Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utarbeidelse av CD4 Published: November 8, 2016 doi: 10.3791/54569
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Centro de Investigación en Dinámica Celular, Laboratorio de Glicobiología Humana y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Summary

Vi beskriver en standard antistoffarging protokoll for bruk ved mikroskopi for å bestemme membranen ekspresjon og lokalisering av gangliosider i hvilende og aktiverte humane naive CD4 + T-celler. Det er også beskrevet real-time PCR eksperimenter ved hjelp av <40000 celler som ikke krever ekstra lave innspill RNA kits.

Abstract

Fremgangsmåtene beskrevet heri for aktivering av naive CD4 + T-celler i suspensjon og deres tilslutning i dekkglass for konfokal mikroskopi-analyse tillate den romlige lokalisering og visualisering av gangliosider som er involvert i CD4 + T-celleaktivering, som utfyller uttrykk profilering eksperimenter som flowcytometri, western blotting eller real-time PCR. Kvantifisering av gangliosid uttrykk ved strømningscytometri og deres cellulære lokalisering ved hjelp av mikroskopi kan oppnås ved bruk av anti-gangliosid-antistoffer med høy affinitet og spesifisitet. Ikke desto mindre en tilstrekkelig behandling av celler i suspensjon innbefatter behandling av kulturplater for å fremme den nødvendige tilslutning kreves for fluorescens eller konfokal mikroskopi anskaffelse. I dette arbeidet, beskriver vi en protokoll for å bestemme GD3 og GD2-gangliosid uttrykk og colocalization med TCR i løpet av naive CD4 + T-celleaktivering. Også real-time PCR eksperimenter ved hjelp av <40.000 celler er beskrevet for bestemmelse av GD3 og GM2 / GD2-syntase-gener, noe som viser at genet analyse eksperimenter kan utføres med et lavt antall celler og uten behov for ekstra lave inngangs RNA kits.

Introduction

CD4 + T-celler organisere immunresponsen gjennom sine effektorfunksjoner etter aktivering av antigen-presenterende celler 1. Studiet av de cellulære mekanismer som er modulert under aktivering tillater innsyn i en grunnleggende prosess med immunfunksjon. Imidlertid kan studiet av naive CD4 + T-celler være komplisert fordi de representerer en meget liten populasjon av celler i blodet periferien 2.

Gjennom fluorescensmikroskopi flere rapporter har studert for lokalisering av forskjellige molekyler som er involvert i CD4 + T-celleaktivering, i hovedsak proteiner forbundet til plasmamembranen 3. Gangliosidene er sialinsyre-inneholdende glykosfingolipider og selv om de har blitt omfattende studert i nerveceller, hvor de er rikelig, andre celler, for eksempel immunceller som også uttrykker gangliosider med biologisk relevante funksjoner 4,5. Vi har tidligere rapportert that ved aktivering av humane naive CD4 + T-celler er det en oppregulering av den α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 syntase) og GM2 / GD2-syntase, som induserer den betydelige overflate neoexpression av GD2 og oppregulering av GD3 gangliosid 6. Videre studier av GD3, GD2 og andre gangliosider i immunceller er nødvendig for å utfylle en proteinbasert delvis utsikt over immunforsvar.

Vanligvis blir studiet av gangliosidet uttrykk basert på teknikker, slik som tynnsjiktskromatografi (TLC) 7, men denne teknikken tillater ikke den romlige lokalisering av gangliosider ved plasmamembranen, eller i subcellulære kamre, noe som begrenser biologisk analyse.

I dette arbeidet, beskriver vi en protokoll for antistoff-mediert identifikasjon og lokalisering av GD3 og GD2 gangliosider i humane naive CD4 + T-celler og PBMC etter at anti-CD3 / anti-CD28-aktivering. Med denne protokollen det jegs også mulig å analysere genet og molekyl ekspresjon av gangliosider i et lavt antall celler i suspensjon, med anskaffelse av bilder av høy kvalitet 6, tatt i betraktning den lille størrelsen av lymfocytter (9 um).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Perifert blod fra friske mannlige donorer ble oppnådd med informert samtykke og godkjenning av bioetikkomité av Centro de INVESTIGACION en Dinamica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Isolering og aktivering av humane naive CD4 + T-celler

