Summary
Sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e condividono molte caratteristiche comuni, rendendo Drosophila un modello genetico interessante per lo studio ematopoiesi. Qui mostriamo dissezione e montaggio del grande organo ematopoietico larvale per immunoistochimica. Descriviamo anche metodi per saggiare i vari compartimenti ematopoietici larvali tra emociti circolanti e le cellule di cristallo sessili.
Abstract
Molti paralleli esistenti tra i sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e, anche se Drosophila manca il lignaggio linfoide che caratterizzano mammiferi immunità adattativa. Drosophila e mammiferi emopoiesi si verificano in spazialmente e temporalmente distinte fasi per la produzione di diverse linee cellulari del sangue. Entrambi i sistemi mantengono riserve di progenitori di cellule del sangue con il quale espandere o sostituire linee maturi. Il sistema ematopoietico permette Drosophila e mammiferi per rispondere e di adattarsi alle sfide del sistema immunitario. È importante sottolineare che i regolatori trascrizionali e vie di segnalazione che controllano la generazione, la manutenzione, e la funzione del sistema ematopoietico sono conservati dalle mosche ai mammiferi. Queste somiglianze consentono Drosophila da utilizzare per geneticamente modello di sviluppo ematopoietiche e la malattia.
Qui dettaglio test per esaminare il sistema ematopoietico di Drosophila larve. Inparticolare, si delineano i metodi per misurare il numero di cellule del sangue e la concentrazione, visualizzare una specifica stirpe maturo in vivo, ed eseguire immunoistochimica sulle cellule del sangue in circolazione e nell'organo ematopoietiche. Questi test possono rivelare cambiamenti nell'espressione genica e dei processi cellulari tra cui la segnalazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione e può essere utilizzato per indagare su una serie di domande riguardanti emopoiesi. In combinazione con gli strumenti genetici disponibili in Drosophila, questi test possono essere utilizzati per valutare il sistema ematopoietico su alterazioni genetiche definiti. Sebbene non specificamente qui delineato, questi saggi possono anche essere utilizzati per esaminare l'effetto di alterazioni ambientali, come infezioni o dieta, sul sistema ematopoietico.
Introduction
I complessi meccanismi che regolano i fattori di trascrizione e vie di segnalazione che coordinano lo sviluppo del sistema ematopoietico e che malfunzionamento malattie ematologiche sono ancora poco chiare. Questi fattori di trascrizione e vie di segnalazione, così come la loro regolamentazione, sono altamente conservati tra Drosophila e mammiferi emopoiesi 1-5. Così il sistema ematopoietico Drosophila rappresenta un ottimo modello genetico per definire i meccanismi molecolari che controllano l'emopoiesi e malattie ematologiche sottostanti.
Simile a mammiferi, Drosophila generare cellule del sangue, chiamate ematociti concentrati, in spazialmente e temporalmente distinte fasi di emopoiesi. Tradizionalmente, Drosophila emopoiesi è stato pensato per essere limitato alle fasi del mesoderma embrionale e nella ghiandola linfatica larvale. Recenti studi dimostrano che emopoiesi si verifica anche in larvale clu sessilisters e nell'adulto addome 6-8. Tutte le fasi ematopoietiche producono due tipi di ematociti concentrati mature: plasmatocytes e cellule di cristallo. Plasmatocytes sono cellule macrofagi come coinvolti nella fagocitosi, l'immunità innata, e la guarigione della ferita. celle a cristalli contengono pro-phenoloxidases necessari per melanizzazione, una reazione usato in risposte immunitarie insetti e la guarigione delle ferite. Emopoiesi larvale può generare un terzo tipo hemocyte maturo, chiamato lamellocyte, in risposta ad alcune sfide immunitario come parassitoide vespa infezione 9,10. Lamellocytes sono grandi, cellule aderenti che funzionano, in collaborazione con plasmatocytes e le cellule di cristallo, per incapsulare e neutralizzare le uova di vespa di cui in Drosophila larve. In assenza di parassitizzazione, lamellocytes non si trovano nel wild-type larve. masse melanotic assomigliano melanized, uova vespa incapsulati; molti ceppi mutanti di Drosophila sviluppano masse melanotici in assenza di parassitizzazione. La presenza di Lamellociti e / o masse melanotici possono essere indicativi di anomalie ematopoietiche. In realtà, il fenotipo di massa melanotico è stato utilizzato per identificare i geni e meccanismi coinvolti nella emopoiesi 11-14.
