Summary
Описан стандартный протокол с использованием меченых антител для применения в микроскопии для определения экспрессии мембранного и локализации ганглиозидов в состоянии покоя , а также активированные человека наивных CD4 + Т - клеток. Также описаны в режиме реального времени эксперименты с использованием ПЦР <40000 клеток, которые не требуют дополнительных комплектов низкого входного РНК.
Abstract
Описанные здесь способы для активации наивных CD4 + Т - клеток в суспензии и их соблюдение в покровные для конфокальной микроскопический анализ позволяют пространственную локализацию и визуализацию ганглиозидов , участвующих в активации CD4 + Т - клеток, что экспрессия комплемента профилирование эксперименты , такие как проточная цитометрия, вестерн блоттинга или ПЦР в реальном времени. Количественное выражение ганглиозидов через проточной цитометрии и их клеточной локализации с помощью микроскопии может быть получена при использовании анти-ганглиозидов антител с высоким сродством и специфичностью. Тем не менее, адекватная обработка клеток в суспензии включает обработку культуры пластин для содействия необходимой для соблюдения требуемой флуоресценции или конфокальной микроскопии приобретения. В этой работе мы опишем протокол для определения экспрессии ганглиозидов GD3 и GD2 и колокализацию с TCR во время активации наивных CD4 + Т - клеток. Кроме того, в режиме реального тЭксперименты IME ПЦР с использованием <40000 клеток описаны для определения GD3 и генов-синтазы GM2 / GD2, демонстрируя, что эксперименты генного анализа могут быть выполнены с низким числом клеток и без необходимости дополнительных комплектов низкого входного РНК.
Introduction
CD4 + Т - клетки оркестровать иммунный ответ через свои эффекторные функции после активации антигенпрезентирующих клеток 1. Изучение клеточных механизмов, которые модулируются при активации позволяет понимание основного процесса иммунной функции. Тем не менее, исследование наивных CD4 + Т - клеток может быть сложным , так как они представляют собой очень небольшую популяцию клеток в крови периферии 2.
С помощью флуоресцентной микроскопии несколько сообщений изучали локализацию различных молекул , участвующих в активации CD4 + Т - клеток, в основном белки , связанные с плазматической мембраной 3. Ганглиозиды являются сиаловой кислоты , содержащие гликосфинголипиды и , хотя они были широко изучены в нервных клетках , где они в изобилии, другие клетки , такие как клетки иммунной системы также выражают ганглиозиды биологически соответствующими функциями 4,5. Ранее мы сообщали ТНАт при активации человека наивных CD4 + Т - клеток существует повышающая регуляция в α2,8 сиалилтрансфераза ST8Sia 1 (GD3 - синтазы) и синтазы GM2 / GD2, которые вызывают значительную поверхность neoexpression из GD2 и повышающая регуляция GD3 ганглиозида 6. Дальнейшее изучение GD3, GD2 и других ганглиозидов в иммунных клетках необходимо дополнить на основе протеина частичный вид функции иммунной системы.
Как правило, изучение экспрессии ганглиозидной основывается на таких методов, как тонкослойная хроматография (ТСХ) 7, но этот метод не позволяет пространственной локализации ганглиозидов на плазматической мембране или в субклеточных отсеков, ограничивая биологический анализ.
В этой работе мы опишем протокол для идентификации антител-опосредованной и локализации GD3 и GD2 ганглиозидов в человеческих наивных CD4 + Т - клеток и МКПК после анти-CD3 / активации анти-CD28. С помощью этого протокола это яТакже возможно анализировать ген и молекулярную экспрессию ганглиозидов в низком количестве клеток в суспензии, с приобретением высококачественных изображений 6, принимая во внимание небольшой размер лимфоцитов (9 мкм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Периферической крови у здоровых доноров-мужчин была получена с информированного согласия и одобрения комитета по биоэтике Centro де Investigación эн DINAMICA Celular- Автономного университета дель Estado-де-Морелос.
1. Выделение и активация человеческих Наивные CD4 + Т - клеток
- Собирают 2 мл периферической крови, полученной от здоровых доноров путем информированного согласия и разбавляют 2 мл стерильной PBS-ЭДТА (1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 2 мМ ЭДТА, рН 7,4). Добавляют разбавленную кровь медленно поверх 3 мл раствора сахарозы с плотностью 1,077 , как было описано ранее 8.
