Summary
Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l' hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l'immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.
Abstract
De nombreux parallèles existent entre les systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et, même si la drosophile manque la lignée lymphoïde qui caractérisent l' immunité adaptative des mammifères. Drosophila et hématopoïèse mammifères se produisent dans spatialement et temporellement phases distinctes pour produire plusieurs lignées de cellules sanguines. Les deux systèmes maintiennent des réservoirs de progéniteurs des cellules de sang avec lequel se dilatent ou remplacent les lignées matures. Le système hématopoïétique permet la drosophile et les mammifères à réagir et à s'adapter aux défis immunitaires. Fait important, les régulateurs de la transcription et les voies de signalisation qui contrôlent la production, la maintenance et le fonctionnement du système hématopoïétique sont conservées des mouches à des mammifères. Ces similitudes permettent drosophile à être utilisé pour le développement hématopoïétique génétiquement modèle et la maladie.
Ici , nous analyses de détail d'examiner le système hématopoïétique des larves de drosophile. Dansparticulier, nous décrivons des méthodes pour mesurer le nombre de cellules sanguines et de la concentration, de visualiser une lignée mûre spécifique in vivo, et d' effectuer des immunohistochimie sur les cellules sanguines en circulation et dans l'organe hématopoïétique. Ces tests peuvent révéler des changements dans l'expression des gènes et des processus cellulaires, y compris la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation et peuvent être utilisés pour enquêter sur une variété de questions relatives à l'hématopoïèse. Combinée avec les outils génétiques disponibles chez la drosophile, ces essais peuvent être utilisés pour évaluer le système hématopoïétique à des altérations génétiques définies. Bien que non spécifiquement décrite ici, ces tests peuvent également être utilisés pour examiner l'effet des modifications de l'environnement, telles que l'infection ou l'alimentation, sur le système hématopoïétique.
Introduction
Les mécanismes complexes qui régissent les facteurs de transcription et les voies de signalisation qui coordonnent le développement du système hématopoïétique et un dysfonctionnement dans les maladies hématologiques restent mal compris. Ces facteurs de transcription et les voies de signalisation, ainsi que leur régulation, sont hautement conservées entre la drosophile et l' hématopoïèse mammifère 1-5. Ainsi , le système hématopoïétique Drosophila représente un excellent modèle génétique pour définir les mécanismes moléculaires contrôlant l' hématopoïèse et maladies hématologiques sous - jacentes.
Semblable à des mammifères, Drosophila générer des cellules sanguines, appelées hémocytes, dans spatialement et temporellement des phases distinctes de l' hématopoïèse. Traditionnellement, on pensait hématopoïèse chez la drosophile se limiter aux phases dans le mésoderme embryonnaire et dans les ganglions lymphatiques des larves. Des études récentes montrent que l'hématopoïèse se produit également dans des larves sessiles clustres et dans l'abdomen adulte 8/6. Toutes les phases hématopoïétiques produisent deux types d'hémocytes matures: plasmatocytes et les cellules de cristal. Plasmatocytes sont des cellules de type macrophage impliqués dans la phagocytose, l'immunité innée et la guérison des plaies. les cellules à cristaux contiennent des pro-phénoloxydases nécessaires à la mélanisation, une réaction utilisé dans les réponses immunitaires d'insectes et la cicatrisation des plaies. Hématopoïèse larvaire peut générer un troisième type hémocytaire mature, appelée lamellocyte, en réponse à certains problèmes immunitaires telles que l' infection par le parasite guêpe 9,10. Lamellocytes sont de grandes cellules adhérentes, qui fonctionnent en conjonction avec plasmatocytes et les cellules de cristal, afin d' encapsuler et de neutraliser les oeufs de guêpes définies dans les larves de Drosophila. En l'absence de parasitisme, lamellocytes ne sont pas trouvés dans de type sauvage larves. masses mélaniques ressemblent mélanisées, des œufs de guêpes encapsulées; de nombreuses souches mutantes de Drosophila développent des masses mélaniques en l'absence de parasitisme. La présence de lamellogamétocytes et / ou des masses mélaniques peuvent indiquer des anomalies hématopoiétiques. En effet, le phénotype de masse mélanique a été utilisé pour identifier les gènes et les voies impliquées dans l' hématopoïèse 11-14.