Il sistema ematopoietico larvale è il più ampiamente studiato fino ad oggi. Si compone di ematociti concentrati circolanti nel emolinfa, i cluster hemocyte sessili fantasia sotto la cuticola, e ematociti concentrati che risiedono nella ghiandola linfatica. La ghiandola linfatica è una serie di lobi bilaterali collegati al vaso dorsale. Ogni lobo principale della ghiandola linfatica è diviso in tre zone principali. La zona più esterna è conosciuta come la zona corticale e contiene maturazione hemocytes. La zona più interna viene chiamata zona midollare e comprende precursori hemocyte quiescenti. La terza zona, la segnalazione posteriori centro, è un piccolo gruppo di cellule alla base della ghiandola linfa che agiscono come una cellula simile nicchia stelo. I primi lavori stabilito funzioni critiche per Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 e ali 21 attività per regolare lo sviluppo della ghiandola linfa larvale. Studi più recenti hanno dimostrato che BMP 22, FGF-Ras 23, e Hippo 24,25 funzione di segnalazione anche all'interno della ghiandola linfatica larvale.
Quattro saggi ematopoietiche larvali qui esposti descrivono 1) misura la concentrazione hemocyte circolazione, definito come numero di cellule per unità di volume, 2) l'isolamento e il fissaggio di circolazione hemocytes per immunoistochimica, 3) la visualizzazione di cellule di cristallo in vivo, e 4) dissezione, il fissaggio e il montaggio ghiandole linfatiche per immunoistochimica. Questi test possono essere utilizzati come letture ematopoietiche per valutare le funzioni ei regolamenti dei percorsi di segnalazione nel sistema ematopoietico larvale. Mentre questi metodi sono stati utilizzati in precedenza nel campo, documentazione visiva di questi saggi ha iniziato solo recentemente 8,26-30. Diverse pubblicazioni citate qui ci sono di aiutorisorse ful che descrivono metodi simili e marcatori ematopoietici 26,31-33. Inoltre, Trol e Viking sono marcatori utili della membrana linfatico della ghiandola seminterrato.
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Protocol
1. circolazione Concentrazione hemocyte
- Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore.
- Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di 1x tampone fosfato (PBS, Tabella 1).
- Per ogni larva, mettere 10 microlitri 1x PBS in una provetta su ghiaccio e 10 microlitri 1x PBS su un rilievo da dissezione pulito. Posizionare il pad dissezione su una base stereomicroscopio illuminato.
- Essiccare una larva individuale ponendolo su un tessuto wipe prima di trasferirlo ad un calo PBS sul pad dissezione.
- Utilizzando un paio di pinze, strappare delicatamente aperto e con attenzione invertire la cuticola per rilasciare il emolinfa.
NOTA: Fare attenzione a non graffiare o jab la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare hemocytes sessili 29. - Utilizzando una pipetta, raccogliere emolinfa dal pad dissezione. Evitare collecting detriti larvale, come il grasso corporeo.
- Aggiungere il emolinfa in una provetta e mescolare pipettando su e giù.
NOTA: Diversi campioni possono essere raccolti in una sola volta e tenuti in ghiaccio fino a un'ora. - Opzionale: Mescolare Trypan blu con il campione emolinfa in parti uguali per tingere ed escludere le cellule morte. Contare le celle nel raggio di 3 min di aggiungere Trypan blu perché è tossico per le cellule.
- Mescolare il campione pipettando su e giù prima di caricare 10 microlitri in una camera emocitometro.
- Se si utilizza un contatore di cellule automatizzato, impostare i parametri appropriati per le dimensioni delle cellule e la circolarità. Ad esempio, impostare una dimensione minima della cella di 2 micron, una dimensione massima delle cellule di 22 micron, e una circolarità di 75 - 80% rotondità per rilevare normali, hemocytes rotonde 34. Esperimento con diversi parametri per rilevare ematociti concentrati più grandi e fusiformi, come lamellocytes. In alternativa, utilizzare un emocitometro per contare manualmente ematociti concentrati.
2. Circulating hemocyte immunoistochimica
- Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore.
- Mettere una vetrino in ciascun pozzetto di una piastra a 6 o 12 pozzetti.
NOTA: Coprioggetto Square (22 mm) in forma in 6 pozzetti e coprioggetto rotonde (diametro 18 mm) in forma in piastre da 12 pozzetti. - Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x.
