Summary
Drosophila och däggdjur hematopoetiska system har många gemensamma drag, vilket gör Drosophila en attraktiv genetisk modell för att studera blodbildningen. Här kan vi visa dissekering och montering av stora larver hematopoetiska organ för immunohistokemi. Vi beskriver också metoder för att analysera olika larver hematopoetiska fack inklusive cirkulerande hemocyter och fastsittande kristallceller.
Abstract
Många paralleller finns mellan Drosophila och däggdjur hematopoetiska system, även om Drosophila saknar lymfoida som kännetecknar däggdjur adaptiv immunitet. Drosophila och däggdjur hematopoes förekommer i rummet och tiden distinkta faser för att producera flera blod cellinjer. Båda systemen upprätthålla reservoarer av blod stamceller som att utöka eller ersätta mogna linjerna. Det hematopoetiska systemet tillåter Drosophila och däggdjur att reagera på och anpassa sig till immun utmaningar. Viktigt är de transkriptionsregulatorer och signalvägar som styr produktion, underhåll och funktion av det hematopoietiska systemet bevaras från flugor till däggdjur. Dessa likheter tillåter Drosophila som skall användas för att genetiskt modell hematopoietisk utveckling och sjukdom.
Här har vi detalj analyser för att undersöka det hematopoietiska systemet Drosophila larver. ISärskilt vi beskriva metoder för att mäta blodcellantal och koncentration, visualisera en specifik mogen härstamning in vivo, och utför immunohistokemi på blodkroppar i cirkulation och i hematopoetisk orgel. Dessa analyser kan avslöja förändringar i genuttryck och cellulära processer, inklusive signalering, överlevnad, proliferation och differentiering och kan användas för att undersöka en rad olika frågor som rör blodbildningen. Kombinerat med de genetiska verktyg som finns i Drosophila, kan dessa analyser användas för att utvärdera det hematopoietiska systemet på definierade genetiska förändringar. Även om det inte specifikt beskrivs här, kan dessa analyser även användas för att undersöka effekten av miljöförändringar, såsom infektion eller diet, på det hematopoietiska systemet.
Introduction
De komplexa mekanismer som reglerar transkriptionsfaktorer och signalvägar som koordinerar utvecklingen av det hematopoietiska systemet och att fel i hematologiska sjukdomar fortfarande dåligt kända. Dessa transkriptionsfaktorer och signaleringsvägar, liksom deras reglering, är starkt konserverade mellan Drosophila och däggdjur hematopoes 1-5. Således Drosophila hematopoetiska systemet utgör ett utmärkt genetisk modell för att definiera de molekylära mekanismer som styr blodbildningen och underliggande hematologiska sjukdomar.
I likhet med däggdjur, Drosophila generera blodkroppar, så kallade hemocyter, i rummet och tiden distinkta faser av blodbildningen. Traditionellt har Drosophila hematopoies tros vara begränsad till faserna i den embryonala mesoderm och i larvlymfkörtel. Nya studier visar att blodbildningen förekommer också i larv sessila cluhyllor och i den vuxna buken 6-8. Alla hematopoetiska faser producerar två typer av mogna hemocyter: plasmatocytes och kristallceller. Plasmatocytes är makrofagliknande celler involverade i fagocytos, medfödd immunitet och sårläkning. Kristallceller innehåller pro-fenoloxidaser krävs för melanin, en reaktion som används i insektsimmunsvar och sårläkning. Larver hematopoies kan generera en tredje mogen hemocyte typ, en så kallad lamellocyte, som svar på vissa immun utmaningar som parasitsteklar infektion 9,10. Lamellocytes är stora, vidhäftande celler som fungerar i samband med plasmatocytes och kristallceller, för att kapsla in och neutralisera ägg geting som i Drosophila larver. I frånvaro av parasitization är lamellocytes hittades inte i vildtyp larver. Melanotiska massorna likna melanized, inkapslade geting ägg; många muterade Drosophila stammar utveckla melanotiska massorna i frånvaro av parasitization. Närvaron av Lamellocyter och / eller melanotiska massorna kan vara indikativ för hematopoetiska abnormaliteter. I själva verket har melanotiska mass fenotypen använts för att identifiera gener och vägar som är involverade i blodbildningen 11-14.