  1. Samle 2 ml perifert blod avledet fra friske pasienter gjennom informert samtykke og fortynn med 2 ml steril PBS-EDTA (1 x fosfatbufret saltvann (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Tilsett langsomt fortynnet blod på toppen av 3 ml sukrose oppløsning med 1,077 tetthet som tidligere beskrevet 8.
    Merk: Differential migrasjon under sentrifugeringen forårsaket av forskjeller i tetthet vil føre til erytrocytter å sedimentere fullstendig og et lag av mindre tette mononukleære celler vil danne ovenfor. 2 ml perifert blod vil gjengi ca 0,5 x 10 6 naive CD4 + T-celler etter rensing;på trinnene.
  2. Sentrifuger i 30 minutter ved 250 xg ved 21 ° C (bruk rotor for rundbunnede rør med fast vinkel på 30 mm) uten noen pause for å generere gradient av perifere mononukleære blodceller (PBMC). Etter sentrifugering kan det PBMC observeres tydelig som en hvit ring. Samle PBMC med en pipette og overføres til sterile rør for vask.
  3. Etter tre vaskinger med PBS-EDTA-oppløsning ved 250 xg i 10 minutter videre til rensing av naive CD4 + T-celler. Sortering metoder eller flere typer rensesett er tilgjengelig for dette formålet. Bruk fortrinnsvis> 1 x 10 7 PBMC for rensing.
    1. Rens naive CD4 + T-celler ved negativ seleksjon med magnetiske kuler. Utfør negativ seleksjon med anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, og CD235a (glykoforin A) antistoffer. Bedømme andelen av renhet ved å bestemme CD4 + CD45RA + -celler via flav cytometri.
      Merk: Eventuelt kan fortsette til inkubering av PBMC over natten ved 37 ° C og 5% CO 2 med en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml i 10 ml supplementert medium for å fremme monocytt tilslutning og fortsette med naive CD4 + T-celle-rensing. Den effektiv utvinning av naive CD4 + T-celler fra perifert blod avhenger i stor grad av rensesystemet.
  4. Fremstille 24-brønners cellekulturplater ved tilsetning av 250 ul per brønn av PBS med 5 ug / ml anti CD3 monoklonalt antistoff og inkuberes i minst 2 timer ved 37 ° C.
    Merk: Plater med 96 brønner kan brukes når et mindre antall fra naive CD4 + T-celler brukes (for eksempel 2 x10 4 -1 x 10 5).
  5. Fjern anti CD3-antistoff-fortynning fra 24 brønnen eller 96-brønners plater og vaskes platene to ganger under anvendelse av sterilt 1 x PBS.
  6. Fortynne naive CD4 + T-celler med> 95% av renhet (CD4 +CD45RA +) til en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml i avansert RPMI 1640 medium supplert med 3% føtalt bovint serum (eller i RPMI supplert med 10% serum), 2 mM glutamin og antibiotika (1 U / ml penicillin, 1 ug / ml streptomycin).
    Merk: Hvis gangliosid lokalisering er nødvendig i PBMC ved å følge den samme protokoll for fortynning og stimulering som beskrevet nedenfor.
  7. Legg 500 mL av cellen fortynning til anti CD3 belagt brønner og til ikke-belagte brønner (kontrollceller) i 24 brønners plate. Alternativt, tilsett 100 ul av celle fortynning til brønnene i 96-brønners plate.
  8. Fullfør stimuleringsbetingelser naive CD4 + T-celler i anti-CD3-belagte brønner ved tilsetning av 1 pg / ml av anti CD28 antistoff.
  9. Hold hvilende CD4 + T-celler som kontroll i de ikke-belagte brønner uten tilsetning av anti CD28 antistoff. Inkuber hvilende og aktiverte CD4 + T-celle i 0 til 72 timer under standardbetingelser på 37 °C og 5% CO2.
  10. For å verifisere en tilstrekkelig aktiverings vurdere ved strømningscytometri ekspresjonen av CD69 tidlig aktivering markør (16 timer etter aktivering) eller CD25 sen aktivering markør (48 timer etter aktivering) i hvilende og aktiverte naive CD4 + T-celler inkubert ved 37 ° C og 5% CO 2 i fravær eller tilstedeværelse av anti CD3 / CD28 antistoff 9,10.

