льду в PBS до лимфатических желез для всех условий эксперимента dissected и фиксировали. - Повторите мыть шаги еще два раза.
- Добавить 200 мкл раствора пермеабилизации (таблица 1) в скважину. Установите пластину на орбитальном шейкере в течение 45 мин при комнатной температуре.
Примечание: 45 мин является "золотым стандартом" для пермеабилизации лимфатических узлов, но авторы имеют успех после всего лишь 20 минут. - Удалите раствор с Р200, пипеткой.
- Развести первичное антитело с раствором антитела (таблица 1) в соответствии со спецификацией поставщика. Добавьте 300 мкл раствора первичного антитела к колодцу и убедитесь, что рассеченные ткани полностью погружены. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи.
- Используйте P200 пипетки для удаления первичного антитела.
- Промыть путем добавления 200 мкл 1X PBS к колодцу и помещая пластину на орбитальном шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре. Используйте P200 пипетки, чтобы тщательно удалить PBS.
- Повторите мыть шаги еще два раза.
- Развести вторичный Antibody раствором антител в соответствии со спецификацией поставщика. Добавить 300 мкл раствора вторичного антитела к колодцу и убедитесь, что рассеченные ткани полностью погружены. Инкубируют на орбитальном шейкере в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре.
- Используйте P200 пипетки для удаления вторичного антитела и промыть, как описано в шагах 4.3.12 и 4.3.13. Не удаляйте PBS после окончательной промывки.
- Лимфатические железы монтаж
- Чистый стекла микроскопа с использованием 70% этанола (Таблица 1) и салфетками ткани.
- Для каждого условия эксперимента, поместите одну каплю монтажа буфера (таблица 1) на предметном стекле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два условия помещаются на одном слайде. Монтажный объем буфера зависит от числа лимфатических желез, которые будут установлены. Используйте 2 мкл в течение приблизительно 18 - 20 лимфатических желез, 1 мкл в течение 10 - 12, и 0,5 мкл в течение 5 или меньше. - Поместите стекло микроскопа на освещенной стереомикроскопа базе.
- Для до двух условий одновременно, передача всех лимфатических желез от колодца к монтажному буфера с пинцетом, используя крюки рот или вентральный нервный тяж в качестве ручки.
- Пространство рассеченные ткани равномерно по круглой или прямоугольной формы, расширив монтажный буфер в этом процессе.
- Для каждого из рассеченных тканей, индивидуально, слайд один Tong пинцета под спинным сосуда и осторожно вытяните в сторону периферии монтажного буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это привлечет лимфа железы из остальной части расчлененных ткани и придавить лимфатических желез на стекле. - Используя один трубный ключ из щипцов и движение пиление, пиление спинного сосуда между лимфатической железы и головного мозга.
- Переместить остальную часть рассеченных тканей на противоположной стороне лимфатических желез, у наиболее удаленного края буфера.
Примечание: Нежелательные рассеченные ткани, в конечном счете образуют периметр вокруг лимфатических желез и служить опорой при whicч покровное будет отдыхать. - Повторяйте, пока все лимфатические узлы не отделяются от рассеченных тканей, оставляя за собой один из нежелательных расчлененный тканей место в центре.
- Возьмем покровное между двумя пальцами. Убедитесь, что покровное свободна от пыли и отпечатков пальцев. При необходимости, используйте ткань вытереть и 70% этанола для очистки покровное.
- Обеспечение того, чтобы край покровного параллельна краю предметное стекло, осторожно опустите покровное над монтажными буфером.
Примечание: Предметные можно хранить при температуре 4 ° С до визуализации. Максимальное время хранения зависит от стабильности антител, используемых. 24-луночные планшеты, можно промыть и использовать повторно.
5. обработки изображений
- Изображение фиксируется гемоцитов и смонтированный лимфоузлы на соответствующей стандартной флуоресценции или конфокальной микроскопии при 20Х или большем увеличении в соответствии с руководством по эксплуатации завода-изготовителя. Изображение в целом личинки на подставкеARD Стереомикроскоп при 2Х увеличении в соответствии с руководством по эксплуатации завода-изготовителя.