Примечание: Дифференциальный миграция во время центрифугирования, вызванное различиями в плотности вызывает Эритроциты осаждаться полностью и слой менее плотных мононуклеаров сформирует выше. 2 мл периферической крови будет оказывать примерно 0,5 × 10 6 наивных CD4 + Т - клеток после purificatiпо шагам. - Центрифуга 30 мин при 250 х г при 21 ° С (использовать ротор для круглых труб дно с фиксированным углом 30 мм), без перерыва, чтобы сформировать градиент мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). После центрифугирования РВМС можно ясно наблюдать в виде белого кольца. Собирают МНПК с помощью пипетки и переносят в стерильную пробирку для промывки.
- После трех промывок раствором PBS-ЭДТА при 250 мкг в течение 10 мин приступить к очистке наивных CD4 + Т - клеток. Сортировка методов или несколько видов комплектов очистки доступны для этой цели. Предпочтительно использовать> 1 х 10 7 МНПК для очистки.
- Очищают наивных CD4 + Т - клетки путем негативной селекции с использованием магнитных шариков. Выполните негативный отбор с анти CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, анти-TCRγ / б, анти-HLA-DR и CD235a (гликофорина А) антител. Оценить процент чистоты путем определения CD4 + CD45RA + клеток через Fнизкая цитометрии.
Примечание: По желанию, перейти к инкубации РВМС в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% CO 2 с плотностью 1 × 10 6 клеток / мл в 10 мл дополненной среде для содействия присоединению моноцитов и продолжить очистку наивных CD4 + Т - клеток. Эффективное восстановление наивные CD4 + Т - клеток из периферической крови в значительной степени зависит от системы очистки.
- Очищают наивных CD4 + Т - клетки путем негативной селекции с использованием магнитных шариков. Выполните негативный отбор с анти CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, анти-TCRγ / б, анти-HLA-DR и CD235a (гликофорина А) антител. Оценить процент чистоты путем определения CD4 + CD45RA + клеток через Fнизкая цитометрии.
- Подготовка 24-луночные планшеты для культивирования клеток добавлением 250 мкл на лунку PBS с добавлением 5 мкг / мл анти-CD3 моноклональными антителами и инкубировать в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
Примечание: можно использовать планшеты с 96 лунками , когда меньшее число из наивных CD4 + Т - клеток используются (например, 2 x10 4 -1 × 10 5). - Удалить анти CD3 антитела разбавления из 24 скважины или 96-луночные планшеты и мыть тарелки в два раза с использованием стерильного 1x PBS.
- Развести наивных CD4 + Т - клеток с> 95% чистоты (CD4 +CD45RA +) до плотности 1 × 10 6 клеток / мл в продвинутой среде RPMI 1640 среде с 3% фетальной бычьей сыворотки (или среду RPMI с добавлением 10% сыворотки), 2 мМ глутамина и антибиотиками (1 ед / мл пенициллина, 1 мкг / мл стрептомицина).
Примечание: Если локализация ганглиозидов требуется в МНПК, по тому же протоколу для разбавления и стимуляции, как описано ниже. - Добавьте 500 мкл клеточного разведения в анти-CD3 лунках, покрытых и непокрытых скважин (контрольные клетки) в 24-луночного планшета. В качестве альтернативы, добавить 100 мкл клеточного разведения в лунки 96-луночного планшета.
- Выполните условия стимуляции наивных CD4 + Т - клеток в анти - CD3 лунках , покрытых добавлением 1 мкг / мл анти CD28 антитела.
- Держите отдыхавших CD4 + Т - клеток в качестве контроля в непокрытые лунки без добавления анти - CD28 антител. Выдержите в состоянии покоя и активированный CD4 + Т - клеток при 0 до 72 ч при стандартных условиях 37 ° СС и 5% СО 2.
- Для проверки адекватной активации оценить с помощью проточной цитометрии экспрессии CD69 ранней активации маркера (16 ч после активации) или CD25 , поздно маркер активации (48 часа после активации) в состоянии покоя и активированные наивные CD4 + Т - клетки инкубировали при 37 ° C и 5% СО 2 в отсутствие или в присутствии анти CD3 / CD28 - антителами 9,10.