2. Overholdelse av hvile og Aktivert naive CD4 + T celler

  1. Steriliser 12 mm runde Dekk ved autoklave og UV-lys eksponering i minst 15 min.
  2. Plasser dekk i sterile 24-brønns cellekulturplater.
    Merk: For kulturer med mindre enn 1 x 10 5 celler er det best å bruke lysbilde kamre med tilpasset små brønner for å hindre spredning av celler i dekkglass.
  3. Coat Dekkglass (eller sleidekammeret) med 200 ul av poly-L-lysin (MW 150-300 kd) 0,1% (w / v) løsning og inkuberes i 5 minutter ved room temperatur (RT), fjerne og tørke i minst en time ved RT.
  4. Bland forsiktig og samle hvile og aktiverte naive CD4 + T-celler fra de 24-brønners plater. Tell cellene og om nødvendig justeres med ferskt medium supplert for å overføre 1 x 10 5 celler til de poly-L-lysin-belagte dekkglass. Cellene inkuberes i minst 6 timer ved 37 ° C og 5% CO2.

3. Innsamling og fiksering av hvile og aktivert naive CD4 + T celler

  1. Fjern forsiktig mediet fra kultiverte hvile og aktiverte naive CD4 + T-celler.
  2. Legg 500 mL av RT steril PBS sakte.
    Merk: Forsiktig addisjon og fjerning av løsninger fra brønner hindrer avløsning av celler fra dekkglass.
  3. Kast PBS og legge til en annen 500 mL PBS å grundig fjerne kulturmedier.
  4. Fest cellene ved tilsetning av 500 ul filtrert 4% paraformaldehyde (filtrasjon fjerner mikropartikler som kan forstyrre mikroskopi-analyse) og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur (foretrukket) eller over natten ved 4 ° C.
    Forsiktig: Paraformaldehyde er en giftig og flyktige sammensatte. Det er kjent for å være et karsinogen for mennesker. Bruk forsiktig med en passende sikkerhetsprotokoll.
  5. Fjern fiksativ og vaske minst to ganger med PBS ved RT.
  6. Fortsett til neste steg, eller opprettholde plate brønner med 500 mL PBS ved 4 ° C i flere dager til farging.
    Merk: Sterilitet i løpet av denne prosessen bidrar til å unngå mikroorganisme vekst.

4. Farging, Montering og visualisering av konfokalmikroskopi

  1. Fjern PBS fra brønnene. Legge til 500 ul kald blokkeringsbuffer (1 x PBS, 0,5% standard karakter bovint serum albumin, 1% føtalt bovint serum, pH 7,4). Inkuber i 20 min på is.
  2. Fjern blokkering buffer nøye og legge de primære antistoffer (anti gangliosidene GD3 klone R24, GD2 klone 14G2a),PE-konjugert anti CD25 og APC-konjugert anti TCR og isotyper kontroller fortynnet i blokkeringsbuffer til 2,5 ug / ml.
  3. Inkuber i 2 timer på is eller over natten ved 4 ° C.
    Merk: Slow orbital agitasjon er å foretrekke.
  4. Ta av antistoff nøye og legge sakte 500 mL PBS. Gjenta to ganger.
  5. Tilsett sekundære antistoff (FITC-konjugert anti IgG3 for R24 ​​anti GD3, Alexa Fluor 488-konjugert eller Alexa Fluor 647-konjugert anti-IgG2a for 14G2a anti GD2) fortynnet i blokkeringsbuffer til 0,1 ug / ml.
  6. Inkuber i 1 time på isen i mørket uten risting.
  7. Vask tre ganger i PBS, som beskrevet i 4.4). Hold brønner med nok PBS å unngå dehydrering av prøvene.
  8. Legg Hoechst 333258 flekk fortynnet i PBS til 0,1 ug / ml.
  9. Inkuber 15 min ved RT og fjerne. Vask tre ganger i PBS.
  10. Plasser lysbilder på et papirhåndkle og legge til 20 mL av monteringsløsning (50% glycerol i PBS) eller kommersiell monteringsløsnings for å unngå falming og leskende fra prøvene.
  11. Nøye plukke opp dekkglass med fine pinsett og legg den på monteringsløsning. Sikre at den siden av dekkglass, hvor cellene er festet er i kontakt med løsningen. Tett glassene med neglelakk og analysere ved hjelp av fluorescens eller konfokalmikroskopi.