- Следуйте инструкциям поставщика программного обеспечения для деконволюции, при желании.
| Решение | Состав | Место хранения | Комментарии |
| 1x PBS | 200 мг / л хлорида калия | комнатная температура | |
| 200 мг / л одноосновного фосфата калия | |||
| 8000 мг / л хлорида натрия | |||
| 1,150 мг / л фосфата натрия двузамещенный | |||
| дН 2 O | |||
| Фиксирующий | 3,7% или 7,5% формальдегида в PBS 1x | при комнатной температуре в темноте | Формальдегид является токсичным. |
| Пермеабилизирующего раствор / антитело разбавителя | 0,4% Тритон | 4 ° C | Стандартная формула использует 0,4% Тритон, но авторы используют 0,1% твин-20 с успехом. Используйте для разбавления первичных и вторичных антител в соответствии с рекомендованными концентрациями провайдеров. |
| 5% бычий сывороточный альбумин, нормальной козьей сыворотки, или нормальный осел в сыворотке крови | |||
| 1x PBS | |||
| 70% этанол | 70% 200 доказательство этанол в dH2O | комнатная температура | |
| Монтажный буфер | 0,5% н-пропил галлат | 4 ° C в темноте | N-пропил галлат вредна. DAPI является мутагенным. |
| 80% глицерина | |||
| Дополнительно: 1 мкг / мл DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% твин-20 в 1x PBS | комнатная температура | |
| 0,01% PBST | 1:10 разбавление 0,1% PBST | комнатная температура |
Таблица 1. Решения , используемые в настоящем Протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Циркулирующие гемоцитов Концентрация
Числа гемоцитов увеличения на протяжении личиночного развития 35. Для того, чтобы проиллюстрировать, что этот метод обнаруживает различия в числах гемоцитов и концентрации, независимо от биологической причины, мы измерили концентрации гемоцитов отсроченных и без задержки личинок. Потеря prothoracicotropic гормона (PTTH) путем генетической абляции PTTH-продуцирующих нейронов (PTTH> мрачная) производит задержку в личиночного развития 36. Для каждого генотипа, концентрации гемоцитов измеряли, как описано в Протоколе 1, по крайней мере 8 индивидуальных личинкой поднятом при 25 ° С. При температуре 120 ч после сбора яиц в 2 ч, средняя концентрация гемоцитов за задержки с личинкой (PTTH> мрачная) меньше, чем средняя концентрация гемоцитов в контрольной личинка (PTTH). Только после того, как 9 дней делает среднюю концентрацию гемоцитов за задержки с личинкой подхода, контроля (
Изображения , полученные из автоматического счетчика клеток показывают чистую, желательно образец гемолимфы и образец , содержащий твердые частицы, которые могут привести к неточному измерению (рис 1C). Минимальные и максимальные размеры ячеек были установлены до 2 мкм и 22 мкм соответственно. Округлость была установлена на 75-80% округлости. Эти параметры предназначены в качестве руководства и должны быть эмпирически оптимизировано.
Циркулирующие гемоцитов иммуногистохимии
Циркулирующие гемоцитов , экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) , были собраны, фиксированные, и инкубировали со смесью plasmatocyte-специфических антител (P1A и P1B, Истван Ando) 31 , как описано в Протоколе 2(Рисунок 2). Снимок был сделан на стандартном флуоресцентного микроскопа и показана неизмененном и после того, как стесненном итерационного деконволюции. В этом случае деконволюции не резко улучшить качество изображения.
В естественных условиях кристаллической ячейки меланизации
Личинки были размещены в нижней части пробирки ПЦР перед тепловой индуцированных клеток меланизации кристалл , как описано в Протоколе 3 (рис 3 , а ). Красные стрелки указывают на трубы, в которых личинки слишком далеко от дна и может быть нагреты неравномерно. Неравномерное распределение тепла по индивидуальным личинка может увеличить изменчивость в меланизации кристаллических клеток в личинку.
Дикого типа личинка отображается на стандартном стереомикроско- показывает типичную картину melanized кристаллических ячеек в сидячих кластеров после теплового воздействия (Фигура 3В). Melanized кристаллические клетки в лимфатической железы иногда наблюдается.