Le système hématopoïétique larvaire est le plus largement étudié à ce jour. Il est composé d'hémocytes circulant dans l'hémolymphe, les clusters de hémocytes sessiles modelées sous la cuticule et les hémocytes résidant dans le ganglion lymphatique. Le ganglion lymphatique est une série de lobes bilatéraux attachés au vaisseau dorsal. Chaque lobe primaire du ganglion lymphatique est divisée en trois zones principales. La zone la plus extérieure est connue comme la zone corticale et contient maturation hémocytes. La zone la plus interne est appelée la zone médullaire et comprend des précurseurs d'hémocytes de quiescence. La troisième zone, le centre de signalisation postérieure, est un petit groupe de cellules à la base de la glande lymphatique qui agissent comme une niche de cellules ressemblant à la tige. Les premiers travaux mis en place des fonctions critiques pour Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 et aptère 21 activité pour réguler le développement des glandes lymphatiques larvaire. Des études plus récentes ont démontré que la BMP 22, FGF-23 Ras et Hippo 24,25 signalisation fonctionnent également dans le ganglion lymphatique des larves.
Quatre essais de hématopoiétiques larves présentées ici décrivent 1) à mesurer circulant concentration hémocytes, défini comme le nombre de cellules par unité de volume, 2) l' isolement et la fixation de circulation hémocytes pour l' immunohistochimie, 3) visualisant des cellules à cristaux in vivo et 4) disséquant, la fixation et le montage glandes lymphatiques pour l'immunohistochimie. Ces dosages peuvent être utilisés pour évaluer les lectures hématopoiétiques les fonctions et les règlements des voies de signalisation dans le système hématopoïétique des larves. Bien que ces méthodes ont été utilisées précédemment dans le domaine, la documentation visuelle de ces essais a commencé que récemment 8,26-30. Plusieurs publications citées ici sont l'aideressources ful décrivant des méthodes similaires et les marqueurs hématopoïétiques 26,31-33. En outre, Trol et Viking sont des marqueurs utiles de la membrane glande lymphatique du sous-sol.
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Protocol
1. Circulating Concentration hémocytaire
- Pour obtenir des larves d'à peu près le même stade de développement pour ce dosage, limiter la collecte des œufs en permettant les femelles à pondre des oeufs pendant une période de temps fixe 2 - 6 h.
- Recueillir les larves dans disséquant puits plat rempli de phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS, tableau 1).
- Pour chaque larve, placer 10 ul 1x PBS dans un tube à centrifuger sur la glace et 10 pi de PBS 1x sur un tampon de dissection propre. Placez le tampon de dissection sur une base de stéréomicroscope illuminée.
- Sécher une larve individu en le plaçant sur un tissu d'essuyage avant de le transférer à une baisse de PBS sur le pavé de dissection.
- En utilisant une paire de pinces, déchirer délicatement ouvert et soigneusement inverser la cuticule pour libérer l'hémolymphe.
REMARQUE: Prenez soin de ne pas gratter ou jab la cuticule , car cela pourrait libérer hémocytes sessiles 29. - En utilisant une pipette, recueillir l'hémolymphe du tampon de dissection. Évitez collecting débris larvaire tels que le corps gras.
- Ajouter l'hémolymphe à un tube à centrifuger et mélanger par pipetage de haut en bas.
NOTE: Plusieurs échantillons peuvent être recueillis à la fois et conservés sur la glace jusqu'à une heure. - Facultatif: Mélanger Trypan bleu avec l'échantillon d'hémolymphe à parts égales à teindre et exclure les cellules mortes. Compter les cellules à moins de 3 min d'ajouter Trypan bleu parce qu'il est toxique pour les cellules.
- Mélanger l'échantillon par pipetage de haut en bas avant le chargement de 10 ul dans une chambre d'hémocytomètre.
- Si vous utilisez un compteur de cellules automatisé, définir les paramètres appropriés pour la taille des cellules et la circularité. Par exemple, définir une taille minimum de cellules de 2 pm, une taille de cellule maximale de 22 pm et une circularité de 75-80% rotondité pour détecter, hémocytes rondes normales 34. Expérience avec des paramètres différents pour détecter plus grands et en forme de fuseau hémocytes, comme lamellocytes. Vous pouvez également utiliser un hémocytomètre de compter manuellement hémocytes.
2. Circulant hémocytaire immunohistochimie
- Pour obtenir des larves d'à peu près le même stade de développement pour ce dosage, limiter la collecte des œufs en permettant les femelles à pondre des oeufs pendant une période de temps fixe 2 - 6 h.
- Placez une lamelle dans chaque puits d'une plaque à 6 ou 12 puits.
NOTE: lamelles carrées (22 mm) d'ajustement dans des plaques 6 puits et lamelles rondes (diamètre 18 mm) d'ajustement dans des plaques à 12 puits. - Recueillir les larves dans disséquant puits plat rempli de PBS 1x.