- Posizionare 5 microlitri 1x PBS nel centro di ogni coprioggetto.
- Posizionare la piastra su una base stereomicroscopio illuminato.
- Asciugare una larva individuale su un tessuto wipe e poi mettere in PBS sul vetrino.
- Utilizzando un paio di pinze, strappare delicatamente e con attenzione capovolgere la cuticola. Prima di rimuovere la carcassa larvale, utilizzarlo per diffondere la emolinfa in modo uniforme.
NOTA: Fare attenzione a non graffiare o jab la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare hemocytes sessili 29. - ripetT per tutte le larve, raccogliendo l'emolinfa di una larva per ogni vetrino. Consentire hemocytes di aderire alle lamelle per 5 -. 8 minuti a temperatura ambiente temperatura ambiente Non superare 30 minuti prima della fissazione.
- Fissare hemocytes aggiungendo 5 ml di 7,5% di formaldeide (Tabella 1) per ciascun coprioggetto per 15 min a temperatura ambiente.
- Lavare coprioggetto tre volte con PBS 1x. Suggerimento la piastra e aspirare PBS dopo ogni lavaggio. Per evitare deflusso della soluzione permeabilizzazione nella fase successiva, utilizzare l'aspiratore per rimuovere l'eccesso di PBS dai perimetro delle lamelle.
- Aggiungere 100 microlitri soluzione permeabilizzazione (Tabella 1) per ciascun coprioggetto per 20 minuti a RT.
- Tip e Tap delicatamente la piastra per aspirare la soluzione di permeabilizzazione.
- Diluire anticorpo primario con soluzione di anticorpi (Tabella 1) secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere almeno 500 microlitri soluzione di anticorpo primario coprioggetto in piastre da 12 pozzetti.Aggiungere almeno 1,5 ml in piastre da 6 pozzetti. Incubare a 4 ° C durante la notte.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare coprioggetto con 1x PBS per 10 minuti in un agitatore orbitale, tre volte.
- Diluire anticorpo secondario con soluzione di anticorpi secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere almeno 500 microlitri soluzione di anticorpo secondario a lamelle in piastre da 12 pozzetti. Aggiungere almeno 1,5 ml per 6 pozzetti. Incubare per almeno 2 ore a RT.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare coprioggetto con 1x PBS per 10 minuti su un agitatore orbitale come al punto 2.10, tre volte.
- Durante le fasi di lavaggio, microscopio in vetro pulito vetrini con etanolo al 70% (Tabella 1) utilizzando salviette di tessuto. Per ogni vetrino, posizionare 5 ml di montaggio tampone (Tabella 1) sul vetrino.
NOTA: Due vetrini stare su una diapositiva. - Aspirare il lavaggio finale PBS.
- Usare pinze per rimuovere con attenzione i coprioggetti dai piatti e luogo, inverted, sulla sommità del buffer di montaggio.
Nota: i vetrini del microscopio possono essere conservati a 4 ° C prima di imaging. Il tempo massimo di memorizzazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. 6 e 12 pozzetti possono essere risciacquati e riutilizzati.
3. In Vivo cristallo cellulare melanizzazione
- Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore.
- Prima di iniziare, impostare una sorgente di riscaldamento a 60 ° C.
NOTA: Un programma termica cycler di 60 ° C per 10 min (seguita da C hold 25 °) funziona meglio, ma un bagno d'acqua o altra fonte di calore è sufficiente fino a quando il calore viene distribuito in modo coerente e uniforme su ogni larva. - Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x (Tabella 1).
- Uno alla volta, asciugare una larva su un tessuto pulire e posto sul fondo di un tubo di PCR. Posizionare ogni larvain un tubo PCR separata. (Vedi Figura 3A).
- Per risultati coerenti, affinché soggiorno larve al fondo delle provette PCR da raffreddamento larve nei tubi a 4 ° C per 10 - 15 min e / o leggermente toccando i tubi prima del riscaldamento.
- Mettere le provette PCR nel termociclatore (o bagno d'acqua). Riscaldare a 60 ° C per 10 min.
- Rimuovere con attenzione le larve dai tubi di PCR in dissezione pozzi piatto pieno di 1x PBS fresco.
- larve secco su un tessuto pulire e organizzare su una superficie piana per l'imaging allo stereomicroscopio.
- Punteggio immagini di larve ciecamente da più individui.