5. Isolering av RNA

  1. Fremstille anti CD3-antistoff (5 pg / ml) belagt 96-brønners plater. Inkuber 4 x 10 4 naive CD4 + T-celler / brønn i 100 ul kulturmedium supplert med anti CD28 antistoff (1 ug / ml) for å fullføre stimulus. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 0 til 72 timer.
  2. Etter forskjellige post-aktiverings ganger plassere cellene i en mikro tube.
  3. Legg 500 mL PBS og sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml Trizol reagens.
  5. Inkuber i 5 min ved romtemperatur og holde prøven ved -8076 C i minst 24 timer. Fortsett med RNA isolering når det trengs.
    Merk: Hvis du lar prøven ved -80 ° C i minst 24 timer forbedrer RNA yield. Dessuten er vesentlig for å unngå degradering av RNA RNaser bruk av hånd hansker.
  6. Tine prøven ved inkubering ved 37 ° C i 2 minutter i et vannbad.
  7. Tilsett 200 ul kloroform og ristes kraftig for hånd i 30 sekunder (for å unngå aggressiv blanding av RNA ved å virvle). Inkuber 5 min ved RT.
  8. Sentrifuger i 15 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
  9. Gjenvinne den vandige fase inn i en ny mikrosentrifuge-rør.
  10. Legg 500 mL isopropanol og Snu røret tre ganger.
  11. Inkuber 10 min ved RT og sentrifuger i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
  12. Kast supernatanten ved inversjon.
  13. Tilsett 1 ml iskald 75% etanol og sentrifuger i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
  14. Helt kast supernatanten og tørk RNA pellet ved å la korken av røret åpen.
    Ikkee: På dette punktet pellet er ikke klart synlig. Fortsett uansett.
  15. Resuspender pelleten i 20 pl molekylær klasse vann. Beregne konsentrasjonen og renheten av nukleinsyrer ved å måle 260 nm og 280 nm absorbans ved hjelp Nanodrop.
  16. Gå forsiktig til syntese av cDNA ved hjelp av hvilken som helst konvensjonell revers transkriptase kit og følge produsentens protokoll.
    Merk: Ca. 0,5-2 pg RNA blir oppnådd fra 4 x 10 4 naive CD4 + T-celler. cDNA kan bli syntetisert fra 100 ng av RNA og brukes i sanntid PCR reaksjoner uten behov for lave RNA inngangssett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen er beskrevet i dette manuskriptet gjør en god kvalitet på kultivert og levd hvile og aktiverte humane naive CD4 + T-celler (figur 1). De aktiverte CD4 + T-celler viser den karakteristiske profilen proliferative (figur 1B) i forhold til den hvilende tilstand (figur 1A). Den CD25 sent aktivering markør er nyttig for å vurdere effektiv aktivering på 72 timer observert av konfokalmikroskopi (figur 1C). Den CD69 markør brukes i dag som tidlig aktivering markør ved flowcytometri eller mikroskopi. Adherens av hvilende og aktiverte naive CD4 + T-celler til et dekkglass belagt med poly-L-lysin er nyttige for å studere ekspresjonen og lokalisering av GD3 og TCR viste ved en dobbel merking med anti GD3 og anti-TCR-antistoff (figur 2). Som vi rapporterte tidligere, er aktivering ledsaget av oppussinging av GD3 og GD2 gangliosider i cellene overflaten 6. I tillegg er genekspresjon kvantifisering av GD3 og GM2 / GD2 synthases utføres fra 4 x 10 4 celler (figurene 2 og 3). Den neo-uttrykk for GD2 gangliosid og TCR colocalization er tilstrekkelig observert av konfokalmikroskopi, viser en mulig rolle GD2 i TCR clustering under aktivering (figur 3). Figur 4 viser lokalisering av GD3 og GD2 gangliosid farget samtidig i aktivert CD4 + T-celler. I tillegg ble aktivert PBMC farget med anti GD3 og GD2 anti-antistoffer som viser at denne protokollen kan brukes i andre immuncellepopulasjoner som finnes i PMBCs, særlig GD2 som ble funnet å være uttrykt i alle de aktiverte PMBCs (figur 5).