2. Приверженность отдыхавших и активированные Наивные CD4 + Т - клеток
- Стерилизовать 12 мм круглые покровные автоклавированием и воздействия ультрафиолетового света в течение по крайней мере 15 мин.
- Место покровные в стерильной 24-луночный культуральный пластин.
Примечание: Для культур с менее 1 × 10 5 клеток предпочтительно использовать Боковую камеры с адаптированными небольших скважин для предотвращения рассеивания клеток в покровное. - Coat покровные (или слайд-камера) с 200 мкл поли-L-лизина (молекулярная масса 150-300 кД) 0,1% (вес / объем) раствора и инкубировать в течение 5 мин при гтемпература ООМ (RT), удалите и сухой в течение по крайней мере 1 час при комнатной температуре.
- Тщательно перемешать и собирать отдыхавших и активированные наивные CD4 + Т - клеток из 24-луночные планшеты. Граф клеток и при необходимости регулировать свежей дополненной среде для передачи 1 х 10 5 клеток к поли-L-лизином покровные с покрытием. Инкубируйте клетки в течение как минимум 6 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
3. Сбор и фиксация покоящихся и Активированный Наивные CD4 + Т - клеток
- Осторожно удалите среду из культивированного отдыха и активированных наивных CD4 + Т - клеток.
- Добавить 500 мкл RT стерильного PBS медленно.
Примечание: Осторожное добавление и удаление растворов из скважин препятствует отделению клеток от покровного. - Откажитесь от PBS и добавить еще 500 мкл PBS, чтобы полностью удалить культуральной среды.
- Закрепить клетки путем добавления 500 мкл фильтруется 4% параформальдегида (ФИЛТРРацион удаляет микрочастицы, которые могут препятствовать микроскопический анализ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре (предпочтительно) или в течение ночи при 4 ° С.
Внимание: параформальдегид является токсичным и летучим соединением. Известно, что человеческий канцероген. Соблюдайте осторожность при обращении с соответствующим протоколом безопасности. - Удалите закрепитель и мыть по крайней мере, дважды PBS при комнатной температуре.
- Переход к следующему шагу или поддерживать лунок планшета с 500 мкл PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, пока окрашивания.
Примечание: Стерильность во время этого процесса помогает избежать роста микроорганизмов.
4. Окрашивание, Монтаж и визуализация с помощью конфокальной микроскопии
- Удалите PBS из лунок. Добавьте 500 мкл буфера для холодной блокировки (1X PBS, 0,5% стандартный сорт бычьего сывороточного альбумина, 1% фетальной бычьей сыворотки, рН 7,4). Инкубировать в течение 20 мин на льду.
- Осторожно удалите блокирующий буфер и добавить первичные антитела (анти ганглиозидов GD3 клон R24, GD2 клон 14G2a),РЕ-конъюгированными анти CD25 и АРС-конъюгированные анти ТКС и изотипы управления разведенного в блокирующем буфере до 2,5 мкг / мл.
- Выдержите 2 ч на льду или в течение ночи при 4 ° C.
Примечание: Медленное орбитальное перемешивание является предпочтительным. - Удалите антитела осторожно и медленно добавьте 500 мкл PBS. Повторите дважды.
- Добавить вторичные антитела (FITC конъюгированными антителами против IgG3 для R24 анти GD3, Alexa Fluor 488-конъюгированные или Alexa Fluor 647-конъюгированные анти IgG2a для 14G2a анти GD2), разведенного в блокирующем буфере до 0,1 мкг / мл.
- Выдержите в течение 1 часа на льду в темноте без встряхивания.
- Вымойте три раза в PBS, как описано в 4.4). Хранить лунки с достаточным количеством PBS, чтобы избежать обезвоживания проб.
- Добавить Hoechst 333258 пятно разбавленный в PBS до 0,1 мкг / мл.
- Выдержите 15 мин при комнатной температуре и удалить. Промыть три раза в PBS.
- Поместите слайды на бумажное полотенце и добавить 20 мкл раствора монтажного (50% глицерина в PBS) или коммерческого монтажа раствораs, чтобы избежать выцветания и закалки от образцов.
- Осторожно поднимите покровное с мелкими пинцетом и поместить его на монтажный раствор. Убедитесь, что сторона покровное где прикрепляются клетки находится в контакте с раствором. Уплотнение покровные с лаком для ногтей и анализируют с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии.
5. Выделение РНК
- Готовят анти CD3 антитела (5 мкг / мл) с покрытием 96-луночные планшеты. Выдержите 4 х 10 4 наивных CD4 + Т - клеток / лунку в 100 мкл дополненной культуральной среды с анти CD28 антителом (1 мкг / мл) , чтобы завершить стимул. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 в течение от 0 до 72 ч.
- После того, как различные промежутки времени после активации поместить клетки в микроцентрифужных трубки.
- Добавьте 500 мкл PBS и центрифугировать при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавьте 1 мл реагента тризола.
- Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре и хранить пробу при -8076 ° С в течение по меньшей мере 24 ч. Продолжить с выделением РНК при необходимости.
Примечание: Выход из образца при -80 ° С в течение по меньшей мере 24 ч улучшает выход РНК. Кроме того, использование ручных перчаток имеет важное значение для предотвращения деградации РНК с помощью РНКазы. - Размораживание образца путем инкубации при температуре 37 ° С в течение 2 мин на водяной бане.
- Добавить 200 мкл хлороформа и энергично встряхивают вручную в течение 30 сек (чтобы избежать агрессивного смешения РНК путем встряхивания). Инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга 15 мин при 12000 х г при 4 ° С.
- Восстановление водной фазы в новую пробирку микроцентрифужных.
- Добавьте 500 мкл изопропанола и Переверните пробирку три раза.
- Инкубировать 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют в течение 10 мин при 12000 х г при температуре 4 ° С.
- Удалите супернатант путем инверсии.
- Добавляют 1 мл охлажденного льдом 75% этанола и центрифугировать 10 мин при 12000 х г при температуре 4 ° С.
- Полностью отбросить супернатант и высушить осадок РНК, оставив крышку трубки открытой.
Нее: На данный момент Таблетку не ясно виден. Все равно продолжайте. - Ресуспендируют осадок в 20 мкл воды класса молекулярного. Вычислить концентрации и чистоты нуклеиновых кислот путем измерения 260 нм и 280 нм, используя оптическую плотность NanoDrop.
- тщательно Переходим к синтезу кДНК с использованием любого обычного обратного набора транскриптазы и после постав-протокола.
Примечание: Приблизительно 0,5-2 мкг РНК получают из 4 - х 10 4 наивных CD4 + Т - клеток. кДНК может быть синтезирован из 100 нг РНК и использовали в ПЦР в реальном времени реакции без необходимости низкой РНК входных наборов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол , описанный в этой рукописи оказывает хорошее качество культивируют и приклеенный отдыхавших и активированные человека наивных CD4 + Т - клеток (рис 1). Активированные CD4 + Т - клетки обнаруживают характерную пролиферативный профиль (Фигура 1В) , по сравнению с состоянием покоя (рис 1А). CD25 поздно маркер активации полезен для оценки эффективной активации при 72 ч наблюдаемых с помощью конфокальной микроскопии (рис 1C). CD69 маркер в настоящее время используется в качестве раннего маркера активации с помощью проточной цитометрии или микроскопии. Приверженность отдыха и активированные наивные CD4 + Т - клетки к покровного стекла, покрытые поли-L-лизина являются полезными для изучения экспрессии и локализации GD3 и TCR показал двойной маркировки с анти GD3 и анти - антител TCR (рисунок 2). Как мы уже сообщали ранее, активация сопровождается реконструируютфлу- GD3 и GD2 ганглиозидов в клетках поверхности 6. Кроме того, экспрессия гена количественное определение объема синтазам GD3 и GM2 / GD2 выполняется с 4 - х 10 4 клеток (фиг.2 и 3). Нео-выражение ганглиозида GD2 и TCR колокализации адекватно наблюдали с помощью конфокальной микроскопии, демонстрируя возможную роль GD2 в TCR кластеризация во время активации (рисунок 3). Рисунок 4 показывает локализацию ганглиозида GD3 и GD2 окрашенном одновременно в активированных CD4 + Т - клетки. Кроме того, активированные РВМС окрашивали анти GD3 и анти GD2 антител , показывающие , что этот протокол может быть использован в других популяциях клеток иммунной системы, обнаруженных в PMBCs, в частности , GD2 , что было обнаружено , что выражается во всех активированных PMBCs (рисунок 5).
Рисунок 1: Визуализация наивных CD4 + Т - клеток после прилипания и эффективного анти активации CD3 / анти-CD28 (А) Отдыхая CD4 + Т - клеток на 72 ч после активации прикрепленная на поли-L-лизина лечение покровного наблюдаются светлого. микроскопия. (B) , активированных CD4 + Т - клетки на 72 ч , прикрепленной поли-L-лизин обрабатывали покровное. (C) выражение CD25 маркер (красный) и Hoechst 333258 окрашивали ядер (синий) анти CD3 / анти CD28 активированных CD4 + Т - клеток на 72 ч после активации. Шкала бар = 50 мкм. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии с объективом 60X S / 1.3 масла с 2 - кратным цифровым зумом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: GD3 ганглиозидов и TCR пятна и микроскопия локализации в покоящихся и активированных наивных CD4 + Т - клеток на 72 ч после активации Отдыхающий CD4 + Т - клеток с (А) ядер окрашивали Hoechst 333258, (B) GD3 локализации ганглиозидов, (. C) Слияние ядер и GD3 ганглиозида. Активированные CD4 + Т - клетки с (D) ядер окрашивали Hoechst 333258, локализация ганглиозидов (E) GD3 и (F) Слияние ядер и GD3 ганглиозида. (G) и (Н) показывают TCR и GD3 ганглиозидов в состоянии покоя наивных CD4 + Т - клеток. (J и К) соответствует TCR и GD3 ганглиозидов окрашивания в активированных CD4 + Т - клеток. Конфокальной образы TCR (красный) и GD3 ганглиозидной (зеленый) локализации в состоянии покоя наивных CD4 + Т - клетки (I) ианти CD3 / CD28 Активированный наивных CD4 + Т - клеток 72 ч после активации (L). GD3, TCR и ядер пятен оценивали с помощью конфокальной микроскопии из одного стека с 60X S / объектив 1.3 масла с 2-кратным цифровым зумом. (M) График показывает экспрессию гена для GD3 - синтазы определяется ПЦР в реальном времени выражается в виде складчатой изменения от 4 х 10 4 покоя (Rest) и активированных (акт) наивных CD4 + Т - клеток на 72 ч после активации. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение от трех независимых доноров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: GD2 ганглиозидов и TCR пятна и локализации микроскопии в состоянии покоя и активированные наивные CD4 + Т - клеток через 72 часа после активации. + Т - клеток с (А) ядер окрашивали Hoechst 333258, (B) GD2 локализация ганглиозидов, (C) Слияние ядер и GD2 ганглиозида. Активированные CD4 + Т - клетки с (D) ядер окрашивали Hoechst 333258, локализация ганглиозидов (E) GD2 и (F) Слияние ядер и GD2 ганглиозида. (G и H) показывают TCR и GD2 ганглиозидов в состоянии покоя наивных CD4 + Т - клеток. (J и К) соответствует TCR и GD2 ганглиозидов окрашивания в активированных CD4 + Т - клеток. Конфокальной образы TCR (красный) и GD2 ганглиозидной (зеленый) локализации в состоянии покоя наивных CD4 + Т - клетки (I) и анти CD3 / CD28 Активированный наивных CD4 + Т - клеток 72 ч после активации (L). GD2, TCR и ядер пятен оценивали с помощью конфокальной микроскопии из одного стека с60X цель масла S / 1,3 с 2-кратным цифровым зумом. (M) График показывает экспрессию гена для GM2 / GD2 - синтазы определяется ПЦР в реальном времени выражается в виде складчатой изменения от 4 х 10 4 покоя (Rest) и активированных (акт) наивных CD4 + Т - клеток на 72 ч после активации. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение от трех независимых доноров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Двойной пятно с анти-GD3 и анти-GD2 антител для локализации ганглиозидов GD3 и GD2 (А) GD3 Ганглиозид отождествляется с R24 анти GD3 антитела в активированных CD4 + Т - клеток показывает внутриклеточный и мембранной локализации. (B) GD2 Ганглиозид отождествить с 14G2анти GD2 антитела в активированных CD4 + Т - клеток показывает только локализацию плазменной мембраны. (С) Светлое микроскопия из активированных CD4 + Т - клеток. GD3 и GD2 пятен оценивали с помощью конфокальной микроскопии из одной стопки с целью 60X S / 1.3 масла с 2 - кратным цифровым зумом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: GD3 и GD2 , локализация ганглиозидов в активированных РВМС (А) GD2 ганглиозидов был обнаружен с 14G2a анти GD2 антителом в анти CD3 / анти CD28 , 72 ч после активированные МНПК накладкой с светлопольному микроскопией, (Б) выражение ганглиозидов GD2 , и (С ) GD2 ганглиозидов и ядра сливаются. (D) GD3 gangliosIde окрашивали R24 анти GD3 антител с наложением светлого поля (Е) GD3 выражение ганглиозидов и (F) GD3 ганглиозидов и ядра сливаются. GD3, GD2 и ядер пятен оценивали с помощью конфокальной микроскопии из одного стека с 60X S / объектив 1.3 масла с 2-кратным цифровым зумом. Шкала бар = 45 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол может быть использован для локализации ганглиозидов или белков в суспензии клеток CD4 + Т - клеток или других клеток иммунной системы (например, PMBCs, рисунок 5) , начиная с небольшого числа клеток. Из-за небольшого размера Т-клеток и не-адгезивных свойств при, приобретение флуоресценции микроскопических изображений приводит к плохой информации или низкого качества, если клетки не правильно придерживалась.
Этот протокол в сочетании с хорошим качеством конфокальной микроскопический анализ является ключевым преимуществом по сравнению с использованием таких методов, как тонкослойной хроматографии для выявления ганглиозидов , поскольку он показывает пространственную локализацию и динамику Ганглиозидов во время лечения (например, активации Т - клеток), что приводит к приобретение биологически соответствующего 11,12,13 данных. Кроме того , этот протокол позволяет оценивать выражения ганглиозидов , начиная с небольшого количества CD4 + Т - клеток (2 × 10 4) , Что полезно для оптимизации количества повторов или различных анализов 6.
Бережное во время промывок и меченых антител после адгезии имеет решающее значение для поддержания количества и целостности клеток. Из - за слабой связи CD4 + Т - клеток к покровным, это также очень важно тщательно добавлять и удалять решения; в противном случае уменьшение числа клеток и увеличение флуоресцентного мусора будут возникать. Когда оценивается с помощью конфокальной микроскопии, иммунным ганглиозидов дает дополнительную информацию, такую как пространственной локализации или совместной локализации с другими молекулами в плазматической мембране или внутриклеточным. Внутриклеточную локализацию требует использования субклеточных маркеров 14, 15. Кроме того, свежие и не фиксированы CD4 + Т - клетки должны быть использованы для окрашивания при определении экспрессии ганглиозидов ограничено к поверхности клетки. Хотя фиксация CD4 + Т - CELLS помогает сохранить образец в течение не менее 5 дней, он несет в себе риск пермеабилизации и внутриклеточного окрашивания.
Тем не менее, из-за структурного сходства между ганглиозидов, всегда желательно учитывать специфичность антител, используемых. Некоторые из коммерчески доступных анти-ганглиозидов моноклональные антитела могут быть использованы и для некоторых из них специфичность была зондируется ELISA, при тонкослойной хроматографии и т.д. 16,17,18.
Предыдущие работы показывают , что можно получить информацию о локализации и экспрессии GD3 и GD2 ганглиозидов от 2 - х 10 4 клеток / в состояние 6. Кроме того , этот протокол описывает способность выполнения генов профилирование экспериментов с 4 - х 10 4 клеток, что позволяет оптимизировать глушителей эксперименты , такие как те , которые основаны на лентивирусов частиц 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