Личинки лимфатический узел Immunohistochemistry
Третьей возрастной стадии личиночной лимфатические железы препарировали, фиксированы, и установлены , как описано в Протоколе 4. Дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) изображение , полученное на стандартном флуоресцентного микроскопа показывает первичные и вторичные доли лимфатических желез , фланкирующих спинного сосуда (рис 4а).
Лимфе железа, в которой костномозговой зона и сигнальным центром задних были генетически отмечены повышенным синим флуоресцентным белком (EBFP2) и GFP, соответственно, окрашивали антителом против Notch внутриклеточный домен (C17.9C6, возрастной Исследования Гибридомы банка), как описанные в протоколе были приняты 4. Z-стека изображений на стандартном флуоресцентного микроскопа. Один максимум INT проекция ensity изображение появляется в неизмененном и после того, как стесненном итерационного деконволюции (рис 4В). В этом случае деконволюции резко улучшилось качество и детализации изображения.
Рисунок 1. Циркулирующие гемоцитов концентрации. A) Часть стандартной среды Drosophila была удалена (справа) содействовать яйценоскость в течение периода 2 ч сбора яиц. B) средняя концентрация гемоцитов в отстающих в развитии личинки (PTTH> мрачная) был ниже , чем средняя концентрация гемоцитов на личинок контрольной (PTTH) 120 ч после откладки яиц (AEL). Средняя концентрация гемоцитов за задержки с личинкой подошел контрольному уровню 9 дней AEL. Усы представляют ± СЭМ C) образцы гемолимфы без (слева) и (справа) мусора. Масштабные столбики представляют 0,1 мм.HREF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Циркуляционный гемоцитов Immunohistochemistry. Гемоцитах генетически , выражающую GFP были собраны и прикреплены к покровным. Антитело plasmatocyte конкретных использовали для окраски плазматоцитами (красный цвет). DAPI окрашивание показаны синим цветом. Неизмененной изображение, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа (слева). То же самое изображение после деконволюции (справа). Масштабные столбики представляют 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. В Vivo А) Личинки были помещены индивидуально в ПЦР - пробирки перед нагреванием. Красные стрелки указывают на личинки, которые не в нижней части трубок B) Типичный кристалл клеток шаблон меланизации после нагрева, который иногда раскрывает уплотнение лимфатических узлов (стрелка;. Спинная сторона показано, передняя находится слева). Шкала бар составляет 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Личинки лимфатический узел Immunohistochemistry. A) DIC изображение третьей возрастной стадии личиночной лимфатических желез , показывая спинного сосуда (Dv), первичные доли (1 °), и вторичные доли (2 °). Шкала бар представляет 100 мкм. B) представитель третьего Инстар личиночной лимфатических желез пром личинка генетически выражающий EBFP2 в медуллярной зоне и GFP в задней сигнализации центра. Уплотнение лимфатических узлов окрашивали антителом против Notch внутриклеточный домен (красный). Неизмененной изображение, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа (вверху). То же самое изображение после деконволюции (внизу). Масштабные столбики представляют 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При генетической или экологической изменения, четыре метода , описанные здесь , могут использоваться по отдельности или в сочетании для анализа различных процессов при кроветворении , такие как сигнализация, выживание, пролиферации и дифференцировки Drosophila кроветворения представляет собой динамический процесс. число форменных элементов крови каждого животного увеличивается 35 и структуры и экспрессии генов лимфатической железы изменяется 32 в процессе разработки. Перед выполнением этих анализов, поэтому крайне важно, чтобы ограничить коллекции яиц, позволяя самки откладывают яйца в течение фиксированного периода времени, а также для подтверждения желаемого личиночной стадии развития. Для более коротких коллекций яиц (менее 6 ч) или для случаев, в которых женщины являются нездоровыми или дефицитным, кладка можно поощрять путем создания расщелины в пище. Это может быть достигнуто путем удаления части пищи с этанолом очищенный шпателем. Если избыток жидкости накапливается в пище, использование ткани салфетки, чтобы впитатьжидкость. (Смотрите рисунок 1А) .
