Summary
We beschrijven een standaard protocol antilichaam kleuring voor microscopie aan het membraan expressie en localisatie van gangliosiden in rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen te bepalen. Ook beschreven zijn real-time PCR experimenten met <40.000 cellen die geen extra lage input RNA kits vereisen.
Abstract
De hierin beschreven voor activering van naïeve CD4 + T-cellen methoden in suspensie en de hechting in dekglaasjes confocale microscopie analyse kan de ruimtelijke lokalisatie en visualisatie van gangliosiden die deze CD4 + T-cel activatie, die complement expressieprofielen experimenten zoals flowcytometrie, Western blotting of real-time PCR. De kwantificering van ganglioside expressie door middel van flowcytometrie en hun cellulaire lokalisatie door middel van microscopie kan worden verkregen door het gebruik van anti-ganglioside antilichamen met hoge affiniteit en specificiteit. Desalniettemin, een goede behandeling van cellen in suspensie omvat de behandeling van kweekplaten de nodige hechting vereist voor fluorescentie of confocale microscopie verwerving promoten. In dit werk beschrijven we een protocol voor het bepalen en GD3 ganglioside GD2 expressie en colokalisatie met de TCR in naïeve CD4 + T-cel activatie. Ook real-time PCR experimenten met <40.000 cellen beschreven voor het bepalen van de GD3 en GM2 / GD2 synthase genen, waaruit blijkt dat gen analyse experimenten kunnen worden uitgevoerd met een gering aantal cellen en zonder dat extra lage input RNA kits.
Introduction
De CD4 + T-cellen orkestreren de immuunrespons door hun effectorfuncties na activering door antigen presenterende cellen 1. De studie van de cellulaire mechanismen die gemoduleerd bij activering zorgt inzicht in een basisproces van immuunfunctie. Echter, de studie van naïeve CD4 + T-cellen worden gecompliceerd omdat zij een zeer kleine populatie van bloedcellen periferie 2.
Door fluorescentiemicroscopie verscheidene rapporten de lokalisatie van verschillende moleculen die betrokken zijn bij CD4 + T-cel activatie, voornamelijk geassocieerde eiwitten naar de plasmamembraan 3 bestudeerd. De gangliosiden siaalzuur bevattende glycosfingolipiden en hoewel ze zijn uitgebreid bestudeerd in zenuwcellen wanneer zij overvloedig, andere cellen zoals immuuncellen ook aangeven gangliosiden met biologisch relevante functies 4,5. We eerder gemeld that tijdens activatie van naïeve CD4 + T-cellen er een opregulatie van de α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 synthase) en de GM2 / GD2 synthase induceren dat het aanzienlijke oppervlak van neoexpression GD2 en GD3 ganglioside opregulatie van 6. Nader onderzoek van GD3, GD2 en andere gangliosiden immuuncellen dient een eiwit gebaseerde gedeeltelijke weergave van immuunfunctie vullen.
Gewoonlijk is de studie van ganglioside expressie gebaseerd op technieken zoals dunnelaagchromatografie (TLC) 7, maar deze techniek niet de ruimtelijke lokalisatie van gangliosiden toe op het plasmamembraan of in subcellulaire compartimenten beperken biologische analyse.
In dit werk beschrijven we een protocol voor de antilichaam gemedieerde identificatie en lokalisatie van GD3 en GD2 gangliosiden in naïeve humane CD4 + T-cellen en PBMC's na anti-CD3 / anti-CD28 activatie. Met dit protocol is iook mogelijk om het gen en moleculaire expressie van gangliosiden analyseren een gering aantal cellen in suspensie met beeldopname hoogwaardige 6, gezien de beperkte omvang van lymfocyten (9 um).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifere bloed van gezonde mannelijke donoren werd verkregen met informed consent en goedkeuring van de bio-ethiek Comité van de Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autònoma del Estado de Morelos.
1. Isolatie en activering van menselijke naïeve CD4 + T-cellen
- Verzamel 2 ml perifeer bloed verkregen van gezonde humane donoren een geïnformeerde instemming en verdun met 2 ml steriele PBS-EDTA (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Voeg het verdunde bloed langzaam bovenop 3 ml sucrose-oplossing met 1,077 dichtheid zoals eerder beschreven 8.
Opmerking: Differentiële migratie gedurende centrifugatie veroorzaakt door verschillen in dichtheid veroorzaakt erytrocyten volledig sedimenteren en een laag van lagere dichtheid mononucleaire cellen bovenstaande vormen. 2 ml perifeer bloed ongeveer 0,5 x 10 6 naïeve CD4 + T-cellen maken na purificatiop stappen. - Centrifugeer 30 minuten bij 250 xg bij 21 ° C (gebruik rotor rondbodem buizen met vaste hoek van 30 mm) zonder onderbreking op het verloop van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) te genereren. Na centrifugeren kan de PBMC duidelijk waargenomen als een witte ring. Verzamel de PBMC's met een pipet overgebracht naar steriele buizen voor het wassen.
- Na drie wassingen met PBS-EDTA oplossing bij 250 xg gedurende 10 min over tot de zuivering van naïeve CD4 + T-cellen. Sorteer- en verschillende soorten zuivering kits beschikbaar voor dit doel. Gebruik bij voorkeur> 1 x 10 7 PBMC voor zuivering.
- Zuiver naïeve CD4 + T-cellen door negatieve selectie met magnetische kralen. Voer negatieve selectie met anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, en CD235a (glycoforine A) antilichamen. Beoordelen van het percentage van de zuiverheid door het bepalen van CD4 + CD45RA + cellen door flage cytometrie.
Opmerking: Eventueel overgaan tot incubatie van PBMCs nacht bij 37 ° C en 5% CO2 met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in 10 ml gesupplementeerd medium monocyt aanhechting bevorderen en verder met naïeve CD4 + T-cel zuivering. De efficiënte terugwinning van naïeve CD4 + T-cellen uit perifeer bloed hangt grotendeels af van de zuiveringsinstallatie.
- Zuiver naïeve CD4 + T-cellen door negatieve selectie met magnetische kralen. Voer negatieve selectie met anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, en CD235a (glycoforine A) antilichamen. Beoordelen van het percentage van de zuiverheid door het bepalen van CD4 + CD45RA + cellen door flage cytometrie.
- Bereid 24-well celkweekplaten door toevoeging van 250 ul per putje van PBS met 5 ug / ml anti-CD3 monoklonaal antilichaam en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Platen met 96 putjes kan worden gebruikt wanneer een kleiner aantal van naïeve CD4 + T-cellen worden gebruikt (bijvoorbeeld, 2 x 10 x 4 -1 10 5). - Verwijder de anti CD3 antilichaam verdunning van de 24 put of platen met 96 putjes en spoel de platen tweemaal met steriele 1x PBS.
- Verdun de naïeve CD4 + T-cellen met> 95% zuiverheid (CD4 +CD45RA +) tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in advanced RPMI 1640 medium aangevuld met 3% foetaal runderserum (of RPMI gesupplementeerd met 10% serum), 2 mM glutamine en antibiotica (1 U / ml penicilline, 1 gg / ml streptomycine).
Opmerking: Als ganglioside localisatie is vereist PBMC volgt hetzelfde protocol verdunning en stimulatie zoals hieronder beschreven. - Voeg 500 ul van de cel verdunning tot anti CD3 beklede putjes en niet-beklede putjes (controlecellen) in 24 wells plaat. Alternatief, voeg 100 ul van de cellen in de putjes van de plaat met 96 putjes.
- Voltooi de stimuleringscondities van naïeve CD4 + T-cellen in anti CD3 gecoate wells door toevoeging van 1 ug / ml anti-CD28 antilichaam.
- Houd de rustende CD4 + T-cellen als controle in de niet-beklede putjes zonder toevoeging van anti- CD28 antilichamen. Incubeer de rustende en geactiveerde CD4 + T-cellen gedurende 0 tot 72 uur onder normale omstandigheden van 37 °C en 5% CO2.
- Om een adequate activatie verifiëren evalueren flowcytometrie de expressie van het CD69 vroege activatie marker (16 uur na activering) of CD25 late activatie marker (48 uur na activering) in rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2 in afwezigheid of aanwezigheid van anti CD3 / CD28-antilichamen 9,10.
2. Hechting van Rusten en Geactiveerde Naïve CD4 + T-cellen
- Steriliseren 12 mm rond dekglaasjes in een autoclaaf en belichting UV-licht gedurende ten minste 15 min.
- Plaats dekglaasjes in steriele 24-well celkweek platen.
Opmerking: Bij culturen met minder dan 1 x 10 5 cellen wordt bij voorkeur slide kamers gebruiken met aangepaste kleine putten dispersie van cellen in het dekglaasje te voorkomen. - Coat dekglaasjes (of schijfjeskamer) met 200 pl poly-L-lysine (MW 150-300 kDa) 0,1% (w / v) oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij room temperatuur (RT), te verwijderen en drogen gedurende ten minste 1 uur bij KT.
- Meng zorgvuldig en het verzamelen van de rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen van de 24-well platen. Tel de cellen en stel eventueel met vers medium gesupplementeerd met 1 x 10 5 cellen overbrengen naar de poly-L-lysine beklede dekglaasjes. Incubeer de cellen gedurende ten minste 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
3. Het verzamelen en Fixatie van Rusten en Geactiveerde Naïve CD4 + T-cellen
- Verwijder voorzichtig het medium uit gekweekte rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen.
- Voeg 500 ul van RT steriel PBS langzaam.
Opmerking: zorgvuldige toevoeging en verwijdering van oplossingen uit putten voorkomt het losmaken van cellen uit het dekglaasje. - Gooi de PBS en voeg nog eens 500 ul PBS om grondig te verwijderen voedingsbodems.
- Fixeer de cellen door toevoeging van 500 pi gefilterde 4% paraformaldehyde (filtrantsoen verwijdert microdeeltjes die kunnen interfereren met microscopie analyse) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (bij voorkeur) of overnacht bij 4 ° C.
Let op: Paraformaldehyde is een giftige en vluchtige verbinding. Het is bekend om een menselijk carcinogeen. Gebruik voorzichtig met een geschikte veiligheidskabel protocol. - Verwijder het fixeermiddel en was ten minste tweemaal met PBS bij kamertemperatuur.
- Naar de volgende stap of onderhoud van de putjes met 500 pl PBS bij 4 ° C gedurende enkele dagen tot kleuring.
Opmerking: steriliteit tijdens dit proces helpt te voorkomen dat micro-organismen groei.
4. kleuring, Montage en Visualisatie door confocale microscopie
- Verwijder de PBS uit de putjes. Voeg 500 ul koude blokkerende buffer (1x PBS, 0,5% standaardkwaliteit runderserumalbumine, 1% foetaal bovien serum pH 7,4). Incubeer gedurende 20 min op ijs.
- Verwijder de blokkering buffer voorzichtig en voeg de primaire antilichamen (anti gangliosiden GD3 kloon R24, GD2 kloon 14G2a),PE-geconjugeerd anti-CD25 en APC-geconjugeerd anti TCR en isotypen controles verdund in het blokkeren van buffer tot 2,5 ug / ml.
- Incubeer 2 uur op ijs of overnacht bij 4 ° C.
Opmerking: Slow orbitale agitatie de voorkeur. - Verwijder het antilichaam zorgvuldig en voeg langzaam 500 pl PBS. Herhaal dit twee keer.
- Voeg de secundaire antilichamen (FITC geconjugeerd anti IgG3 voor R24 anti GD3, Alexa Fluor 488-geconjugeerd of Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti IgG2a voor 14G2a anti GD2) verdund in het blokkeren van buffer tot 0,1 ug / ml.
- Incubeer gedurende 1 uur op ijs in het donker zonder schudden.
- Was drie keer in PBS zoals beschreven in 4.4). Houd de putjes met PBS voldoende om de dehydratatie van monsters te voorkomen.
- Voeg Hoechst vlek 333.258 verdund in PBS met 0,1 ug / ml.
- Incubeer 15 min bij RT en verwijderen. Was drie keer in PBS.
- Plaats de objectglaasjes op keukenpapier en voeg 20 ul bevestigingsoplossing (50% glycerol in PBS) of commerciële bevestigingsoplossings om te voorkomen dat vervagen en afschrikken uit monsters.
- pick voorzichtig op het dekglaasje met fijne pincet en plaats het op de montage oplossing. Zorgen dat de zijde van het dekglaasje waarin cellen verbonden in contact met de oplossing. Sluit de dekglaasjes met nagellak en te analyseren met behulp van fluorescentie of confocale microscopie.
5. Isolatie van RNA
- Bereid anti CD3 antilichaam (5 ug / ml) beklede platen met 96 putjes. Incubeer 4 x 10 4 naïeve CD4 + T-cellen / putje in 100 gl aangevuld kweekmedium met anti CD28 antilichaam (1 ug / ml) op de stimulus te voltooien. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 0-72 uur.
- Na verschillende post-activering keer plaats de cellen in een microcentrifugebuis.
- Voeg 500 pl PBS en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en voeg 1 ml TRIzol reagens.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en houdt het monster -8076; C gedurende ten minste 24 uur. Ga verder met de RNA-isolatie wanneer nodig.
Opmerking: Het verlaten van het monster bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur verbetert RNA opbrengst. Ook het gebruik van handschoenen is essentieel om RNA afbraak door RNasen voorkomen. - Ontdooien monster door incubatie bij 37 ° C gedurende 2 min in een waterbad.
- Voeg 200 ul chloroform en schud krachtig met de hand gedurende 30 seconden (tegen agressieve mengen van RNA te vermijden door vortexen). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Herstel de waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis.
- Voeg 500 ul isopropanol en draai de buis drie keer.
- Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant door inversie.
- Voeg 1 ml ijskoude 75% ethanol en centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Volledig gooi het supernatant en droog de RNA pellet door het verlaten van de dop van de buis geopend.
Niete: Op dit punt de pellet niet duidelijk zichtbaar. Ga toch door. - Resuspendeer de pellet in 20 gl moleculair kwaliteit water. Bereken de concentratie en zuiverheid van de nucleïnezuren door het meten van 260 nm en 280 nm absorptie via NanoDrop.
- Gaat zorgvuldig synthese van cDNA met behulp van elke conventionele reverse transcriptase kit en na het merk gebruikt protocol.
Opmerking: Ongeveer 0,5-2 pg RNA wordt verkregen uit 4 x 10 4 naïeve CD4 + T-cellen. cDNA kan worden gesynthetiseerd vanuit 100 ng RNA en dat in real-time PCR reacties zonder de noodzaak van lage RNA ingang kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in dit manuscript beschreven protocol maakt een goede kwaliteit van gekweekte en gehecht rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen (Figuur 1). De geactiveerde CD4 + T-cellen tonen de karakteristieke proliferatieve profiel (Figuur 1B) ten opzichte van de rusttoestand (figuur 1A). De late activatie CD25 marker is nuttig voor de efficiënte activering bij 72 uur waargenomen door confocale microscopie (figuur 1C) te evalueren. De CD69 marker wordt momenteel gebruikt als vroege activatie marker door middel van flowcytometrie of microscopie. Hechting van rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen om een dekglaasje bedekt met poly-L-lysine zijn nuttig voor de expressie en localisatie van TCR en GD3 bestuderen getoond door een dubbele labeling met anti GD3 en anti- TCR-antilichamen (Figuur 2). Zoals we al eerder gemeld, wordt de activering begeleid door verbouwening van GD3 en GD2 gangliosiden in de cellen oppervlak 6. Bovendien wordt genexpressie kwantificering van de GD3 en GM2 / GD2 synthases uitgevoerd van 4 x 10 4 cellen (figuren 2 en 3). De neo-expressie van GD2 ganglioside en TCR colocalization adequaat waargenomen door confocale microscopie, tonen een mogelijke rol van GD2 in TCR clustering tijdens de activering (Figuur 3). Figuur 4 toont de lokalisatie van de GD3 en GD2 ganglioside tegelijkertijd gekleurd geactiveerde CD4 + T-cellen. Bovendien werden geactiveerde PBMC's gekleurd met anti anti GD3 en GD2 antilichamen aantoont dat dit protocol kunnen worden gebruikt in andere immuuncel populaties in PMBCs bijzonder GD2 die bleek te zijn uitgedrukt in alle geactiveerde PMBCs (Figuur 5).
Figuur 1: Visualisatie van naïeve CD4 + T-cellen na hechting en efficiënte anti CD3 / anti-CD28 activering (A) rust CD4 + -T-cellen op 72 uur na activatie bevestigd aan poly-L-lysine behandelde dekglaasje worden geobserveerd door helderveld. microscopie. (B) Geactiveerde CD4 + -T-cellen op 72 uur bevestigd aan poly-L-lysine behandelde dekglaasje. (C) CD25 marker expressie (rood) en Hoechst 333.258 gekleurd kernen (blauw) van de anti CD3 / anti-CD28 geactiveerde CD4 + T-cellen op 72 uur na activering. Schaal bar = 50 micrometer. Beelden werden verkregen door confocale microscopie met een 60X S / 1.3 olie objectief met 2x digitale zoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: GD3 ganglioside en TCR vlekken en microscopie lokalisatie in rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen op 72 uur na activatie Rustende CD4 + T-cellen met (A) kernen gekleurd met Hoechst 333.258, (B) GD3 ganglioside lokalisatie, (. C) samenvoegen van de kernen en GD3 ganglioside. Geactiveerde CD4 + T-cellen met (D) kernen gekleurd met Hoechst 333.258, (E) GD3 ganglioside lokalisatie en (F) samenvoegen van kernen en GD3 ganglioside. (G) en (H) tonen TCR en GD3 ganglioside in rustende naïeve CD4 + T-cellen. (J en K) overeenkomt met TCR en GD3 ganglioside kleuring in geactiveerde CD4 + T-cellen. Confocale beelden van TCR (rood) en GD3 ganglioside (groen) lokalisatie in rustende naïeve CD4 + T-cellen (I) enanti CD3 / CD28 geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen 72 uur na activatie (L). De GD3, TCR en kernen vlek werd bepaald door confocale microscopie van de ene stack met een 60X S / 1.3 olie objectief met 2x digitale zoom. (M) De grafiek toont de expressie van genen voor GD3 synthase bepaald door real-time PCR uitgedrukt als Fold verandering van 4 x 10 4 rust (rust) en geactiveerd (wet) naïeve CD4 + T-cellen op 72 uur na activering. De gegevens zijn de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke donoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ganglioside GD2 en TCR vlekken en microscopie lokalisatie in rustende en geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen op 72 uur na activatie. + T-cellen met (A) kernen gekleurd met Hoechst 333.258, (B) ganglioside GD2 lokalisatie, (C) samenvoegen van kernen en GD2 ganglioside. Geactiveerde CD4 + T-cellen met (D) kernen gekleurd met Hoechst 333.258, (E) ganglioside GD2 lokalisatie en (F) samenvoegen van kernen en GD2 ganglioside. (G en H) tonen TCR en GD2 ganglioside in rustende naïeve CD4 + T-cellen. (J en K) overeenkomt met TCR en GD2 ganglioside kleuring in geactiveerde CD4 + T-cellen. Confocale beelden van TCR (rood) en ganglioside GD2 (groen) lokalisatie in rustende naïeve CD4 + T-cellen (I) en anti- CD3 / CD28 geactiveerde naïeve CD4 + T-cellen 72 uur na activatie (L). De GD2, TCR en kernen vlek werd bepaald door confocale microscopie van de ene stack met een60X S / 1,3 olie objectief met 2x digitale zoom. (M) De grafiek toont de expressie van genen voor GM2 / GD2 synthase bepaald door real-time PCR uitgedrukt als Fold verandering van 4 x 10 4 rust (rust) en geactiveerd (wet) naïeve CD4 + T-cellen op 72 uur na activering. De gegevens zijn de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke donoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Double vlek met anti-GD3 en anti-GD2 antilichamen voor GD3 en GD2 gangliosiden lokalisatie (A) GD3 ganglioside geïdentificeerd R24 anti GD3 antilichaam in geactiveerde CD4 + T-cellen toont intracellulaire en membraanlokalisatie. (B) GD2 gangliosiden geïdentificeerd met 14G2een anti-GD2 antilichaam in geactiveerde CD4 + T-cellen toont alleen plasmamembraan lokalisatie. (C) Helderveld microscopie van geactiveerde CD4 + T-cellen. De GD3 en GD2 vlek werd bepaald door confocale microscopie van de ene stack met een 60X S / 1.3 olie objectief met 2x digitale zoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. GD3 en GD2 ganglioside lokalisatie in geactiveerde PBMC's (A) GD2 ganglioside werd gedetecteerd met 14G2a anti- GD2 antilichaam anti CD3 / anti CD28 72 uur post geactiveerde PBMC overlay met helderveld microscopie, (B) GD2 ganglioside expressie en (C ) GD2 ganglioside en kernen samen te voegen. (D) GD3 gangliosIde gekleurd met R24 anti GD3 antilichaam overlay met helderveld, (E) GD3 ganglioside expressie en (F) GD3 ganglioside en kernen samen te voegen. De GD3, GD2 en kernen vlek werd bepaald door confocale microscopie van de ene stack met een 60X S / 1.3 olie objectief met 2x digitale zoom. Schaal bar = 45 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocol kan worden gebruikt om gangliosiden of eiwitten te lokaliseren in celsuspensies van CD4 + T-cellen of andere immune cellen (bijvoorbeeld PMBCs, figuur 5) uitgaande van een klein aantal cellen. Door de geringe omvang van T-cellen en niet-hechtende eigenschappen, de verwerving van fluorescentie microscopische afbeeldingen leidt tot een slechte informatie of lage kwaliteit als de cellen niet correct nageleefd.
Dit protocol gecombineerd met een goede kwaliteit confocale microscopie analyse is een belangrijk voordeel boven het gebruik van technieken zoals dunnelaagchromatografie voor detectie van gangliosiden omdat het toont de ruimtelijke lokalisatie en dynamiek van gangliosiden tijdens de behandeling (bijvoorbeeld T-cel activatie), waardoor overname van biologisch relevante gegevens 11,12,13. Ook dit protocol kan de evaluatie van ganglioside expressie uitgaande van een klein aantal CD4 + T-cellen (2 x 10 4) Die nuttig is voor het optimaliseren van het aantal herhalingen of verschillende assays 6.
De zorgvuldige behandeling tijdens wast en antilichaam kleuring na hechting is cruciaal om het aantal cellen en de integriteit te behouden. Vanwege de zwakke binding van CD4 + T-cellen om het dekglaasje, is het ook zeer belangrijk om zorgvuldig toevoegen en verwijderen van oplossingen; anders wordt een vermindering van het aantal cellen en verhoogde fluorescentie vuil wordt aangetroffen. Als beoordeeld via confocale microscopie, de immunokleuring van gangliosiden verleent aanvullende informatie zoals ruimtelijk lokaliseren of co-localisatie met andere moleculen in het plasmamembraan of intracellulaire compartimenten. Subcellulaire lokalisatie vereist het gebruik van subcellulaire markers 14, 15. Bovendien moeten verse en niet vast CD4 + T cellen, bestemd voor het kleuren bij het bepalen ganglioside expressie beperkt tot het celoppervlak. Hoewel fixatie van CD4 + T cells spaart het monster gedurende ten minste 5 dagen, draagt het risico van permeabilisatie en intracellulaire kleuring.
Vanwege de structurele overeenkomst tussen gangliosiden, is het altijd wenselijk om rekening te houden met de specifieke antilichamen gebruikt. Verscheidene in de handel verkrijgbare anti-ganglioside monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt en sommige de specificiteit werd gesondeerd door ELISA TLC, enz 16,17,18.
Eerdere werken laten zien dat het mogelijk is om informatie over lokalisatie en expressie van GD3 en GD2 gangliosiden van 2 x 10 4 cellen te verkrijgen / 6 per conditie. Ook dit protocol beschrijft de mogelijkheid van het uitvoeren gen profiling experimenten van 4 x 10 4 cellen, waardoor optimalisering van zwijgen experimenten zoals die op basis van lentivirale deeltjes 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