- Introduire 5 pl de PBS 1x dans le centre de chaque lamelle.
- Placer la plaque sur une base de stéréomicroscope illuminée.
- Sécher une larve individuelle sur un tissu essuyez puis placer dans le PBS sur la lamelle.
- En utilisant une paire de pinces, déchirer délicatement et retourner avec précaution la cuticule. Avant de retirer la carcasse larvaire, l'utiliser pour répandre l'hémolymphe uniformément.
REMARQUE: Prenez soin de ne pas gratter ou jab la cuticule , car cela pourrait libérer hémocytes sessiles 29. - REPEAt pour toutes les larves, la collecte de l'hémolymphe d'une larve par lamelle. Permettre hémocytes d'adhérer aux lamelles pour 5 -. 8 min à température ambiante à la température ambiante Ne pas dépasser 30 min avant la fixation.
- Fixer hémocytes en ajoutant 5 ul de 7,5% de formaldéhyde (tableau 1) pour chaque lamelle couvre -objet pendant 15 min à température ambiante.
- Lavez lamelles de trois fois avec PBS 1x. Astuce de la plaque et aspirer PBS après chaque lavage. Pour éviter le ruissellement de la solution de perméabilisation à l'étape suivante, utilisez l'aspirateur pour éliminer l'excès de PBS du périmètre des lamelles.
- Ajouter 100 pi de solution de perméabilisation (tableau 1) pour chaque lamelle couvre -objet pendant 20 min à température ambiante.
- Astuce et tapotez doucement la plaque pour aspirer la solution de perméabilisation.
- Diluer l' anticorps primaire avec une solution d'anticorps (tableau 1) selon les spécifications du fournisseur. Ajouter au moins 500 pi de solution d'anticorps primaire à lamelles couvre-objet dans des plaques à 12 puits.Ajouter au moins 1,5 ml dans des plaques de 6 puits. Incuber à 4 ° C jusqu'au lendemain.
- Retirer la solution d'anticorps primaire et laver avec des lamelles 1x PBS pendant 10 min sur un agitateur orbital, trois fois.
- Diluer l'anticorps secondaire avec une solution d'anticorps selon les spécifications du fournisseur. Ajouter au moins 500 ul de solution d'anticorps secondaire à lamelles couvre-objet dans des plaques à 12 puits. Ajouter au moins 1,5 ml pour les plaques à 6 puits. Laisser incuber pendant au moins 2 heures à température ambiante.
- Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver avec des lamelles 1x PBS pendant 10 min sur un agitateur orbital comme à l'étape 2.10, trois fois.
- Pendant les étapes de lavage, propre microscope en verre glisse avec 70% d' éthanol (tableau 1) en utilisant des lingettes de tissu. Pour chaque lamelle, placez 5 pl de montage tampon (tableau 1) sur la lame de verre.
NOTE: Deux lamelles tiennent sur une diapositive. - Aspirer le lavage final PBS.
- Utilisez une pince pour retirer délicatement les lamelles des plaques et lieu, inverted, au-dessus du tampon de montage.
Note: Les lames de microscope peuvent être conservés à 4 ° C avant l'imagerie. la durée de stockage maximale dépend de la stabilité des anticorps utilisés. 6 et 12 puits de plaques peuvent être rincés et réutilisés.
3. In Vivo Cristal cellulaire mélanisation
- Pour obtenir des larves d'à peu près le même stade de développement pour ce dosage, limiter la collecte des œufs en permettant les femelles à pondre des oeufs pendant une période de temps fixe de 2-6 heures.
- Avant de commencer, définir une source de chauffage à 60 ° C.
REMARQUE: Un programme de cyclage thermique de 60 ° C pendant 10 min (suivie par un groupe C cale 25 °) qui fonctionne le mieux, mais un bain d'eau ou une autre source de chauffage est suffisante tant que la chaleur est répartie uniformément et de façon uniforme sur chaque larve. - Recueillir les larves dans disséquant puits plat rempli de PBS 1x (tableau 1).
- Un à la fois, sécher une larve sur un tissu essuyez et place au fond d'un tube PCR. Placez chaque larvedans un tube PCR séparé. (Voir la figure 3A).
- Pour obtenir des résultats cohérents, faire en sorte que les larves séjour au fond des tubes de PCR en refroidissant les larves dans les tubes à 4 ° C pendant 10 à 15 min et / ou tapotant doucement les tubes avant le chauffage.
- Placer les tubes PCR dans le cycleur thermique (ou bain d'eau). On chauffe à 60 ° C pendant 10 min.
- Retirez délicatement les larves des tubes PCR en disséquant puits plat rempli de 1x PBS frais.
- Les larves à sec sur un tissu essuyez et disposer sur une surface plane pour l'imagerie sous un stéréomicroscope.
- Note images de larves aveuglément par plusieurs individus.
4. larvaire lymphe Gland immunohistochimie
NOTE: Le ganglion lymphatique est situé à environ un tiers de la longueur de l'extrémité antérieure d'une larve légèrement au-dessous du cerveau sur la face dorsale. (Voir flèche sur la figure 3B). La glande lymphatique flanque le vaisseau dorsal et est plus facilement disséquée attaché à la bouche hooalk ou au cerveau. De type sauvage, au troisième stade larvaire ganglions lymphatiques sont très petites structures; les lobes primaires sont d'environ 100 - 200 mm de longueur. (Voir la figure 4A).
- Pour obtenir des larves d'à peu près le même stade de développement pour ce dosage, limiter la collecte des œufs en permettant les femelles à pondre des oeufs pendant une période de temps fixe 2 - 6 h.
- glande ganglionnaire
- Pour chaque condition expérimentale, ajouter 1 ml 1x PBS (Tableau 1) à un puits d'une plaque de 24 puits.
- Ajouter 1 goutte de 0,1% PBST (tableau 1) dans chaque puits en utilisant une pipette de transfert jetable.
REMARQUE: Le détergent tel que le Tween 20, est ajouté pour abaisser la tension superficielle, ce qui permet au tissu de couler au fond du puits. - Placer la plaque à plat sur la glace.
- Recueillir les larves dans disséquant puits plat rempli de PBS 1x.
- Placez un coussin de dissection propre sur une base de stéréomicroscope illuminée. Utilisez un pipette de transfert jetable pour placer small chute de 0,01% PBST (tableau 1) sur le pavé. Transférer une larve à une chute de PBST pour la dissection.
- Tenir la larve avec une paire de pinces d'environ la longueur d'un quart de l'extrémité postérieure, dorsale vers le haut.
- Utilisez une autre paire de pinces pour saisir la cuticule immédiatement antérieure à la pince qui maintiennent la larve. Tirez doucement la cuticule vers l'extrémité antérieure jusqu'à ce que les crochets buccaux sont exposés.
NOTE: Le but est de peler la cuticule sans perturber les structures internes. - Relâchez la cuticule et utiliser les deux pinces pour couper la larve en deux. Retirer l'extrémité postérieure de la chute de PBST.
NOTE: Si la cuticule ne pèle pas tout le chemin à la bouche des crochets, couper la larve en deux et retirer l'extrémité postérieure. Utilisez une paire de pinces pour tenir le bord de la cuticule, et utiliser l'autre paire de pinces pour pousser les crochets buccaux à travers l'ouverture. Cela inversera la cuticule et exposer les crochets buccaux. Ceci peut être utilisé comme alternmangé méthode de dissection aussi bien. - Utilisez une paire de pinces à cerner la cuticule (soit la cuticule ventrale, le lambeau dorsal cuticule, ou les deux) pour la stabilité.
- Utilisez une autre paire de pinces pour saisir les crochets de la bouche exposés et tirez doucement les.
NOTE: Ce sera séparer la cuticule des structures internes. Idéalement, l'oeil / disques imaginaux antennaires, le cerveau, la glande de l'anneau, et des glandes lymphatiques flanquant le vaisseau dorsal restera attaché à la bouche des crochets. - Tout en maintenant la bouche des crochets, retirez soigneusement les structures indésirables tels que les glandes salivaires, la graisse corporelle, et de l'intestin.
NOTE: Si le cerveau sépare de la bouche des crochets, la glande lymphatique pourrait encore être attaché à et recueilli avec le cerveau. Dans ce cas, maintenez le nerf cordon ventral à la place de la bouche des crochets. - En utilisant les crochets de la bouche ou ventrale cordon nerveux comme une poignée, transférer le complexe disséqués contenant la glande lymphatique pour le bien sur la glace. Ne pas dépasser 30 minavant la fixation.
- Fixation et immunohistochimie
- Placer la plaque de 24 puits sur la base de stéréomicroscope.
- Utiliser une pipette P200 Retirez délicatement la PBST du puits.
NOTE: Vide, puits voisins sont utiles pour déposer temporairement les déchets. - Ajouter doucement 200 ul de 3,7% de formaldéhyde ( voir le tableau 1) sur le côté du puits et agiter la plaque pour faire en sorte que les tissus disséqués sont complètement immergés.
- Remettre la plaque à la glace pendant 30 min. Si les ganglions lymphatiques expriment la protéine (s) fluorescent, garder la plaque recouverte pour éviter photoblanchiment.
- Utiliser une pipette P200 pour enlever soigneusement le fixateur.
- Lavage en ajoutant 200 ul de 1 x PBS au puits et placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 5 minutes à température ambiante. Utiliser une pipette P200 Retirez délicatement la PBS.
NOTE: Correction des ganglions lymphatiques peuvent être laissés sur la glace dans du PBS jusqu'à ce que les ganglions lymphatiques pour toutes les conditions expérimentales sont Dissected et fixes. - Répéter le lavage étapes deux fois plus.
- Ajouter 200 pi de solution de perméabilisation (tableau 1) dans le puits. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 45 min à température ambiante.
NOTE: 45 min est la «norme d'or» pour la glande lymphatique perméabilisation mais les auteurs ont le succès après seulement 20 min. - On élimine la solution avec une pipette P200.
- Diluer l' anticorps primaire avec une solution d'anticorps (tableau 1) selon les spécifications du fournisseur. Ajouter 300 ul solution d'anticorps primaire au puits et veiller à ce que les tissus disséqués sont complètement submergés. Incuber à 4 ° C jusqu'au lendemain.
- Utiliser une pipette P200 pour éliminer l'anticorps primaire.
- Lavage en ajoutant 200 ul de 1 x PBS au puits et placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 minutes à température ambiante. Utiliser une pipette P200 Retirez délicatement la PBS.
- Répéter le lavage étapes deux fois plus.
- Diluer secondairentibody avec une solution d'anticorps selon les spécifications du fournisseur. Ajouter une solution d'anticorps secondaire 300 pi au puits et veiller à ce que les tissus disséqués sont complètement submergés. Incuber sur un agitateur orbital pendant au moins 2 heures à température ambiante.
- Utiliser une pipette P200 pour éliminer l'anticorps secondaire et laver comme décrit dans les étapes 4.3.12 et 4.3.13. Ne pas retirer le PBS après le lavage final.
- Lymphe montage presse-étoupe
- Propre microscope en verre glisse à l' aide d' éthanol à 70% (tableau 1) et les mouchoirs en papier.
- Pour chaque condition expérimentale, placer une goutte de tampon de fixation (tableau 1) sur la lame de verre.
NOTE: Deux conditions correspondent à une diapositive. Montage volume tampon dépend du nombre de ganglions lymphatiques à monter. Utiliser 2 ul pendant environ 18 - 20 ganglions lymphatiques, 1 pi pendant 10 à 12 et 0,5 ul pendant 5 ou moins. - Placez la lame de microscope sur une base de stéréomicroscope illuminée.
- Pour un maximum de deux conditions à la fois, transférer tous les ganglions lymphatiques du puits à la mémoire tampon de montage avec une pince, en utilisant les crochets de la bouche ou ventrale cordon nerveux comme une poignée.
- Espacez les de tissus disséqués uniformément dans une forme circulaire ou rectangulaire, d'étalement du tampon de montage dans le processus.
- Pour chacun des tissus disséqués, individuellement, faites glisser une tong de la pince sous le vaisseau dorsal et tirez doucement vers la périphérie du tampon de montage.
NOTE: Cela attirera la lymphe glande du reste des tissus disséqués et aplatir la glande lymphatique sur le verre. - L'utilisation d'un tong de la pince et un mouvement de scie, couper le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau.
- Déplacer le reste des tissus disséqués sur le côté opposé de la glande lymphatique, au niveau du bord le plus extérieur du tampon.
REMARQUE: Les tissus disséqués indésirables finissent par former un périmètre autour des glandes lymphatiques et de servir de support lors which, la lamelle couvre-objet se reposer. - Répétez jusqu'à ce que tous les ganglions lymphatiques sont séparés des tissus disséqués, en réservant l'un des tissus disséqués indésirables à placer dans le centre.
- Prenez une lamelle entre deux doigts. Vérifiez que la lamelle est exempt de poussière et les empreintes digitales. Si nécessaire, utilisez un tissu essuyez et 70% d'éthanol pour nettoyer la lamelle.
- Faire en sorte que le bord de la lamelle couvre-objet est parallèle au bord de la lame de verre, abaisser soigneusement la lamelle sur le tampon de montage.
REMARQUE: Les lames de microscope peuvent être conservés à 4 ° C avant l'imagerie. la durée de stockage maximale dépend de la stabilité des anticorps utilisés. des plaques 24 puits peuvent être rincés et réutilisés.
5. Imaging
- Image fixe hémocytes et monté des ganglions lymphatiques sur une fluorescence norme appropriée ou microscope confocal à 20X ou plus grossissement selon le mode d'emploi du fabricant. toute image larves sur un supportstéréomicroscope ard à 2X grossissement selon le mode d'emploi du fabricant.
- Suivez les instructions du fournisseur de logiciels pour déconvolution, si on le souhaite.
| Solution | Composition | Stockage | commentaires |
| PBS 1x | 200 mg / L de chlorure de potassium | température ambiante | |
| 200 mg / l de phosphate de potassium monobasique | |||
| 8000 mg / l de chlorure de sodium | |||
| 1,150 mg / l de phosphate de sodium dibasique | |||
| dH2Û | |||
| Fixateur | 3,7% ou 7,5% de formaldehyde dans du PBS 1X | température ambiante dans l'obscurité | Formaldéhyde est toxique. |
| Solution de perméabilisation / diluant d'anticorps | 0,4% de Triton | 4 ° C | La formule standard utilise 0,4% de Triton, mais les auteurs utilisent 0,1% de Tween 20 avec succès. Utiliser pour diluer les anticorps primaires et secondaires selon les concentrations recommandées par les fournisseurs. |
| 5% d'albumine de sérum bovin, le sérum de chèvre normal, sérum ou d'âne normale | |||
| PBS 1x | |||
| 70% d'éthanol | 70% d'éthanol de 200 preuve dans dH2O | température ambiante | |
| tampon de montage | 0,5% de N-gallate de propyle | 4 ° C dans l'obscurité | N-gallate de propyle est nuisible. DAPI est un mutagène. |
| 80% de glycérol | |||
| Facultatif: 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) | |||
| PBS 1x | |||
| 0,1% PBST | 0,1% de Tween 20 dans du PBS 1X | température ambiante | |
| 0,01% PBST | Dilution 1:10 de 0,1% PBST | température ambiante |
Tableau 1. Les solutions utilisées dans le présent Protocole.
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Representative Results
Circulant hémocytaire Concentration
Numéros de hémocytaires augmentent tout au long du développement larvaire 35. Pour illustrer cette méthode permet de détecter des différences dans le nombre d'hémocytes et d'une concentration, quelle que soit la cause biologique, on a mesuré les concentrations de hémocytes des larves retardée et non retardée. Perte de l' hormone prothoracicotropique (de PTTH) par ablation génétique des neurones PTTH producteurs (PTTH> sombre) produit un retard dans le développement larvaire 36. Pour chaque génotype, les concentrations hémocytaires ont été mesurées comme décrit dans le protocole n ° 1 pendant au moins 8 larve individuelle relevée à 25 ° C. A 120 heures après une collection d'oeufs de 2 heures, la concentration moyenne de hémocytes par larve retardée (PTTH> sombre) est inférieure à la concentration moyenne de hémocytes par larve de contrôle (PTTH). Seulement après 9 jours fait la concentration en hémocytes moyenne par approche retardée larvaire celle des témoins (
Les images prises à partir d' un compteur de cellules automatisé montrent un environnement propre, l' échantillon de l' hémolymphe souhaitable et un échantillon contenant des débris, ce qui pourrait conduire à des mesures inexactes (figure 1C). la taille des cellules minimales et maximales ont été fixées à 2 pm et 22 pm, respectivement. Circularité a été fixé à 75-80% rotondité. Ces paramètres sont donnés à titre indicatif et doivent être empiriquement optimisés.
Circulant hémocytaire immunohistochimie
Hémocytes circulants exprimant la protéine verte fluorescente (GFP) ont été recueillies, fixées, et incubées avec un mélange d'anticorps spécifiques plasmatocyte (P1a et P1b, István Andó) 31 comme décrit dans le protocole n ° 2(Figure 2). L'image a été prise sur un microscope à fluorescence standard et est montrée inchangée et après déconvolution itérative contraint. Dans ce cas, déconvolution n'a pas considérablement améliorer la qualité de l'image.
In Vivo Cristal cellulaire mélanisation
Les larves ont été placées au fond des tubes de PCR avant la cellule de cristal mélanisation induite par la chaleur comme décrit dans le protocole n ° 3 (figure 3A). Les flèches rouges indiquent des tubes dans lesquels les larves sont trop loin du fond et peut être chauffée de manière inégale. La répartition inégale de la chaleur à travers la larve individuelle peut augmenter la variabilité de la mélanisation de cellules à cristaux au sein de la larve.
Une larve de type sauvage imagé sur un stéréomicroscope standard affiche le modèle typique de cellules à cristaux mélanisées en grappes sessiles après exposition à la chaleur (La figure 3B). cellules à cristaux mélanisée dans la glande lymphatique sont parfois visibles.
Larvaire lymphe Gland immunohistochimie
Troisième stade ganglions lymphatiques larves ont été disséquées, fixées et montées comme décrit dans le protocole n ° 4. Une image de contraste interférentiel différentiel (DIC) prise sur un microscope à fluorescence standard affiche les lobes des ganglions lymphatiques primaire et secondaire qui flanquent le vaisseau dorsal (figure 4A).
Un ganglion lymphatique dans laquelle la zone médullaire et le centre de signalisation postérieur ont été génétiquement marquées avec le renforcement de la protéine bleue fluorescente (EBFP2) et GFP, respectivement, a été colorée avec un anticorps dirigé contre le domaine intracellulaire de Notch (C17.9C6, études développementales Hybridome Bank) comme décrit dans le protocole 4. images Z-stack ont été prises sur un microscope à fluorescence standard. Un int maximum unique de projection d'image apparaît inchangé ensité et après contrainte déconvolution itérative (figure 4B). Dans ce cas, déconvolution considérablement amélioré la qualité et le détail de l'image.
Figure 1. Circulating hémocytaire Concentration. A) Une partie de milieu Drosophila standard a été enlevé ( à droite) pour promouvoir la ponte au cours d' une période de collecte des œufs 2 h. B) La concentration moyenne de hémocytes par larve retard de développement (de PTTH> sombre) a été inférieur à celui la concentration en hémocytes moyenne par les larves de commande (PTTH) 120 heures après la ponte (AEL). La concentration moyenne de hémocytes par larve retard approché niveau de contrôle 9 jours AEL. Les barres d'erreur représentent ± ETM C) des échantillons de hémolymphe sans (gauche) et avec ( à droite) des débris. Les barres d'échelle représentent 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Circulating hémocytaire immunohistochimie. Hémocytes exprimant la GFP génétiquement ont été prélevés et fixés à une lamelle. Un anticorps spécifique plasmatocyte a été utilisé pour colorer plasmatocytes (rouge). Coloration DAPI est en bleu. l'image Unaltered prise avec un microscope à fluorescence (à gauche). La même image après déconvolution (à droite). Les barres d'échelle représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3. In Vivo A) Les larves ont été placés individuellement dans des tubes de PCR avant le chauffage. Les flèches rouges indiquent les larves qui ne sont pas au fond des tubes B) un motif de la mélanisation de la cellule à cristaux typique après le chauffage, ce qui révèle parfois les ganglions lymphatiques (flèche;. Côté dorsal représenté, antérieur est à gauche). La barre d'échelle représente 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Une image DIC d'un troisième stade larvaire ganglion lymphatique montrant le vaisseau dorsal (dv), des lobes primaires (1 °), et les lobes secondaires (2 °) larvaire lymphe Gland immunohistochimie. A). La barre d'échelle représente 100 um. B) Un représentant troisième stade larvaire lymphe glande from une larve exprimant génétiquement EBFP2 dans la zone médullaire et la GFP dans le centre de signalisation postérieure. Le ganglion lymphatique a été colorée avec un anticorps dirigé contre le domaine intracellulaire de Notch (rouge). l'image Unaltered prise avec un microscope à fluorescence (en haut). La même image après déconvolution (en bas). Les barres d'échelle représentent 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Lors de la modification génétique ou environnementale, les quatre méthodes décrites ici peuvent être utilisés individuellement ou conjointement pour analyser les processus distincts au cours de l' hématopoïèse tels que la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation Drosophila hématopoïèse est un processus dynamique. le nombre d'hémocytes par animal et augmente 35 l'expression de la structure et le gène de la glande lymphatique change 32 pendant le développement. Avant d'effectuer ces essais, par conséquent, il est essentiel de limiter la collecte des œufs en permettant femelles de pondre des œufs pour un montant fixe de temps et pour confirmer le stade de développement larvaire souhaitée. Pour les collections plus courtes d'œufs (moins de 6 h) ou pour les cas où les femmes sont insalubres ou rares, la ponte peut être encouragée par la création de crevasses dans la nourriture. Ceci peut être accompli en retirant une partie de la nourriture avec une spatule d'éthanol nettoyé. Si l'excès de liquide accumule dans la nourriture, l'utilisation de tissus lingettes pour absorber leliquide. (Voir la figure 1A).
Seul, les méthodes décrites ici ont des limites. Par exemple, la mesure de circulation concentration hémocytaire capture les changements dans la survie des hémocytes ou la prolifération, mais ne fournit aucune information sur la distribution de la lignée hémocytaire ou toute perturbation de la lignée qui pourrait être consécutive à une altération génétique ou environnementale. A l'inverse, l'immunohistochimie des hémocytes circulants révèle des changements dans les lignées hémocytaires spécifiques dans l'hémolymphe, mais seulement en nombres relatifs, et non absolue,. Mélanisation cellulaire cristal in vivo est difficile de quantifier la distribution de cellules à cristaux est variable et hémocytes sessiles sont dynamiques 8,10. Au contraire, plusieurs individus devraient marquer cellule à cristaux mélanisation aveuglément. Enfin, les observations faites dans un compartiment hémocytaire pourrait ne pas nécessairement vrai dans d'autres compartiments.
Lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces dosages peuvent être utilisés pour distinguer le gènealtérations tic qui régulent la prolifération ou la survie de ceux qui régulent l'expression des gènes ou de différenciation. Par exemple, une modification génétique peut augmenter la prolifération des hémocytes de telle sorte que la concentration en hémocytes augmente, mais les proportions relatives des lignées hémocytes reste le même. Alternativement, une altération génétique peut favoriser des changements dans la différenciation des hémocytes dans des lignées spécifiques sans effet sur la concentration globale de hémocytes. La population de cellules à cristaux peut être interrogé rapidement et facilement en utilisant le procédé in vivo de la mélanisation en facilitant cribles génétiques et des études sur les interactions génétiques. Cette méthode peut être utilisée pour corroborer les études génétiques qui utilisent prophénoloxydase 1 (PPO1, également appelées cellules noires, Bc) allèles mutants ou des dosages immunohistochimiques qui utilisent des anticorps spécifiques des cellules cristallines. La glande lymphatique larvaire peut être utilisée pour répondre à des questions similaires concernant les processus cellulaires hématopoïétiques. Nombreuxles voies de signalisation sont impliqués dans l'établissement et le maintien de la glande lymphatique et ses grandes zones. Chaque zone a l'expression des gènes distincts et la fonction dans l'hématopoïèse larvaire. De plus, en utilisant la glande lymphatique peut révéler des fonctions autonomes et non autonomes dans les zones des ganglions lymphatiques ou hémocytes des glandes lymphatiques.
Méthodes pertinentes pour l' étude de la drosophile hématopoïèse ont été compilées dans les ressources à base de texte complet que récemment 26,27. Bien indispensable sur le terrain, ces ressources sont limitées dans leur portée. Des méthodes pour mesurer la concentration d'hémocytes, par exemple, ne sont pas inclus. méthodes écrites, en particulier les techniques de dissection décrivant, peuvent être difficiles à maîtriser rapidement. Des contributions supplémentaires ont été apportées, en fournissant des ressources visuelles pour aider avec des méthodes, mais étaient encore limités en nombre et portée 28,29. Les méthodes décrites ici, tout en pas exhaustive, ajouter aux ressources available pour aider à l'étude de l' hématopoïèse chez la drosophile.
Nous proposons des modifications et des alternatives aux protocoles existants. Par exemple, il y a plusieurs avantages à mesurer la concentration en hémocytes avec un compteur automatique de cellules plutôt que d'un hémocytomètre manuel, y compris augmentation de la vitesse, la facilité et l'objectivité. Dans notre expérience, en utilisant un bain d'eau pour chauffer les larves pour la visualisation de la cellule de cristal a donné lieu à des résultats très variables, surtout si les larves sont chauffés dans les flacons dans lesquels ils sont élevés. Les larves de chauffage dans des tubes de PCR individuels a donné des résultats moins variables et plus reproductibles. La méthode de dissection des ganglions lymphatiques décrit ici, bien que précédemment décrit dans un protocole écrit 26, offre une alternative aux références visuelles existantes 28. Enfin, si l'accès à un microscope confocal est limitée, nous suggérons que déconvolution des images de fluorescence standards pourrait être un substitut approprié pour les images confocale. Deconvolutisur des algorithmes supprimer ou réattribuer out-of-focus lumière capturée par microscopie à fluorescence conventionnelle, l'amélioration de la résolution et le contraste semblable en principe à l'élimination de la lumière hors-focus par microscopie confocale, et peut être appliqué à 2 dimensions et 3- dimensions (Z-stack) images. Pour certaines applications, comme démontré ici, déconvolution peut considérablement améliorer les images prises avec des microscopes à fluorescence conventionnels.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts ou financiers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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