Figur 1
Figur 1: Visualisering av naive CD4 + T-celler etter tilslutning og effektiv anti CD3 / anti-CD28-aktivering (A) hvilende CD4 + T-celler ved 72 timer etter aktivering festet på poly-L-lysin-behandlede dekkglass er observert ved lysfelt. mikroskopi. (B) Aktivert CD4 + -T-celler ved 72 timer festet på poly-L-lysin behandlede dekkglass. (C) CD25 markør uttrykket (rød) og Hoechst 333258 farget kjerner (blå) av anti CD3 / anti CD28-aktiverte CD4 + T-celler ved 72 timer etter aktivering. Scale bar = 50 mikrometer. Bilder ble oppnådd ved konfokalmikroskopi med en 60X S / 1,3 olje objektiv med 2x digital zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Figur 2: GD3-gangliosid og TCR flekken og mikros lokalisering på hvilende og aktivert naive CD4 + T-celler ved 72 timer etter aktivering av hvilende CD4 + T-celler med (A) kjerner farget med Hoechst 333258, (B) GD3-gangliosid lokalisering, (. C) Slå sammen av kjerner og GD3 gangliosid. Aktiverte CD4 + T-celler med (D) kjerner farget med Hoechst 333258, (E) GD3-gangliosid lokalisering og (F) Slå sammen av kjerner og GD3-gangliosid. (G) og (H) viser TCR og GD3-gangliosid i hvilende naive CD4 + T-celler. (J og K) tilsvarer TCR og GD3-gangliosid farging i aktiverte CD4 + T-celler. Konfokale bilder av TCR (rød) og GD3-gangliosid (grønn) lokalisering i hvilende naive CD4 + T-celler (I) oganti CD3 / CD28 Aktivert naive CD4 + T celler 72 timer etter aktivering (L). Den GD3, TCR og kjerner flekken ble vurdert ved konfokalmikroskopi fra en stabel med en 60X S / 1,3 olje objektiv med 2x digital zoom. (M) Grafen viser genuttrykk for GD3 syntase bestemmes av real-time PCR uttrykt som Fold endring fra 4 x 10 4 hviler (Rest) og aktiverte (ACT) naive CD4 + T-celler på 72 timer etter aktivering. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige givere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: GD2 gangliosid og TCR flekken og mikros lokalisering i hvilende og aktiverte naive CD4 + T-celler på 72 timer etter aktivering. + T-celler med (A) kjerner farget med Hoechst 333258, (B) GD2 gangliosid lokalisering, (C) Slå sammen av kjerner og GD2 gangliosid. Aktiverte CD4 + T-celler med (D) kjerner farget med Hoechst 333258, (E) GD2 gangliosid lokalisering og (F) Slå sammen av kjerner og GD2 gangliosid. (G og H) viser TCR og GD2 gangliosid i hvilende naive CD4 + T-celler. (J og K) tilsvarer TCR og GD2-gangliosid farging i aktiverte CD4 + T-celler. Confocal bilder av TCR (rød) og GD2 gangliosid (grønn) lokalisering i hvilende naive CD4 + T-celler (I) og anti CD3 / CD28 Aktivert naive CD4 + T celler 72 timer etter aktivering (L). Den GD2, TCR og kjerner flekk ble bestemt ved konfokal mikroskopi fra en stabel med et60X S / 1,3 olje objektiv med 2x digital zoom. (M) Grafen viser genuttrykk for GM2 / GD2 syntase bestemmes av real-time PCR uttrykt som Fold endring fra 4 x 10 4 hviler (Rest) og aktiverte (ACT) naive CD4 + T-celler på 72 timer etter aktivering. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige givere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Dobbel flekken med anti-GD3 og anti-GD2 antistoff til GD3 og GD2 gangliosider lokalisering (A) GD3-gangliosid identifisert med R24 anti GD3-antistoffet i aktiverte CD4 + T-celler viser intracellulær og membranen lokalisering. (B) GD2 gangliosid identifisert med 14G2et anti GD2-antistoff i aktiverte CD4 + T-celler viser bare plasmamembranen lokalisering. (C) Lysfelt mikros fra aktiverte CD4 + T-celler. Den GD3 og GD2 flekken ble vurdert ved konfokalmikroskopi fra en stabel med en 60X S / 1,3 olje objektiv med 2x digital zoom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Fig. 5: GD3 og GD2-gangliosid lokalisering i aktiverte PBMC (A) GD2-gangliosid ble påvist med 14G2a anti GD2-antistoff i anti CD3 / anti CD28 72 timer etter aktiverte PBMC overlegg med lysfelt-mikroskopi, (B) GD2-gangliosid uttrykk og (C ) GD2 gangliosid og kjerner flette. (D) GD3 gangliosIde farget med R24 anti GD3 antistoff overlay med lysfelt, (E) GD3 gangliosid uttrykk og (F) GD3 gangliosid og kjerner flette. Den GD3, GD2 og kjerner flekken ble vurdert ved konfokalmikroskopi fra en stabel med en 60X S / 1,3 olje objektiv med 2x digital zoom. Scale bar = 45 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere gangliosider eller proteiner i cellesuspensjoner av CD4 + T-celler eller andre immune celler (f.eks PMBCs, figur 5) ved å starte fra et lite antall celler. På grunn av den lille størrelsen på T-celler og ikke-heftende egenskapene, oppkjøp av fluorescens mikroskopiske bilder gir dårlig informasjon eller lav kvalitet hvis cellene er ikke riktig overholdt.