4. larvale delle ghiandole linfatiche immunoistochimica
NOTA: La ghiandola linfatica si trova circa un terzo tratto dall'estremità anteriore di una larva leggermente sotto il cervello sul lato dorsale. (Vedi freccia nella figura 3B.) La ghiandola linfatica fiancheggia il vaso dorsale ed è più facilmente sezionato attaccato al hoo boccaks o al cervello. Wild-type, terzo stadio ghiandole linfatiche sono strutture molto piccole; i lobi principali sono circa 100 - 200 micron di lunghezza. (Vedi Figura 4A).
- Per ottenere larve di circa la stessa fase di sviluppo per questa analisi, limitare la raccolta delle uova da garantire che le femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2-6 ore.
- Linfa ghiandola dissezione
- Per ciascuna condizione sperimentale, aggiungere 1 ml di PBS 1X (Tabella 1) a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere 1 goccia di 0,1% PBST (Tabella 1) a ciascun pozzetto usando una pipetta monouso.
NOTA: detergente, ad esempio Tween 20, viene aggiunto per abbassare la tensione superficiale, che il tessuto si depositano sul fondo del pozzo. - Posizionare la piastra piatta sul ghiaccio.
- Raccogliere le larve nel sezionare pozzi piatto pieno di PBS 1x.
- Posizionare un pad dissezione pulito su una base stereomicroscopio illuminato. Utilizzare una pipetta usa e getta per posizionare Small scende dello 0,01% PBST (Tabella 1) sul pad. Trasferire una larva di una goccia PBST per la dissezione.
- Tenere la larva con un paio di pinze a circa la lunghezza di un quarto dalla fine posteriore, dorsale verso l'alto.
- Utilizzare un altro paio di pinze per afferrare la cuticola anteriori immediatamente alle pinze che stanno frenando la larva. Tirare delicatamente la cuticola verso l'estremità anteriore fino a quando i ganci bocca sono esposti.
NOTA: L'obiettivo è quello di sbucciare la cuticola senza disturbare eventuali strutture interne. - Rilasciare la cuticola e utilizzare entrambe le pinze per tagliare la larva in due. Rimuovere l'estremità posteriore dalla goccia PBST.
NOTA: Se la cuticola non buccia fino ai ganci bocca, tagliare la larva in due e togliere la fine posteriore. Utilizzare un paio di pinze per afferrare il bordo della cuticola, e utilizzare l'altra coppia di pinze per spingere i ganci bocca attraverso l'apertura. Questo invertire la cuticola ed esporre i ganci bocca. Questo può essere usato come alternate metodo dissezione pure. - Utilizzare un paio di pinze da definire la cuticola (sia la cuticola ventrale, il lembo dorsale cuticola, o entrambi) per la stabilità.
- Utilizzare un altro paio di pinze per afferrare i ganci bocca esposti e delicatamente tirare fuori.
NOTA: Questo separerà la cuticola dalle strutture interne. Idealmente, l'occhio / dischi immaginali antennali, cervello, ghiandole anello, e ghiandole linfatiche che fiancheggiano il vaso dorsale rimane attaccato ai ganci bocca. - Mentre ancora in mano i ganci bocca, rimuovere con attenzione le strutture indesiderate come ad esempio le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e intestino.
NOTA: Se il cervello separa dai ganci della bocca, la ghiandola linfatica potrebbe essere ancora attaccato ai raccolti e con il cervello. In questo caso, tenere il cordone nervoso ventrale invece dei ganci bocca. - Utilizzando i ganci bocca o cordone nervoso ventrale come una maniglia, trasferire il complesso sezionato contenente la ghiandola linfatica al pozzo sul ghiaccio. Non superare 30 minprima della fissazione.
- Fissazione e immunoistochimica
- Posizionare la piastra 24 pozzetti sulla base stereomicroscopio.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBST dal pozzo.
NOTA: Vuoto, pozzi vicini sono utili per depositare temporaneamente i rifiuti. - Aggiungere delicatamente 200 microlitri 3,7% di formaldeide (Tabella 1) lungo il lato del bene e agitare la piastra per garantire che i tessuti sezionati sono completamente sommerse.
- Riportare la piastra di ghiaccio per 30 min. Se le ghiandole linfatiche esprimono la proteina fluorescente (s), tenere la piastra coperta per evitare photobleaching.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il fissativo.
- Lavare aggiungendo 200 microlitri 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 5 min a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBS.
NOTA: fisso linfonodi possono essere lasciati sul ghiaccio in PBS fino ghiandole linfatiche per tutte le condizioni sperimentali sono dissected e fissa. - Ripetere il lavaggio passaggi altre due volte.
- Aggiungere 200 microlitri soluzione permeabilizzazione (Tabella 1) al pozzo. Impostare la piastra su un agitatore orbitale per 45 minuti a RT.
NOTA: 45 min è il "gold standard" per la linfa ghiandola permeabilizzazione ma gli autori hanno successo dopo soli 20 minuti. - Rimuovere la soluzione con una pipetta p200.
- Diluire anticorpo primario con soluzione di anticorpi (Tabella 1) secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 ml soluzione di anticorpo primario al bene e garantire che i tessuti dissezionati sono completamente sommerse. Incubare a 4 ° C durante la notte.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l'anticorpo primario.
- Lavare aggiungendo 200 microlitri 1x PBS al pozzo e posizionando la piastra su un agitatore orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con attenzione il PBS.
- Ripetere il lavaggio passaggi altre due volte.
- Diluire una secondariantibody con soluzione di anticorpi secondo le specifiche del fornitore. Aggiungere 300 ml soluzione di anticorpo secondario al pozzo e garantire che i tessuti dissezionati sono completamente sommerse. Incubare su un agitatore orbitale per almeno 2 ore a RT.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere l'anticorpo secondario e lavare come descritto nei passaggi 4.3.12 e 4.3.13. Non rimuovere la PBS dopo il lavaggio finale.
- Linfa montaggio ghiandola
- Pulire microscopio in vetro diapositive utilizzando etanolo al 70% (Tabella 1) e salviette di tessuto.
- Per ciascuna condizione sperimentale, posizionare una goccia di montaggio tampone (Tabella 1) sul vetrino.
NOTA: Due condizioni stare su una diapositiva. Montaggio polmone dipende dal numero di ghiandole linfatiche da montare. Utilizzare 2 ml per circa 18 - 20 ghiandole linfatiche, 1 ml per 10 - 12, e 0,5 microlitri per 5 o meno. - Posizionare il vetrino da microscopio su una base stereomicroscopio illuminato.
- Per un massimo di due condizioni alla volta, trasferire tutti i ghiandole linfatiche dal pozzo al buffer di montaggio con una pinza, utilizzando i ganci bocca o cordone nervoso ventrale come impugnatura.
- Spazio tessuti sezionati in modo uniforme in una forma circolare o rettangolare, diffondendo il buffer di montaggio nel processo.
- Per singoli tessuti sezionati, singolarmente, far scorrere una pinza della pinza sotto il vaso dorsale e tirare delicatamente verso la periferia del buffer di montaggio.
NOTA: Questo attirerà la linfa ghiandola dal resto dei tessuti sezionati e appiattire la ghiandola linfatica sul vetro. - Utilizzando una pinza della pinza e di un movimento di taglio, tagliare il vaso dorsale tra la ghiandola linfatica e il cervello.
- Spostare il resto dei tessuti sezionati al lato opposto della ghiandola linfatica, sul bordo esterno del buffer.
NOTA: I tessuti sezionati indesiderati finiranno per formare un perimetro attorno alle ghiandole linfatiche e servire da supporto su which il vetrino riposerà. - Ripetere l'operazione fino a quando tutti i linfonodi sono separati dai tessuti sezionati, riservando uno dei tessuti sezionati indesiderati svolge nel centro.
- Prendete un vetrino tra due dita. Verificare che il vetrino sia privo di polvere e impronte digitali. Se necessario, usare un tessuto wipe e il 70% di etanolo per pulire il vetrino.
- Assicurare che il bordo del vetrino è parallela al bordo del vetrino, attenzione abbassare il vetrino sul tampone di montaggio.
NOTA: i vetrini del microscopio possono essere conservati a 4 ° C prima di imaging. Il tempo massimo di memorizzazione dipende dalla stabilità degli anticorpi utilizzati. piastre da 24 pozzetti possono essere lavati e riutilizzati.
5. Imaging
- Immagine hemocytes fisso e montato ghiandole linfatiche su una fluorescenza standard appropriato o microscopio confocale a 20X di ingrandimento o superiore in base alle istruzioni per l'uso del produttore. Immagine intera larve su un supportostereomicroscopio ARD a 2X ingrandimento in base alle istruzioni per l'uso del produttore.
- Seguire le istruzioni del fornitore di software per la deconvoluzione, se lo si desidera.
| Soluzione | Composizione | Conservazione | Commenti |
| 1x PBS | cloruro di potassio / L 200 mg | temperatura ambiente | |
| 200 mg / L di fosfato di potassio monobasico | |||
| cloruro di sodio / L 8.000 mg | |||
| 1.150 mg / L di fosfato sodico bibasico | |||
| dH 2 O | |||
| Fissativo | 3,7% o 7,5% di formaldeide in PBS 1x | temperatura ambiente al buio | La formaldeide è tossica. |
| soluzione permeabilizzazione / diluente anticorpo | 0,4% Triton | 4 ° C | La formula standard utilizza 0,4% Triton ma gli autori utilizzano 0,1% Tween 20 con successo. Utilizzare per diluire gli anticorpi primari e secondari in base alle concentrazioni consigliate fornitori. |
| 5% albumina di siero bovino, siero normale di capra, o siero normale asino | |||
| 1x PBS | |||
| 70% di etanolo | 70% di etanolo 200 prova a dH2O | temperatura ambiente | |
| buffer di montaggio | 0,5% N-propil gallato | 4 ° C al buio | N-propil gallato è dannoso. DAPI è un agente mutageno. |
| 80% glicerolo | |||
| Opzionale: 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% di Tween 20 in PBS 1x | temperatura ambiente | |
| 0,01% PBST | Diluizione 1:10 di 0,1% PBST | temperatura ambiente |
Tabella 1. Soluzioni utilizzati nel presente protocollo.
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Representative Results
Di circolazione hemocyte Concentrazione
Numeri hemocyte aumentano durante lo sviluppo larvale 35. Per illustrare che questo metodo rileva le differenze nei numeri hemocyte e concentrazione, indipendentemente dalla causa biologica, abbiamo misurato concentrazioni hemocyte di ritardo e non ritardata larve. Perdita di ormone prothoracicotropic (ptth) per l'ablazione genetica dei neuroni ptth produttrici (ptth> cupo) produce un ritardo nello sviluppo larvale 36. Per ciascun genotipo, le concentrazioni sono state misurate hemocyte come descritto nel protocollo 1 per almeno 8 larva individuale sollevata a 25 ° C. A 120 ore dopo una raccolta delle uova 2 ore, la concentrazione media hemocyte per ritardato larva (ptth> triste) è inferiore alla concentrazione media hemocyte per larva di controllo (ptth). Solo dopo 9 giorni fa la concentrazione media hemocyte per approccio larva ritardato quello dei controlli (
Le immagini scattate da un contatore di cellule automatizzato mostrano una, campione emolinfa desiderabile pulito e un campione contenente residui, che potrebbe condurre a misurazioni imprecise (Figura 1C). dimensioni minime e massime delle celle sono stati fissati per 2 micron e 22 micron, rispettivamente. Circolarità è stato fissato al 75-80% rotondità. Questi parametri sono da intendersi come linee guida e devono essere empiricamente ottimizzati.
Di circolazione hemocyte immunoistochimica
Emociti circolanti che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sono stati raccolti, fissi, e incubate con una miscela di anticorpi specifici plasmatocyte (P1a e P1B, István ANDO) 31, come descritto nel protocollo 2(Figura 2). L'immagine è stata scattata su un microscopio a fluorescenza standard ed è mostrato inalterato e dopo costretto deconvoluzione iterativa. In questo caso, deconvoluzione non migliora drasticamente la qualità dell'immagine.
In Vivo cristallo cellulare melanizzazione
Le larve sono stati posti sul fondo dei tubi PCR prima termicamente indotta cellule melanizzazione cristallo come descritto nel protocollo 3 (Figura 3A). Le frecce rosse indicano tubi in cui larve sono troppo lontano dal fondo e potrebbe essere riscaldato in modo non uniforme. distribuzione non uniforme del calore attraverso larva individuo può aumentare la variabilità nella melanizzazione delle cellule di cristallo all'interno della larva.
Una wild-type larva ripreso su uno stereomicroscopio di serie mostra l'andamento tipico delle cellule di cristallo melanized in cluster sessili dopo l'esposizione al calore (Figura 3B). celle a cristalli Melanized nella ghiandola linfatica sono a volte visto.
Larvale linfa Gland immunoistochimica
Terzo stadio larvale ghiandole linfatiche sono stati sezionati, fissi, e montati come descritto nel protocollo 4. Un'immagine contrasto interferenziale differenziale (DIC) assunto un microscopio a fluorescenza di serie mostra i lobi delle ghiandole linfatiche primarie e secondarie che fiancheggiano il vaso dorsale (Figura 4A).
Una ghiandola linfatica in cui la zona midollare e il centro di segnalazione posteriori sono stati geneticamente contrassegnati con una maggiore proteina fluorescente blu (EBFP2) e GFP, rispettivamente era macchiato di un anticorpo contro il Notch dominio intracellulare (C17.9C6, Developmental Studies Ibridoma Bank) descritto nel protocollo 4. immagini Z-stack sono stati presi su un microscopio a fluorescenza standard. Una singola massima int immagine proiettata ensità appare inalterato e dopo costretto deconvoluzione iterativa (Figura 4B). In questo caso, deconvoluzione drasticamente migliorato la qualità e dettaglio dell'immagine.
Figura 1. circolazione hemocyte concentrazione. A) Una porzione di terreno standard Drosophila è stato rimosso (a destra) per promuovere la deposizione delle uova nel corso di un periodo di raccolta delle uova 2 ore. B) La concentrazione media hemocyte per ritardo nello sviluppo larva (ptth> triste) è stato inferiore a quello la concentrazione media hemocyte per le larve di controllo (ptth) 120 ore dopo la deposizione delle uova (AEL). La concentrazione media hemocyte per ritardato larva avvicinato livello di controllo 9 giorni AEL. Le barre di errore rappresentano ± sem C) i campioni emolinfa senza (a sinistra) e di detriti (a destra). Barre di scala rappresentano 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. circolazione hemocyte immunoistochimica. Ematociti concentrati esprimere geneticamente GFP sono stati raccolti e fissato ad un vetrino. Un anticorpo specifico per plasmatocyte è stato utilizzato per plasmatocytes macchia (rosso). Colorazione DAPI è mostrata in blu. immagine inalterata presa con un microscopio a fluorescenza (a sinistra). La stessa immagine dopo deconvoluzione (a destra). Barre di scala rappresentano 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. In Vivo A) Le larve sono stati posti singolarmente in tubi di PCR prima del riscaldamento. Le frecce rosse indicano le larve che non sono in fondo dei tubi B) Un modello tipico melanizzazione cella di cristallo dopo il riscaldamento, che a volte rivela la ghiandola linfatica (freccia;. Lato dorsale mostrato, anteriore è a sinistra). Barra di scala rappresenta 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Un'immagine DIC di un terzo stadio larvale ghiandole linfatiche che mostra il vaso dorsale (dv), lobi principali (1 °), e lobi secondari (2 °) larvale delle ghiandole linfatiche immunoistochimica. A). Barra della scala rappresenta 100 micron. B) Un rappresentante terzo stadio larvale linfa ghiandola from una larva esprimere geneticamente EBFP2 nella zona midollare GFP nel centro di segnalazione posteriore. La ghiandola linfatica era macchiato di un anticorpo contro il dominio intracellulare Notch (rosso). immagine inalterata presa con un microscopio a fluorescenza (in alto). La stessa immagine dopo deconvoluzione (in basso). Barre di scala rappresentano 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Su alterazione genetica o ambientale, i quattro metodi descritti qui possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione di analizzare i processi distinti durante emopoiesi, come la segnalazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione Drosophila emopoiesi è un processo dinamico.; il numero di hemocytes per animale aumenta 35 e la struttura e l'espressione genica della ghiandola linfatica variazioni 32 durante lo sviluppo. Prima di eseguire questi test, quindi, è fondamentale per limitare le collezioni di uova da garantire che le femmine a deporre le uova per un certo periodo di tempo e per confermare la fase di sviluppo larvale desiderato. Per le collezioni più brevi di uova (meno di 6 ore) o per i casi in cui le femmine sono malsani o scarsa, la deposizione delle uova può essere incoraggiata attraverso la creazione di fessure nel cibo. Questo può essere ottenuto rimuovendo una porzione di cibo con una spatola di etanolo puliti. Se il liquido in eccesso si accumula nel cibo, l'uso del tessuto salviette per prendere illiquido. (Vedi Figura 1A).
Da solo, i metodi descritti qui hanno dei limiti. Per esempio, la misurazione concentrazione hemocyte circolante cattura le modifiche in termini di sopravvivenza hemocyte o la proliferazione, ma non fornisce informazioni sulla distribuzione lignaggio hemocyte o qualsiasi interruzione lignaggio che potrebbe essere conseguente alterazione genetica o ambientale. Al contrario, immunoistochimica di ematociti concentrati circolanti rivela cambiamenti in specifiche linee hemocyte nel emolinfa ma solo nei numeri relativi e non assoluti. Melanizzazione cella di cristallo in vivo è difficile quantificare la distribuzione delle cellule di cristallo è variabile e hemocytes sessili sono dinamici 8,10. Piuttosto, più gli individui dovrebbero segnare melanizzazione cella di cristallo alla cieca. Infine, le osservazioni fatte in un compartimento hemocyte potrebbe non necessariamente vero in altri compartimenti.
Quando usati insieme, questi test possono essere applicati per distinguere genealterazioni tic che regolano la proliferazione e la sopravvivenza da quelle che regolano l'espressione genica o differenziazione. Per esempio, una alterazione genetica può aumentare proliferazione di hemocytes tale concentrazione aumenta hemocyte ma le proporzioni relative linee hemocyte rimane lo stesso. In alternativa, una alterazione genetica può promuovere cambiamenti nella differenziazione hemocyte in linee specifiche con nessun effetto sulla concentrazione complessiva hemocyte. La popolazione di cellule cristallo può essere interrogato in modo rapido e semplice utilizzando il metodo di vivo melanizzazione in, facilitando schermi genetici e studi di interazione genetica. Questo metodo può essere utilizzato in conferme con studi genetici che utilizzano prophenoloxidase 1 (PPO1, chiamati anche cellule nere, Bc) alleli mutanti o saggi di immunoistochimica che utilizzano anticorpi specifici cella di cristallo. La ghiandola linfatica larvale può essere utilizzato per affrontare questioni simili per quanto riguarda i processi cellulari ematopoietiche. Numerosevie di segnalazione sono coinvolti nello stabilire e mantenere la ghiandola linfatica e le sue principali zone. Ogni zona ha l'espressione genica distinto e funzione nella emopoiesi larvale. Inoltre, utilizzando la ghiandola linfatica può rivelare funzioni autonome e non autonomi all'interno delle zone delle ghiandole linfatiche o hemocytes delle ghiandole linfatiche.
Metodi rilevanti per lo studio Drosophila emopoiesi sono state compilate in risorse testuali complete solo di recente 26,27. Anche se indispensabile per il campo, queste risorse sono limitate nella portata. Metodi per misurare la concentrazione hemocyte, per esempio, non sono stati inclusi. metodi scritte, in particolare quelli che descrivono le tecniche di dissezione, può essere difficile da padroneggiare rapidamente. Ulteriori contributi sono stati fatti, fornendo risorse visive per assistere con i metodi, ma erano ancora in numero limitato e in ambito 28,29. I metodi descritti qui, ma anche di non completo, aggiungere alle risorse Available per aiutare nello studio della Drosophila emopoiesi.
Offriamo modifiche e alternative alle protocolli esistenti. Per esempio, ci sono diversi vantaggi per misurare la concentrazione hemocyte con un contatore di cellule automatizzato piuttosto che un emocitometro manuale, tra cui una maggiore velocità, facilità e obiettività. Nella nostra esperienza, utilizzando un bagno di acqua per riscaldare larve per la visualizzazione cella di cristallo determinato risultati ampiamente variabili, soprattutto se le larve sono riscaldati in fiale in cui sono sollevate. Riscaldamento larve in provette da PCR singoli ha dato risultati meno variabili e più riproducibili. Il metodo di dissezione linfa ghiandola descritto qui, anche se in precedenza delineata in un protocollo scritto 26, fornisce un'alternativa ai riferimenti visivi attuali 28. Infine, se l'accesso ad un microscopio confocale è limitato, suggeriamo che deconvoluzione di immagini di fluorescenza standard, potrebbe essere un sostituto adatto per le immagini confocale. Deconvolutisu algoritmi rimuovere o riassegnare out-of-focus luce catturata mediante microscopia a fluorescenza convenzionale, migliorando la risoluzione e contrasto simile principio all'eliminazione della luce fuori fuoco mediante microscopia confocale, e può essere applicato a 2-dimensionale e 3- dimensionali (Z-stack) immagini. Per alcune applicazioni, come dimostrato qui, deconvoluzione può migliorare notevolmente le immagini scattate con microscopi a fluorescenza convenzionali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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