В одиночку, методы, описанные здесь, имеют ограничения. Например, измерение концентрации циркулирующего гемоцитов фиксирует изменения в выживаемости гемоцитов или пролиферации, но не дает никакой информации о распределении клонов гемоцитов или какого-либо нарушения клонального, которые могут быть следствием генетической или экологической изменения. И наоборот, иммуногистохимия циркулирующих гемоцитов выявляет изменения в конкретных гемоцитов родах в гемолимфе, но только в относительных, а не абсолютное, числа. Кристалл клеток меланизации в естественных условиях трудно количественно оценить , как распределение кристаллической ячейки является переменным и сидячие гемоцитов являются динамическими 8,10. Скорее всего, несколько люди должны забить ячейки меланизации кристалла вслепую. И, наконец, наблюдения, сделанные в одном отсеке гемоцитов не обязательно может справедливы и в других отделениях.
При совместном использовании эти анализы могут быть применены, чтобы отличить генческие изменения, которые регулируют пролиферацию или выживание от тех, которые регулируют экспрессию генов или дифференциации. Например, генетическое изменение может увеличить пролиферацию гемоцитах таким образом, что концентрация гемоцитов увеличивается, но относительные пропорции гемоцитов родословных остается тем же самым. С другой стороны, генетическое изменение может способствовать изменениям в гемоцитов дифференциации в определенные клоны при отсутствии эффекта от общей концентрации гемоцитов. Популяция клеток кристалл может быть допрошен быстро и легко с помощью естественных условиях метод меланизации в, облегчая генетические экраны и исследования генетического взаимодействия. Этот метод может быть использован в закреплении с генетическими исследованиями , которые используют prophenoloxidase 1 (РРО1, также называемые черные клетки, Британская Колумбия) мутантного аллеля или иммуногистохимических анализов , которые используют клеточные специфические антитела кристаллов. Личиночной лимфатические железы могут быть использованы для решения подобных вопросов в отношении гемопоэтических клеточных процессов. многочисленныйсигнальные пути участвуют в установлении и поддержании лимфатической железы и ее основные зоны. Каждая зона имеет отчетливую экспрессию генов и функцию в личиночной кроветворения. Кроме того, используя лимфатической железы можно выявить автономные и не автономные функции в пределах зон лимфатических желез или гемоцитах лимфатических желез.
Соответствующие методы изучения Drosophila кроветворение были собраны в комплексных текстовых ресурсов только недавно 26,27. Хотя необходимо для области, эти ресурсы ограничены по своему охвату. Способы измерения концентрации гемоцитов, например, не были включены. Письменные методы, особенно те, которые описывают методы рассечение, может оказаться непростой задачей освоить быстро. Дополнительные взносы были сделаны, обеспечивая визуальные ресурсы для оказания помощи методов, но по - прежнему ограничены в количестве и в объеме 28,29. Методы, описанные здесь, в то же время не является исчерпывающим, добавить к ресурсам AvaiLable , чтобы помочь в изучении Drosophila кроветворения.
Мы предлагаем модификации и альтернативы существующим протоколам. Например, есть несколько преимуществ для измерения концентрации гемоцитов с автоматическим счетчиком клеток, а не ручной гемоцитометра, в том числе повышенной скорости, простоты и объективности. По нашему опыту, с помощью водяной бани для нагревания личинок для визуализации кристаллической ячейки приводит к широко переменным успехом, особенно если личинки нагреваются во флаконах, в которых они воспитываются. Личинки отопления в отдельных трубок ПЦР получали менее изменчивы и более воспроизводимые результаты. Метод лимфодиссекция железы , описанный здесь, хотя ранее изложенные в письменном протоколе 26, представляет собой альтернативу существующим визуальным ориентирам 28. И, наконец, если доступ к конфокальной микроскопии ограничено, мы предполагаем, что деконволюции стандартных изображений флуоресценции может быть подходящей заменой для конфокальных изображений. Deconvolutiна алгоритмах удалить или переназначить вне фокуса света захвачена обычной флуоресцентной микроскопии, улучшая разрешение и контраст в принципе аналогична ликвидации вне фокуса света конфокальной микроскопии, а также может быть применен к 2-мерная и 3- одномерные (Z-стек) изображения. Для некоторых приложений, как показано здесь, деконволюции может значительно улучшить изображения, полученные с помощью обычных микроскопов флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих или финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M.
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M.
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