Denne protokollen kombinert med en god kvalitet konfokal mikroskopi-analyse er en viktig fordel i forhold til anvendelse av teknikker som tynnsjiktskromatografi for påvisning av gangliosider fordi den avdekker den romlige lokalisering og dynamikk av gangliosider under behandling (som T-celleaktivering), som fører til oppkjøpet av biologisk relevant data 11,12,13. Også denne protokollen tillater evaluering av gangliosidet ekspresjon fra et lite antall CD4 + T-celler (2 x 10 4) Som er nyttig for å optimalisere antallet replikater eller forskjellige analyser 6.

Den forsiktige behandling under vasker og antistoff farging etter vedheft er avgjørende for å opprettholde celle nummer og integritet. På grunn av den svake binding av CD4 + T-celler til dekkglass, er det også meget viktig å nøye legge til og fjerne løsninger; ellers en reduksjon i celletall og økt fluorescerende rusk vil bli møtt. Når vurderes gjennom konfokalmikroskopi, det farging av gangliosider overfører tilleggsinformasjon som romlig lokalisering eller samlokalisering med andre molekyler i plasma membran eller intracellulære rom. Subcellulære lokalisering krever bruk av subcellulære markører 14, 15. I tillegg er frisk og ikke fast CD4 + T-celler må brukes for farging ved bestemmelse av gangliosid-ekspresjon begrenset til celleoverflaten. Selv om fiksering av CD4 + T cells bidrar til å bevare prøven i minst 5 dager, det bærer risikoen for permeabilization og intracellulær farging.

Men på grunn av den strukturelle likheten mellom gangliosider, er det alltid tilrådelig å ta hensyn til spesifisiteten av antistoffer som brukes. Flere av de kommersielt tilgjengelige anti-gangliosid-monoklonale antistoffer kan anvendes, og for noen av dem spesifisiteten er blitt analysert ved hjelp av ELISA, TLC, etc. 16,17,18.

Tidligere arbeider viser at det er mulig å oppnå informasjon angående lokalisasjon og ekspresjon av GD3 og GD2 gangliosider fra 2 x 10 4 celler / pr tilstand 6. Dessuten beskriver denne protokollen evnen til å utføre genet profilering eksperimenter fra 4 x 10 4 celler, slik at optimalisering av stanse eksperimenter slik som de som er basert på lentiviral partikler 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 12633-012 Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody eBioscience 16-0037-81 OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody ebioscience 16-0288-81 CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody Abcam ab11779 R24 clone
mouse anti human GD2 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53831 14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3
antibody		 Abcam ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse Thermo Fisher Scieni¡tific A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405
 Ficoll Paque-Plus GE 17-1440-02 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human MACS Miltenyi Biotec 130-094-131
BD FACSAria II BD Biosciences Sorting 
Nunc Lab-tek chamber slide system Sigma-Aldrich C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)  Olympus Upright BX61WI and IX81 
Forward sequence primer GD3 synthase 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ Ref. 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
  2. Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
  3. Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
  4. Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
  5. Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
  6. Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
  7. Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
  8. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  9. O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
  10. Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
  11. Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
  12. Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
  13. Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
  14. Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
  15. Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
  16. Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
  17. Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
  18. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).

Tags

Immunologi human CD4 + T-celle aktivering antistoff gangliosider TCR lokalisering konfokalmikroskopi etterlevelse
Utarbeidelse av CD4<sup&gt; +</sup&gt; T celler for analyse av GD3 og GD2 Gangliosid Membran Expression ved mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villanueva-Cabello, T. M.,… More

Villanueva-Cabello, T. M., Martinez-Duncker, I. Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy. J. Vis. Exp. (117), e54569, doi:10.3791/54569 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter