Summary
Wir beschreiben einen Standardantikörperfärbung Protokoll für den Einsatz in der Mikroskopie , die Membran Expression und Lokalisation von Gangliosiden in ruhenden und aktivierten humanen naiven CD4 + T - Zellen zu bestimmen. mit <40.000 Zellen sind auch Echtzeit-PCR-Experimente beschrieben, die keine zusätzlichen Low-Input-RNA-Kits erfordern.
Abstract
Die hierin beschriebenen Verfahren zur Aktivierung von naiven CD4 + T - Zellen in Suspension und deren Einhaltung in Deck für die konfokale Mikroskopie Analyse ermöglichen die räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Gangliosiden in CD4 + T - Zellaktivierung beteiligt, dass Komplement expression profiling Experimente wie Durchflusszytometrie, Western Blotting oder real-time PCR. Die Quantifizierung von Gangliosid Expression durch Durchflusscytometrie und ihre zelluläre Lokalisation durch Mikroskopie kann durch die Verwendung von anti-Gangliosid-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität erhalten werden. Dennoch beinhaltet eine angemessene Handhabung von Zellen in Suspension die Behandlung von Kulturplatten die notwendige Haftung für Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Erwerb erforderlich zu fördern. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung GD3 und GD2 Gangliosidexpression und Kolokalisation mit dem TCR bei naiven CD4 + T - Zell - Aktivierung. Auch Real-time PCR Experimente <40.000 Zellen verwendet werden für die Bestimmung des GD3 und GM2 / GD2-Synthase-Gene beschrieben, kann das Gen-Analyse-Experimente zeigen, mit einer geringen Anzahl von Zellen und ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen niedrigen Eingangs RNA Kits durchgeführt werden.
Introduction
Die CD4 + T - Zellen dirigieren , die Immunantwort durch ihre Effektorfunktionen nach Aktivierung durch Antigen - präsentierende Zellen 1. Die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die während der Aktivierung moduliert werden können Einblick in eine grundlegende Prozess der Immunfunktion. Jedoch kann die Studie von naiven CD4 + T - Zellen kompliziert sein , weil sie eine sehr kleine Population von Zellen im Blut Peripherie 2 darstellen.
Durch Fluoreszenzmikroskopie Mehrere Berichte haben die Lokalisierung verschiedener Moleküle beteiligt in CD4 + T - Zell - Aktivierung untersucht, vor allem Proteine an die Plasmamembran 3 verbunden. Die Ganglioside sind Sialinsäure Glycosphingolipide und obwohl sie in Nervenzellen intensiv untersucht worden , wo sie reichlich vorhanden, andere Zellen, wie Immunzellen sind auch ausdrücken Ganglioside mit biologisch relevanten Funktionen 4,5. Wir berichteten bereits that während der Aktivierung des menschlichen naiven CD4 + T - Zellen gibt es eine Aufregulation der α2,8 Sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 - Synthase) und die GM2 / GD2 - Synthase, dass die signifikante Oberflächen neoexpression von GD2 induzieren und die Hochregulation von GD3 Gangliosid 6. Weitere Studien von GD3, GD2 und andere Ganglioside in Immunzellen notwendig ist, ein Protein-basierte Teilansicht der Immunfunktion zu ergänzen.
Üblicherweise wird die Untersuchung von Gangliosid - Expression auf Techniken wie Dünnschichtchromatographie (TLC) 7 basiert, aber diese Technik die räumliche Lokalisierung von Gangliosiden an der Plasmamembran oder in subzellulären Kompartimenten nicht erlaubt, biologische Analyse begrenzen.
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Antikörper-vermittelte Identifizierung und Lokalisierung von GD3 und GD2 - Ganglioside in der menschlichen naiven CD4 + T - Zellen und PBMCs nach anti-CD3 / anti-CD28 - Aktivierung. Mit diesem Protokoll es is auch möglich , das Gen und molekularen Expression von Gangliosiden in einer geringen Anzahl von Zellen in Suspension mit dem Erwerb von Bildern hoher Qualität 6, unter Berücksichtigung der geringen Größe von Lymphozyten (9 & mgr; m) zu analysieren.
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Protocol
Periphere Blut von gesunden männlichen Spendern wurde mit Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung des Ausschusses für Bioethik des Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos erhalten.
1. Isolierung und Aktivierung von humanen naiven CD4 + T - Zellen
- Sammeln 2 ml peripherem Blut abgeleitet von gesunden menschlichen Spendern durch informierte Zustimmung und verdünnt mit 2 ml sterilem PBS-EDTA (1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Fügen Sie das verdünnte Blut langsam oben auf 3 ml Saccharose - Lösung mit 1,077 Dichte wie zuvor 8 beschrieben.
Hinweis: differentielle Migration während der Zentrifugation durch Unterschiede in der Dichte verursacht wird Erythrozyten verursachen vollständig und eine Schicht aus weniger dichten mononukleären Zellen sedimentieren oberhalb bilden. 2 ml von peripherem Blut etwa 0,5 x 10 6 naive CD4 + T - Zellen nach der purificati rendernauf Schritte. - Zentrifuge 30 min bei 250 × g bei 21 ° C (Verwendung Rotor für Rundbodenröhrchen mit festen Winkel von 30 mm) ohne Unterbrechung des Gradienten von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Nach der Zentrifugation kann die PBMCs eindeutig als weißer Ring beobachtet werden. Sammeln Sie die PBMCs mit einer Pipette und Transfer zum sterilen Röhrchen zum Waschen.
- Nach drei Waschungen mit PBS-EDTA - Lösung bei 250 × g für 10 min ablaufen zur Reinigung von naiven CD4 + T - Zellen. Sortierverfahren oder mehrere Arten von Reinigungs Kits sind für diesen Zweck zur Verfügung. Vorzugsweise verwenden> 1 x 10 7 PBMCs zur Reinigung.
- Reinige naive CD4 + T - Zellen durch negative Selektion mit magnetischen Kügelchen. Führen negative Selektion mit anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR und CD235a (Glycophorin A) Antikörper. Beurteilen Sie den Prozentsatz der Reinheit durch die Bestimmung CD4 + CD45RA + Zellen durch fLow-Zytometrie.
Hinweis: Optional, gehen über Nacht Inkubation von PBMCs bei 37 ° C und 5% CO 2 mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in 10 ml supplementiertem Medium monocyte Adhärenz zu fördern und weiterhin mit naiver CD4 + T - Zell - Reinigung. Die effiziente Gewinnung von naiven CD4 + T - Zellen aus peripherem Blut hängt weitgehend von dem Reinigungssystem.
- Reinige naive CD4 + T - Zellen durch negative Selektion mit magnetischen Kügelchen. Führen negative Selektion mit anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR und CD235a (Glycophorin A) Antikörper. Beurteilen Sie den Prozentsatz der Reinheit durch die Bestimmung CD4 + CD45RA + Zellen durch fLow-Zytometrie.
- Vorbereitung 24-well-Zellkulturplatten durch Zugabe von 250 & mgr; l pro Vertiefung von PBS mit 5 & mgr; g / ml anti CD3 monoklonaler Antikörper und Inkubation bei 37 ° C mindestens 2 h für.
Hinweis: Platten mit 96 Vertiefungen verwendet werden , wenn eine kleinere Anzahl von naiven CD4 + T - Zellen verwendet werden (zB 2 x10 4 -1 × 10 5). - Entfernen Sie die anti CD3-Antikörper Verdünnung aus dem 24-Loch-oder 96-Well-Platten und waschen Sie die Platten zweimal mit sterilen 1x PBS.
- Verdünnen der naiven CD4 + T - Zellen mit> 95% Reinheit (CD4 +CD45RA +) auf eine Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in advanced RPMI 1640 - Medium mit 3% fötalem Rinderserum (oder RPMI mit 10% Serum ergänzt), 2 mM Glutamin und Antibiotika (1 U / ml Penicillin, 1 & mgr; g / ml Streptomycin).
Hinweis: Wenn Gangliosid Lokalisierung in PBMCs erforderlich ist, folgen dem gleichen Protokoll zur Verdünnung und Stimulation wie unten beschrieben. - In 500 ul der Zellverdünnung zu anti CD3-beschichteten Vertiefungen und auf nicht-beschichteten Vertiefungen (Kontrollzellen) in der 24-Well-Platte. Alternativ dazu werden 100 ul der Zellverdünnung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen.
- Füllen Sie die Stimulationsbedingungen von naiven CD4 + T - Zellen in anti CD3 - beschichteten Vertiefungen durch Zugabe von 1 & mgr; g / ml anti - CD28 - Antikörper.
- Halten die ruhenden CD4 + T - Zellen als Kontrolle in den nicht-beschichteten Vertiefungen ohne Zusatz von anti CD28 Antikörper. Inkubieren Sie die ruhenden und aktivierten CD4 + T - Zellen für 0-72 h unter Standardbedingungen von 37 °C und 5% CO 2.
- Um zu überprüfen , eine ausreichende Aktivierung zu bewerten durch Durchflusszytometrie der Expression des CD69 frühen Aktivierungsmarker (16 Stunden nach der Aktivierung) oder CD25 späten Aktivierungsmarkers (48 Stunden nach der Aktivierung) in ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T bei 37 ° C inkubierten Zellen und 5% CO 2 in Abwesenheit oder Anwesenheit von anti CD3 / CD28 - Antikörper 9,10.
2. Die Einhaltung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen
- Sterilisieren 12 mm runden Deckgläsern durch Autoklavierung und UV-Lichtexposition für mindestens 15 min.
- Platz Deck in sterile 24-Well-Zellkulturplatten.
Hinweis: Bei Kulturen , die mit weniger als 1 x 10 5 Zellen es bevorzugt ist , mit angepaßten kleinen Vertiefungen slide Kammern zu verwenden Dispersion von Zellen in dem Deckglas zu verhindern. - Coat Deckgläser (oder Gleitkammer) mit 200 & mgr; l Poly-L-Lysin (MG 150-300 KDa) 0,1% (w / v) Lösung und Inkubation für 5 min bei room Temperatur (RT), zu entfernen und trocken für mindestens 1 Stunde bei RT.
- Vorsichtig mischen und sammeln Sie die ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen aus den 24-Well - Platten. Zählen Sie die Zellen und bei Bedarf anpassen mit frischem ergänzten Medium zu übertragen , 1 x 10 5 Zellen auf die Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser. Inkubieren der Zellen für mindestens 6 Stunden bei 37 o C und 5% CO 2.
3. Sammeln und Fixierung von ruhenden und aktivierten Naïve CD4 + T - Zellen
- Das Medium von kultivierten ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen vorsichtig entfernen.
- In 500 ul RT sterilem PBS langsam.
Hinweis: vorsichtige Zugabe und Entnahme von Lösungen aus den Vertiefungen verhindert, dass die Ablösung von Zellen aus dem Deckglas. - Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie eine weitere 500 ul PBS gründlich Kulturmedien entfernen.
- Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 & mgr; l filtrierte 4% Paraformaldehyd (filtRation entfernt Mikropartikel, die mit Mikroskopie-Analyse) und Inkubation für 30 min bei RT (bevorzugt) oder über Nacht bei 4 ° C stören können.
Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige und flüchtige Verbindung. Es ist bekannt, ein menschliches Karzinogen zu sein. Verwenden Sie sorgfältig mit einem geeigneten Sicherheitsprotokoll. - Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen mindestens zweimal mit PBS bei RT.
- Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder halten die Plattenvertiefungen mit 500 ul PBS bei 4 ° C für mehrere Tage, bis Färbung.
Hinweis: Sterility während dieses Prozesses hilft das Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden.
4. Die Färbung, Montage und Visualisierung durch konfokale Mikroskopie
- Entfernen Sie die PBS aus den Vertiefungen. Hinzufügen 500 ul kaltem Blockierungspuffer (1x PBS, 0,5% Standardqualität Rinderserumalbumin, 1% fötalem Rinderserum, pH 7,4). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis.
- Entfernen Sie den Blockierungspuffer sorgfältig und fügen Sie die primären Antikörper (anti Ganglioside GD3 Klon R24, GD2 Klon 14G2a),PE-konjugiertem anti CD25 und APC-konjugiertem anti-TCR und Isotypen in Blockierungspuffer auf 2,5 & mgr; g / ml verdünnt Kontrollen.
- Inkubiere 2 h auf Eis oder über Nacht bei 4 ° C.
Hinweis: Langsam orbitale Bewegung bevorzugt. - Entfernen Sie den Antikörper vorsichtig und langsam mit 500 ul PBS. Zweimal wiederholen.
- Fügen Sie die sekundären Antikörper (FITC konjugiertem anti IgG3 für R24 anti GD3, Alexa Fluor 488 konjugiert oder Alexa Fluor 647-konjugiertem anti IgG2a für 14G2a anti GD2) verdünnt Puffer auf 0,1 & mgr; g / ml in Blocking.
- Inkubieren für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln ohne Schütteln.
- Waschen dreimal in PBS wie in 4.4) beschrieben. Halten Sie die Vertiefungen mit PBS genug, die Entwässerung von Proben zu vermeiden.
- Hinzufügen Hoechst 333.258 stain verdünnt in PBS auf 0,1 & mgr; g / ml.
- Inkubiere 15 min bei RT und zu entfernen. Waschen dreimal in PBS.
- Legen Sie die Folien auf einem Papiertuch und fügen Sie 20 ul Befestigungslösung (50% Glycerin in PBS) oder kommerzielle Montagelösungs zu vermeiden, Fading und Abschrecken von Proben.
- holen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer feinen Pinzette und legen Sie es auf die Montagelösung. Sicherzustellen, dass die Seite der Deck wo Zellen gebunden sind in Kontakt mit der Lösung ist. Verschließen Sie die Deckgläser mit Nagellack und analysieren Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
5. Isolierung von RNA
- Bereiten anti CD3-Antikörper (5 ug / ml) beschichtete 96-Well-Platten. Inkubieren 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen / Vertiefung in 100 ul Kulturmedium , supplementiert mit anti CD28 - Antikörper (1 ug / ml) , um den Stimulus zu vervollständigen. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 0-72 Stunden.
- Nach verschiedenen Post-Aktivierungszeiten setzen die Zellen in einem Reaktionsgefäß.
- Hinzufügen 500 ul PBS und Zentrifugation bei 250 xg für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und 1ml Trizolreagenz.
- Inkubieren für 5 min bei RT und halten Sie die Probe bei -8076; C für mindestens 24 Std. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wenn nötig.
Hinweis: Verlassen der Probe bei -80 ° C für mindestens 24 Stunden verbessert RNA-Ausbeute. Verwendung von Handschuhen Auch ist wichtig, RNA-Abbau durch RNasen zu vermeiden. - Abzutauen die Probe durch Inkubation bei 37 ° C für 2 min in einem Wasserbad.
- In 200 ul Chloroform und kräftig mit der Hand für 30 Sekunden (gegen aggressive Mischung von RNA vermeiden durch Vortexen). Inkubiere 5 min bei RT.
- Zentrifuge 15 min bei 12000 × g bei 4 ° C.
- Wiederherstellen der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- In 500 ul Isopropanol und wird das Röhrchen dreimal.
- Inkubiere 10 min bei RT und zentrifugieren für 10 min bei 12.000 × g bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen durch Umdrehen.
- 1 ml eiskaltem 75% Ethanol und Zentrifuge 10 min bei 12000 × g bei 4 ° C.
- Vollständig den Überstand verwerfen und öffnen, indem man den Deckel des Rohres das RNA-Pellet trocknen.
Nichte: An diesem Punkt ist das Pellet nicht deutlich sichtbar. Fahre dennoch fort. - Das Pellet in 20 ul UPW Wasser. Berechnen der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren durch Messen der 260 nm und 280 nm Extinktion unter Verwendung von Nanodrop.
- Gehen Sie sorgfältig, um die Synthese von cDNA mit einer herkömmlichen Reverse-Transkriptase-Kit und nach dem Herstellerprotokoll.
Anmerkung: Ungefähr 0,5-2 & mgr; g RNA wird erhalten aus 4 x 10 4 naiven CD4 + T - Zellen. cDNA kann von 100 ng RNA verwendet, und in Echtzeit-PCR-Reaktionen, ohne die Notwendigkeit für niedrige Eingangs RNA Kits synthetisiert werden.
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Representative Results
Das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben macht eine gute Qualität der gezüchteten und eingehalten ruhenden und aktivierten menschlichen naiven CD4 + T - Zellen (Abbildung 1). Die aktivierten CD4 + T - Zellen zeigen die charakteristischen proliferative Profil (1B) im Vergleich zu dem Ruhezustand (1A). Der CD25 späten Aktivierungsmarker ist nützlich , um die effiziente Aktivierung bei 72 h durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1C) beobachtet zu bewerten. Der CD69-Marker wird derzeit als frühe Aktivierungsmarker mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Anhaften von ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen zu einem Deckglas mit Poly-L-Lysin beschichtet sind nützlich , um die Expression und Lokalisierung von GD3 und TCR durch eine doppelte Markierung zeigte studieren mit anti GD3 und anti - TCR - Antikörper (Abbildung 2). Wie wir bereits berichtet, wird die Aktivierung durch umbauen begleiteting von GD3 und GD2 - Ganglioside in den Zellen der Oberfläche 6. Zusätzlich Genexpression Quantifizierung der GD3 und GM2 / GD2 Synthasen von 4 x 10 4 Zellen durchgeführt (Figuren 2 und 3). Die neo-Expression des GD2 - Gangliosid und TCR Kolokalisation durch konfokale Mikroskopie, was zeigt eine mögliche Rolle von GD2 in TCR clustering während der Aktivierung (Abbildung 3). Figur 4 zeigt die Lokalisation des GD3 und GD2 - Gangliosid gefärbt gleichzeitig in aktivierten CD4 ausreichend beobachtet + T - Zellen. Zusätzlich wurden aktivierte PBMCs mit anti GD3 GD2 und Anti - Antikörpern gefärbt zeigt , dass dieses Protokoll kann GD2 in PMBCs, insbesondere gefunden in anderen Immunzellpopulationen verwendet werden , die in allen aktivierten PMBCs exprimiert werden (Abbildung 5) gefunden wurde.
Abbildung 1: Visualisierung von naiven CD4 + T - Zellen nach Einhaltung und effiziente anti CD3 / anti-CD28 - Aktivierung (A) ruhenden CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung auf Poly-L-Lysin behandelt Deckglas befestigt durch Hell- beobachtet werden. Mikroskopie. (B) Aktivierte CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden angebracht auf poly-L-Lysin - behandelten Deckgläschen. (C) CD25 Marker Ausdruck (rot) und Hoechst 333.258 gefärbten Zellkernen (blau) von anti CD3 / anti - CD28 aktivierten CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bilder mittels konfokaler Mikroskopie wurden mit einem 60X S / 1.3 Öl - Objektiv mit 2X Digitalzoom. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: GD3 - Gangliosid und TCR - Färbung und Mikroskopie Lokalisation in ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung Resting CD4 + T - Zellen mit (A) Kerne gefärbt mit Hoechst 333.258, (B) GD3 Gangliosid Lokalisierung, (. C) Zusammenführen von Kernen und GD3 Gangliosid. Aktivierten CD4 + T - Zellen mit (D) Kerne gefärbt mit Hoechst 333.258, (E) GD3 Gangliosid Lokalisierung und (F) Merge von Kernen und GD3 Gangliosid. (G) und (H) zeigen TCR und GD3 Gangliosid naiven CD4 + T - Zellen in ruht. (J und K) entspricht TCR und GD3 Gangliosid - Färbung in aktivierten CD4 + T - Zellen. Konfokale Bilder von TCR (rot) und GD3 Gangliosid (grün) Lokalisation in ruhenden naiven CD4 + T - Zellen (I) undanti CD3 / CD28 Activated naive CD4 + T - Zellen 72 Stunden nach der Aktivierung (L). Die GD3, TCR und Kerne Fleck wurde durch konfokale Mikroskopie von einem Stapel mit einem 60X S / 1.3 Öl-Objektiv mit 2X Digitalzoom bewertet. (M) Die Grafik zeigt die Genexpression für GD3 - Synthase durch Echtzeit - PCR bestimmt , wie Falten Änderung ausgedrückt von 4 x 10 4 ruht (Rest) und aktiviert (Act) naive CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung. Die Daten sind der Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Gebern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: GD2 - Gangliosid und TCR - Färbung und Mikroskopie Lokalisation in ruhenden und aktivierten naiven CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung. + T - Zellen mit (A) Kerne gefärbt mit Hoechst 333.258, (B) GD2 Gangliosid Lokalisation, (C) Zusammenführen von Kernen und GD2 Gangliosid. Aktivierten CD4 + T - Zellen mit (D) Kerne gefärbt mit Hoechst 333.258, (E) GD2 Gangliosid Lokalisierung und (F) Merge von Kernen und GD2 Gangliosid. (G und H) zeigen TCR und GD2 Gangliosid naiven CD4 + T - Zellen in ruht. (J und K) entspricht TCR und GD2 - Gangliosid - Färbung in aktivierten CD4 + T - Zellen. Die konfokale Bilder von TCR (rot) und GD2 Gangliosid (grün) Lokalisation in naiven CD4 + T - Zellen ruhend (I) und anti CD3 / CD28 aktivierte naive CD4 + T - Zellen 72 Stunden nach der Aktivierung (L). Die GD2, TCR und Kerne Fleck wurde durch konfokale Mikroskopie von einem Stapel mit einem beurteilt60X S / 1.3 Öl-Objektiv mit 2X Digitalzoom. (M) Die Grafik zeigt die Genexpression für GM2 / GD2 - Synthase durch Echtzeit bestimmt PCR als mehrfache Änderung ausgedrückt von 4 x 10 4 ruht (Rest) und aktiviert (Act) naive CD4 + T - Zellen bei 72 Stunden nach der Aktivierung. Die Daten sind der Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Gebern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Doppel Fleck mit anti-GD3 und anti-GD2 - Antikörper für GD3 und GD2 - Ganglioside Lokalisierung (A) GD3 Gangliosid identifiziert mit R24 anti GD3 - Antikörper in aktivierten CD4 + T - Zellen zeigt die intrazelluläre und membran Lokalisierung. (B) GD2 Gangliosid mit 14G2 identifiziertein anti GD2 - Antikörper in aktivierten CD4 + T - Zellen zeigt nur Plasmamembranlokalisierung. (C) Hellfeldmikroskopie von aktivierten CD4 + T - Zellen. Die GD3 und GD2 Fleck durch konfokale Mikroskopie von einem Stapel mit einem 60X S / 1.3 Öl - Objektiv mit 2X Digitalzoom. Wurde bewertet Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 5: GD3 und GD2 - Gangliosid - Lokalisierung in aktivierten PBMCs (A) GD2 - Gangliosid wurde mit 14G2a anti GD2 - Antikörper in anti CD3 / anti - CD28 72 Stunden post-aktivierte PBMCs overlay mit Hellfeldmikroskopie, (B) GD2 - Gangliosid - Expression und (C detektiert ) GD2 Gangliosid und Kerne verschmelzen. (D) GD3 gangliosmit R24 anti GD3 Antikörper Overlay gefärbt Ide mit Hell-, (E) GD3 Gangliosidexpression und (F) GD3 - Gangliosid und Kerne verschmelzen. Die GD3, GD2 und Kerne Fleck wurde durch konfokale Mikroskopie von einem Stapel mit einem 60X S / 1.3 Öl-Objektiv mit 2X Digitalzoom bewertet. Maßstabsbalken = 45 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden , Ganglioside oder Proteine in Zellsuspensionen von CD4 + T - Zellen oder andere Immunzellen (zB PMBCs, 5) aus einer kleinen Anzahl von Zellen ausgehend zu lokalisieren. Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen und nicht-haftenden Eigenschaften, den Erwerb von fluoreszenzmikroskopische Bilder führt zu einer schlechten Informationen oder niedriger Qualität, wenn die Zellen nicht richtig eingehalten werden.
Dieses Protokoll mit einer guten Qualität der konfokalen Mikroskopie - Analyse kombiniert ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber der Verwendung von Techniken wie Dünnschichtchromatographie zum Nachweis von Gangliosiden , da es die räumliche Lokalisierung und Dynamik von Gangliosiden bei der Behandlung (beispielsweise T - Zell - Aktivierung) offenbart, was zu Erwerb von biologisch relevanten Daten 11,12,13. Außerdem ermöglicht dieses Protokoll die Auswertung der Gangliosid - Expression aus einer kleinen Anzahl von CD4 + T - Zellen beginnen (2 x 10 & sup4 ;Das) ist nützlich für die Optimierung der Anzahl der Wiederholungen oder verschiedene Assays 6.
Die sorgfältige Behandlung während der Waschungen und Antikörper-Färbung nach Adhäsion ist entscheidend, Zellzahl und Integrität zu erhalten. Aufgrund der schwachen Bindung von CD4 + T - Zellen auf dem Deckglas, ist es auch sehr wichtig, sorgfältig Hinzufügen und Entfernen von Lösungen; andernfalls eine Reduzierung der Zellzahl und erhöhte Fluoreszenz Debris wird auftreten. Wenn durch konfokale Mikroskopie beurteilt verleiht die Immunfärbung von Gangliosiden zusätzliche Informationen wie räumliche Lokalisierung oder Co-Lokalisierung mit anderen Molekülen in der Plasmamembran oder intrazelluläre Kompartimente. Subzelluläre Lokalisation erfordert die Verwendung von subzellulären Marker 14, 15. Zusätzlich frisch und nicht fixiert benötigen CD4 + T - Zellen für die Färbung verwendet wird , wenn Gangliosid Expression auf die Zelloberfläche beschränkt zu bestimmen. Obwohl Fixierung von CD4 + T cells hilft, die Probe für mindestens 5 Tage zu bewahren, sie trägt das Risiko einer Permeabilisierung und intrazelluläre Färbung.
Jedoch wegen der strukturellen Ähnlichkeit zwischen Gangliosiden, ist es immer ratsam, zu berücksichtigen, die Spezifität von Antikörpern verwendet zu nehmen. Einige der im Handel erhältlichen anti-Gangliosid - monoklonalen Antikörper können und für einige von ihnen verwendet werden , ist die Spezifität durch ELISA, TLC usw. 16,17,18 sondiert wurde.
Vorherige Arbeiten zeigen , dass es möglich ist , von 2 x 10 4 Zellen / pro Bedingung 6 Informationen über die Lokalisierung und Expression von GD3 und GD2 Gangliosiden zu erhalten. Außerdem beschreibt dieses Protokoll , um die Fähigkeit zur Durchführung Gen Profilierungs Experimente von 4 x 10 4 Zellen, die eine Optimierung von Experimenten , wie beispielsweise solche auf der Basis in lentivirale Partikel 6 silencing.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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