Larver hematopoetiska systemet är den mest omfattande som hittills studerats. Den består av hemocyter cirkulerar i hemolymfa, fastsittande hemocyte kluster mönstrade under nagelbanden, och hemocyter bosatta i lymfkörtel. Den lymfkörtel är en rad bilaterala lober knutna till ryggkärlet. Varje primär loben av lymfkörtel är uppdelad i tre huvudzoner. Den yttersta zonen kallas kortikala zonen och innehåller mognar hemocyter. Det innersta zon kallas medullära zonen och består av vilande hemocyte prekursorer. Den tredje zonen, den bakre signaleringscentrum, är en liten grupp celler vid basen av den lymfkörtel att fungera som en stamcellsliknande nisch. Tidigt arbete etablerat kritiska funktioner för Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18, och Vinglösa 21 aktivitet för att reglera larver lymfkörtel utveckling. Nyare studier har visat att BMP 22, FGF-Ras 23, och Hippo 24,25 signalfunktion också inom larvlymfkörtel.
Fyra larver hematopoetiska analyserna beskrivs här beskriva 1) mäter cirkulerande hemocyte koncentration, definierad som antalet celler per volymenhet, 2) isolering och fixering cirkulerande hemocyter för immunohistokemi, 3) visualisera kristallceller in vivo, och 4) dissekera, fixering och montering lymfkörtlar för immunohistokemi. Dessa analyser kan användas som hematopoetiska avläsning för att bedöma funktioner och förordningar signalvägar i larv hematopoietiska systemet. Även om dessa metoder har använts tidigare på området, har visuell dokumentation av dessa analyser börjat nyligen 8,26-30. Flera publikationer citeras här är hjälpfulla resurser som beskriver liknande metoder och hematopoetiska markörer 26,31-33. Dessutom Trol och Viking är användbara markörer för lymfkörtelbasalmembranet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cirkulerande hemocyte Koncentration
- För att få larver av ungefär samma utvecklingsstadium för denna analys, begränsa insamling av ägg genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en bestämd tidsperiod av 2-6 timmar.
- Samla larver i dissekera skålen brunnar fyllda med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, tabell 1).
- För varje larv, placera 10 l 1x PBS i ett mikrocentrifugrör på is och 10 pl 1 x PBS på en ren dissekera pad. Placera dissekera pad på en upplyst stereo bas.
- Torka en enskild larv genom att placera den på en vävnad torka innan den överförs till en PBS droppe på dissekering pad.
- Med hjälp av en pincett, försiktigt riva upp och försiktigt invertera nagelband att frigöra hemolymfa.
OBS: Var noga med att inte skrapa eller jab nagelbanden, eftersom detta skulle kunna släppa fastsittande hemocyter 29. - Med hjälp av en pipett, samla hemolymfa från dissekera dynan. undvika collecting larver skräp såsom fett kroppen.
- Lägg hemolymfa till ett mikrocentrifugrör och blanda genom att pipettera upp och ner.
OBS: Flera prover kan samlas in på en gång och hölls på is i upp till en timme. - Valfritt: Blanda trypanblått med hemolymfa provet i lika delar att färga och utesluta döda celler. Räkna celler inom 3 min av tillsats av trypanblått för att det är giftigt för celler.
- Blanda provet genom att pipettera upp och ner innan du lägger 10 pl i en hemocytometer kammaren.
- Om du använder en automatiserad cellräknare, fastställa lämpliga parametrar för cellstorlek och cirkel. Till exempel ställa en minsta cellstorlek av 2 pm, en maximal cellstorlek av 22 um, och en cirkel 75 - 80% rundhet för att detektera normala, runda hemocyter 34. Experimentera med olika parametrar för att upptäcka större och spolformad hemocyter, såsom lamellocytes. Alternativt kan du använda en hemocytometer för att manuellt räkna hemocyter.
2. Circulating hemocyte Immunohistokemi
- För att få larver av ungefär samma utvecklingsstadium för denna analys, begränsa insamling av ägg genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en bestämd tidsperiod av 2-6 timmar.
- Placera ett täckglas i varje brunn i en 6-eller 12-brunnars platta.
OBS: Square täck (22 mm) passar i 6-brunnsplattor och runda täck (18 mm diameter) passar i 12-brunnsplattor. - Samla larver i dissekera skålen brunnar fyllda med 1x PBS.
- Placera 5 l 1x PBS i mitten av varje täck.
- Placera plattan på en upplyst stereo bas.
- Torka en enskild larv på en vävnad torka och sedan placera i PBS på täckglas.
- Med hjälp av en pincett, försiktigt riva och försiktigt invertera nagelbanden. Innan du tar bort larver stommen, använda den för att sprida hemolymfa jämnt.
OBS: Var noga med att inte skrapa eller jab nagelbanden, eftersom detta skulle kunna släppa fastsittande hemocyter 29. - RepeaT för alla larver, uppsamling av hemolymfa av en larv per täckglas. Låt hemocyter att följa täck för 5 -. 8 min vid rumstemperatur RT inte överstiga 30 minuter före fixering.
- Fixa hemocyter genom tillsats av 5 | il av 7,5% formaldehyd (tabell 1) till varje täckglas under 15 min vid rumstemperatur.
- Tvätta täck tre gånger med 1 x PBS. Tips plattan och aspirera PBS efter varje tvätt. För att förhindra avrinning av permeabilization lösning i nästa steg, använd aspirator för att avlägsna överskott av PBS från omkretsen av täckglasen.
- Tillsätt 100 | il permeabilization lösning (tabell 1) till varje täckglas under 20 min vid RT.
- Tips och knacka försiktigt på plattan för att aspirera permeabilization lösning.
- Späd primär antikropp med antikroppslösning (tabell 1) i enlighet med leverantörens specifikationer. Tillsätt minst 500 l primära antikroppen lösning täck i 12-brunnsplattor.Tillsätt minst 1,5 ml i 6-brunnsplattor. Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta täckglas med 1 x PBS under 10 min på en orbital skakanordning, tre gånger.
- Späd sekundär antikropp med antikroppslösning enligt leverantörens specifikationer. Tillsätt minst 500 l sekundär antikropp lösning på täckglas i 12-brunnsplattor. Tillsätt minst 1,5 ml för 6-brunnsplattor. Inkubera under åtminstone 2 h vid RT.
- Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta täckglas med 1 x PBS under 10 min på en orbital skakanordning som i steg 2,10, tre gånger.
- Under tvättstegen, rent glas objektglas med 70% etanol (tabell 1) med användning av vävnads våtservetter. För varje täck, placera 5 pl monteringsbuffert (tabell 1) på objektglas.
OBS: Två täck plats på en bild. - Aspirera den slutliga PBS-tvätt.
- Använd pincett för att försiktigt ta bort täck från plattorna och plats, inverted, på toppen av monteringsbufferten.
Obs! Objektglas kan förvaras vid 4 ° C före avbildning. Maximal lagringstid beror på stabiliteten i de antikroppar som används. 6- och 12-brunnars plattor kan sköljas och återanvändas.
3. In vivo-kristallcell melanin
- För att få larver av ungefär samma utvecklingsstadium för denna analys, begränsa insamling av ägg genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en bestämd tidsperiod av 2-6 timmar.
- Innan du börjar ställa in en värmekälla vid 60 ° C.
ANMÄRKNING: En termisk cycler program för 60 ° C under 10 min (följt av en 25 ° C hold) fungerar bäst, men ett vattenbad eller annan värmekälla är tillräcklig så länge värmen konsekvent och jämnt fördelade över varje larv. - Samla larver i dissekera skålen brunnar fyllda med 1x PBS (tabell 1).
- En i taget, torka en larv på en vävnad torka och plats längst ned i en PCR-rör. Placera varje larvi en separat PCR-rör. (Se figur 3A.)
- För konsekventa resultat, se till att larver vistelse på botten av PCR-rören genom kylning larver i rören vid 4 ° C under 10 - 15 min och / eller försiktigt knacka rören före uppvärmning.
- Placera PCR-rören i termocyklern (eller vattenbad). Värm vid 60 ° C under 10 min.
- Försiktigt bort larver från PCR-rören i dissekera skålen brunnar fyllda med färsk 1x PBS.
- Torr larver på en vävnad torka och ordna på ett plant underlag för avbildning under ett stereomikroskop.
- Betyg bilder av larver blint av flera personer.
4. Larvlymfkörtel Immunohistokemi
OBS: lymfkörtel ligger ca en tredjedel längd från den främre änden av en larv något under hjärnan på ryggsidan. (Se pilen i figur 3B). Den lymfkörtel flankerar den dorsala kärlet och enklast dissekeras fäst munnen hooks eller till hjärnan. Vild-typ, tredje stadiet lymfkörtlar är mycket små strukturer; de primära lober är cirka 100-200 nm i längd. (Se figur 4A.)
- För att få larver av ungefär samma utvecklingsstadium för denna analys, begränsa insamling av ägg genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en bestämd tidsperiod av 2-6 timmar.
- Lymfkörtel dissektion
- För varje experimentell betingelse tillsätts 1 ml 1 x PBS (tabell 1) till en brunn i en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 1 droppe av 0,1% PBST (tabell 1) till varje brunn med en disponibel överföringspipett.
OBS: Tvättmedel, såsom Tween 20, tillsätts för att sänka ytspänningen, vilket gör att vävnaden för att sjunka till botten av brunnen. - Placera plattan plant på is.
- Samla larver i dissekera skålen brunnar fyllda med 1x PBS.
- Placera en ren dissekera pad på en upplyst stereo bas. Använd en engångs överföringspipett att placera small droppar 0,01% PBST (tabell 1) på plattan. Överför en larv till en PBST droppe för dissekering.
- Håll larven med en pincett ungefär en fjärdedel längd från den bakre änden, ryggsidan uppåt.
- Använd en annan pincett att greppa nagelbanden omedelbart anterior till tången som håller larven. Dra försiktigt nagelbanden mot den främre änden tills munnen krokar exponeras.
OBS: Syftet är att skala nagelbanden utan att störa interna strukturer. - Släpp nagelband och använda båda pincett för att skära larven i två delar. Ta bort den bakre änden av PBST droppe.
OBS: Om nagelbanden inte skalas hela vägen till munnen krokar, skär larven i två och ta bort den bakre änden. Använd en pincett för att hålla kanten av nagelband, och använda andra pincett för att skjuta munnen krokar genom öppningen. Detta kommer att invertera nagelband och exponera munnen krokar. Detta kan användas som en alternåt dissekering metod också. - Använd en pincett för att hålla fast nagelband (antingen ventrala nagelband, rygg nagelbanden flik, eller båda) för stabilitet.
- Använd en annan pincett att greppa de exponerade munnen krokar och försiktigt dra ut dem.
OBS: Detta kommer att separera nagelbanden från de interna strukturer. Helst ska ögat / antenn imaginal skivor, hjärna, ring körtel, och lymfkörtel flankerar ryggens fartyget finns kvar på munnen krokar. - Medan han fortfarande håller munnen krokar, försiktigt bort oönskade strukturer som spottkörtlarna, fett kroppen och tarmen.
OBS: Om hjärnan separerar från munnen krokar, kanske lymfkörtel fortfarande är kvar och samlas med hjärnan. I det här fallet, håller den ventrala nerv sladd i stället för munnen krokar. - Använda munnen krokar eller ventrala nerv sladd som ett handtag, överföra dissekerade komplexet innehåller lymfkörtel till brunnen på is. Inte överstiga 30 minuterinnan fixeringen.
- Fixering och immunohistokemi
- Placera 24-brunnar på stereomikroskop basen.
- Använd en p200 pipett försiktigt bort PBST från brunnen.
OBS: Tom, angränsande brunnar är användbara för att tillfälligt sätta avfall. - Försiktigt lägga 200 l 3,7% formaldehyd (tabell 1) längs sidan av brunnen och snurra plattan för att säkerställa att de dissekerade vävnaderna är helt under vatten.
- Återföra plattan till is under 30 min. Om lymfkörtlar uttrycka fluorescerande protein (s), hålla plattan täckas för att förhindra fotoblekning.
- Använd en p200 pipett försiktigt bort fixativ.
- Tvätta genom att tillsätta 200 | il 1 x PBS till brunnen och placera plattan på en orbital shaker i 5 min vid rumstemperatur. Använd en p200 pipett försiktigt bort PBS.
OBS: Fast lymfkörtlar kan lämnas på is i PBS tills lymfkörtlar för alla experimentella betingelser är dissected och fixeras. - Upprepa tvättsteg två gånger till.
- Tillsätt 200 pl permeabilization lösning (tabell 1) till brunnen. Ställa plattan på en orbital shaker i 45 min vid RT.
OBS: 45 min är den "gyllene standarden" för lymfkörtel permeabilization men författarna har framgång efter bara 20 minuter. - Ta bort lösningen med en p200 pipett.
- Späd primär antikropp med antikroppslösning (tabell 1) i enlighet med leverantörens specifikationer. Tillsätt 300 l primära antikroppen lösning till brunnen och se till att de dissekerade vävnaderna är helt under vatten. Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Använd en p200 pipett för att ta bort den primära antikroppen.
- Tvätta genom att tillsätta 200 | il 1 x PBS till brunnen och placera plattan på en orbital shaker i 10 min vid rumstemperatur. Använd en p200 pipett försiktigt bort PBS.
- Upprepa tvättsteg två gånger till.
- Utspädd sekundär ettntibody med antikropp lösning enligt leverantörens specifikationer. Tillsätt 300 l sekundär antikropp lösning till brunnen och se till att de dissekerade vävnaderna är helt under vatten. Inkubera på en orbitalskak under minst 2 h vid RT.
- Använd en p200 pipett för att ta bort den sekundära antikroppen och tvätta som beskrivs i steg 4.3.12 och 4.3.13. Ta inte bort PBS efter den sista tvätten.
- Lymfkörtel montering
- Rent glas objektglas med användning av 70% etanol (Tabell 1) och vävnads våtservetter.
- För varje experimentell betingelse, placera en droppe monteringsbuffert (tabell 1) på objektglas.
OBS: Två villkor plats på en bild. Monteringsbuffertvolym beror på antalet lymfkörtlar som skall monteras. Använda 2 | il under ca 18-20 lymfkörtlar, 1 | il för 10-12, och 0,5 | il för 5 eller mindre. - Placera objektglas på en belyst stereo bas.
- För upp till två villkor samtidigt överföra alla lymfkörtlar från brunnen till monterings buffert med pincett, med hjälp av munnen krokar eller ventrala nerv sladd som ett handtag.
- Utrymme dissekerade vävnaderna jämnt i en cirkulär eller rektangulär form, sprider monterings buffert i processen.
- För var och en av de dissekerade vävnader, individuellt, skjut en tång av tången under ryggkärlet och dra försiktigt mot periferin av monteringsbufferten.
OBS: Detta kommer att dra lymfkörtel ut från resten av dissekerade vävnader och platta lymfkörtel på glaset. - Genom att använda en tång av pincett och en sågning rörelse, skär rygg kärlet mellan lymfkörtel och hjärnan.
- Flytta resten av dissekerade vävnader till den motsatta sidan av lymfkörtel, vid den yttersta kanten av bufferten.
OBS! Oönskade dissekerade vävnaderna så småningom kommer att bilda en omkrets runt lymfkörtlar och fungera som ett stöd på which täck kommer att vila. - Upprepa tills alla lymfkörtlar separeras från dissekerade vävnaderna, reservera en av de oönskade dissekerade vävnader att placera i mitten.
- Ta ett täckglas mellan två fingrar. Kontrollera att täck är fri från damm och fingeravtryck. Om det behövs, använd en vävnad torka och 70% etanol för att rengöra täck.
- Säkerställa att kanten på täckglaset är parallell till kanten av glasskivan, sänk försiktigt täckglas över monteringsbufferten.
OBS: Objektglas kan lagras vid 4 ° C före avbildning. Maximal lagringstid beror på stabiliteten i de antikroppar som används. 24-brunnars plattor kan sköljas och återanvändas.
5. Imaging
- Bild fasta hemocyter och monterade lymfkörtlar på en lämplig standard fluorescens eller konfokalmikroskop vid 20X eller högre förstoring enligt bruksanvisningen tillverkaren. Bild hela larver på ett stativard stereo vid 2X förstoring enligt bruksanvisningen tillverkaren.
- Följ programvara leverantörens anvisningar för avfaltning, om så önskas.
| Lösning | Sammansättning | Lagring | kommentarer |
| 1x PBS | 200 mg / L kaliumklorid | rumstemperatur | |
| 200 mg / L kaliumfosfat monobasisk | |||
| 8000 mg / L natriumklorid | |||
| 1150 mg / L natriumfosfat dibasisk | |||
| dH 2 O | |||
| Fixativ | 3,7% eller 7,5% formaldehyd i 1x PBS | rumstemperatur i mörker | Formaldehyd är giftigt. |
| Permeabilization lösning / antikroppsutspädningsmedel | 0,4% Triton | 4 ° C | Standardformeln använder 0,4% Triton men författarna använder 0,1% Tween 20 med framgång. Används för att späda primära och sekundära antikroppar enligt leverantörernas rekommenderade koncentrationerna. |
| 5% bovint serumalbumin, normalt getserum, eller normal donkey serum | |||
| 1x PBS | |||
| 70% etanol | 70% 200 proof etanol i dH2O | rumstemperatur | |
| monteringsbuffert | 0,5% N-propylgallat | 4 ° C i mörker | N-propylgallat är skadligt. DAPI är en mutagen. |
| 80% glycerol | |||
| Valfritt: 1 | ig / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% Tween 20 i 1 x PBS | rumstemperatur | |
| 0,01% PBST | 1:10 utspädning av 0,1% PBST | rumstemperatur |
Tabell 1. Lösningar som används i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cirkulerande hemocyte Koncentration
Hemocyte siffror ökar hela larvutveckling 35. För att illustrera att denna metod detekterar skillnader i hemocyte antal och koncentration, oberoende av den biologiska orsaken, mätte vi hemocyte koncentrationer av fördröjda och icke-fördröjda larver. Förlust av protoracikotrop hormon (PTTH) genom genetisk ablation av PTTH producerande nervceller (PTTH> bistra) producerar en fördröjning i larvutveckling 36. För varje genotyp, var hemocyte koncentrationer mätt som beskrivs i protokoll 1 för åtminstone åtta enskilda larv upp vid 25 ° C. Vid 120 timmar efter en 2 tim insamling av ägg, (PTTH> bistra) är mindre än den genomsnittliga hemocyte koncentrationen per kontroll larv (PTTH) Den genomsnittliga hemocyte koncentrationen per försenad larv. Först efter 9 dagar har den genomsnittlige hemocyte koncentrationen per försenad larv strategi som kontroller (
Bilder tagna från en automatiserad cellräknare visar en ren, önskvärt hemolymph prov och ett prov som innehåller skräp, vilket kan leda till felaktiga mätningar (Figur 1C). Lägsta och högsta cellstorlekar var inställd på 2 | j, m och 22 | j, m, respektive. Cirkel sattes till 75-80% rundhet. Dessa parametrar är avsedda som riktlinjer och bör empiriskt optimeras.
Cirkulerande hemocyte Immunohistokemi
Cirkulerande hemocyter som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) uppsamlades, fixerades och inkuberades med en blandning av plasmatocyte-specifika antikroppar (P1A och P1B, István ANDO) 31 såsom beskrivs i protokoll 2(Figur 2). Bilden togs på en standardfluorescensmikroskop och visas oförändrat och efter ansträngd iterativ avfaltning. I detta fall, gjorde avfaltning inte drastiskt förbättra bildkvaliteten.
In Vivo Crystal Cell melanin
Larver placerades på botten av PCR-rör före värmeframkallad kristallcell melanin såsom beskrivs i protokoll 3 (figur 3A). Röda pilar anger rör, i vilka larver är alltför långt från botten och kan upphettas ojämnt. Ojämn fördelning av värme över enskilda larv kan öka variationen i melaninkristall celler i larven.
Ett vildtyp larven avbildas på en standard stereomikroskop visar det typiska mönstret av melanized kristallceller i sessila kluster efter värmeexponering (Figur 3B). Melanized kristallceller i lymfkörtel ses ibland.
Larvlymfkörtel Immunohistokemi
Tredje stadiet larver lymfkörtlar dissekerades, fixerades, och monterade som beskrivs i protokoll 4. En differential interferens kontrast (DIC) bild tagen på en standardfluorescensmikroskop visar de primära och sekundära lymfkörtlarnas lober flankerar ryggens kärlet (Figur 4A).
En lymfkörtel i vilken den medullära zonen och den bakre signalering centrum var genetiskt märkt med förstärkt blå fluorescerande protein (EBFP2) och GFP, respektive, färgades med en antikropp mot Notch intracellulär domän (C17.9C6, Develop Studies Hybridoma Bank) som beskrivs i protokoll 4. Z-stack bilder togs på en standardfluorescensmikroskop. En enda maximal int ensity projektionsbild visas oförändrat och efter ansträngd iterativ avfaltning (Figur 4B). I detta fall, avfaltning drastiskt förbättrat kvaliteten och detaljer i bilden.
Figur 1. Cirkulerande hemocyte Koncentration. A) En del av standard Drosophila avlägsnades mediet (höger) för att främja äggläggning under en 2 tim ägg insamlingsperioden. B) Den genomsnittliga hemocyte koncentration per utvecklings fördröjd larv (PTTH> bistra) var lägre än den genomsnittliga hemocyte koncentrationen per kontroll larver (PTTH) 120 timmar efter äggläggning (AEL). Den genomsnittliga hemocyte koncentration per försenad larv närmade nivåreglering 9 dagar AEL. Felstaplar representerar ± sem C) hemolymfa prover utan (vänster) och med (höger) skräp. Skalstrecken representerar 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cirkulerande hemocyte Immunohistokemi. Hemocyter genetiskt uttrycker GFP samlades och fäst vid en täck. En plasmatocyte specifik antikropp användes för att färga plasmatocytes (röd). DAPI färgning visas i blått. Oförändrad bild tagen med ett fluorescensmikroskop (vänster). Samma bild efter avfaltning (höger). Skalstrecken representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. In vivo A) Larver placerades individuellt i PCR-rör före uppvärmning. Röda pilar indikerar larver som inte på botten av rören B) En typisk kristallcell melanin mönster efter uppvärmning, vilket ibland avslöjar lymfkörtel (pil;. Ryggsidan visas, är främre vänster). Skala stapel representerar en mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Larvlymfkörtel Immunohistokemi. A) En DIC bild av en tredje stadiet larver lymfkörtel visar ryggkärlet (dv), primära lober (1 °), och sekundära lober (2 °). Skala stapel representerar 100 nm. B) En representant tredje stadiet larver lymfkörtel from en larv genetiskt uttryck EBFP2 i märg zonen och GFP i den bakre ledningscentralen. Den lymfkörtel färgades med en antikropp mot Notch intracellulär domän (röd). Oförändrad bild tagen med ett fluorescensmikroskop (överst). Samma bild efter avfaltning (botten). Skalstrecken representerar 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid genetisk eller miljö förändring, kan de fyra metoder som beskrivs här kan användas var för sig eller i kombination för att analysera olika processer under hematopoies, såsom signalering, överlevnad, proliferation och differentiering Drosophila blodbildningen är en dynamisk process. antalet hemocyter per djur ökar 35 och strukturen och genexpression av lymfkörtel förändras 32 under utvecklingen. Innan du utför dessa analyser, därför är det viktigt att begränsa ägg samlingar genom att tillåta kvinnor att lägga ägg under en bestämd tid och att bekräfta den önskade larver utvecklingsstadiet. För kortare ägg samlingar (mindre än 6 h) eller för fall där kvinnor är ohälsosamma eller knappa, kan äggläggning uppmuntras genom att skapa sprickor i maten. Detta kan åstadkommas genom att avlägsna en del av livsmedel med en etanol-rengjord spatel. Om överskottsvätska ackumuleras i närings, våtservetter använda vävnad för att suga uppflytande. (Se figur 1A.)
Ensam, de metoder som beskrivs här har sina begränsningar. Till exempel, mätning av cirkulerande hemocyte koncentration fångar förändringar i hemocyte överlevnad eller proliferation men ger ingen information om hemocyte härstamning distribution eller någon härstamning störningar som kan vara en följd av genetiska eller miljömässiga förändringar. Omvänt, immunohistokemi cirkulerande hemocyter avslöjar förändringar i specifika hemocyte linjerna i hemolymfa men bara i relativa, inte absolut, siffror. Kristallcellen melanin in vivo är svår att kvantifiera distribution kristallcellen är rörlig och sessila hemocyter är dynamisk 8,10. Snarare bör flera personer poäng kristallcell melanin blint. Slutligen observationer i en hemocyte utrymmet inte nödvändigtvis hålla sant i andra avdelningar.
När de används tillsammans, kan dessa analyser användas för att skilja genentic förändringar som reglerar proliferation eller överlevnad från de som reglerar genuttrycket eller differentiering. Till exempel kan en genetisk förändring öka spridningen av hemocyter så att hemocyte koncentrationen ökar, men de relativa proportionerna av hemocyte linjerna förblir densamma. Alternativt kan en genetisk förändring främja förändringar i hemocyte differentiering till specifika linjer utan effekt på den totala hemocyte koncentration. Kristallcellpopulationen kan förhöras snabbt och enkelt med hjälp av in vivo melaninmetoden, vilket underlättar genetiska skärmar och genetiska interaktionsstudier. Denna metod kan användas i bekräftelse med genetiska studier som utnyttjar prophenoloxidase 1 (PPO1, även kallade svarta celler, BC) mutanta alleler eller immunohistokemiska analyser som utnyttjar kristallcellspecifika antikroppar. Larver lymfkörtel kan användas för att ta itu med liknande frågor om hematopoietiska cellulära processer. Talriksignalvägar är involverade i upprätta och upprätthålla lymfkörtel och dess större zoner. Varje zon har distinkt genuttryck och funktion i larv hematopoies. Dessutom kan utnyttja lymfkörtel avslöja autonoma och icke-självständiga funktioner inom lymfkörtlarnas zoner eller lymfkörtel hemocyter.
Relevanta metoder för att studera Drosophila hematopoies har sammanställts i omfattande textbaserade resurser nyligen 26,27. Även nödvändiga för att fältet är dessa resurser begränsad. Metoder för att mäta hemocyte koncentration, till exempel, inte ingick. Skriftliga metoder, särskilt de som beskriver dissektion tekniker, kan vara svårt att behärska snabbt. Ytterligare insatser har gjorts, vilket ger visuella resurser för att hjälpa till med metoder, men var fortfarande begränsade i antal och omfattning 28,29. De metoder som beskrivs här, samtidigt som inte heltäckande, lägga till resurserna AvalLabel för att underlätta studier av Drosophila hematopoies.
Vi erbjuder modifieringar och alternativ till befintliga protokoll. Till exempel finns det flera fördelar med att mäta hemocyte koncentration med en automatiserad cellräknare snarare än en manuell hemocytometer, inklusive ökad hastighet, enkelhet, och objektivitet. I vår erfarenhet, med hjälp av ett vattenbad för att värma larver för kristallcellen visualisering resulterade i mycket varierande resultat, särskilt om larverna värms i flaskorna där de föds upp. Värme larver i enskilda PCR-rör gav mindre rörliga och mer reproducerbara resultat. Den lymfkörtel dissektion metod som beskrivs här, men tidigare anges i ett skriftligt protokoll 26, ger ett alternativ till befintliga visuella referenser 28. Slutligen, om tillgång till en konfokalmikroskop är begränsad, föreslår vi att avfaltning av standardfluorescensbilder kan vara ett lämpligt substitut för konfokala bilder. Deconvolutipå algoritmer antingen ta bort eller omfördela out-of-fokus ljus fångas av konventionell fluorescensmikroskopi, förbättra upplösning och kontrast liknar i princip eliminering av out-of-fokus ljus genom konfokalmikroskopi, och kan tillämpas på två-dimensionella och 3- dimensionell (Z-stack) bilder. För vissa tillämpningar, såsom visas här, avfaltning kan dramatiskt förbättra bilder tagna med konventionella fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
