Summary
Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando <40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.
Abstract
Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 + no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 +, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 +. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando <40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.
Introduction
Las células T CD4 + orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno 1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 + vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre 2.
A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activación de células T CD4 +, principalmente proteínas asociadas a la membrana plasmática 3. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y aunque han sido ampliamente estudiados en las células nerviosas en el que son abundantes, otras células tales como las células inmunes también expresan gangliósidos con biológicamente funciones relevantes 4,5. Hemos informado anteriormente de that durante la activación de las células T CD4 + vírgenes humanos hay una regulación por incremento de la α2,8 sialiltransferasa ST8Sia 1 (GD3 sintasa) y la sintasa GM2 / GD2, que inducen la neoexpression superficie significativa de GD2 y la regulación al alza de GD3 gangliósido 6. El estudio adicional de GD3, GD2 y otros gangliósidos en células inmunes, es necesario complementar una vista parcial a base de proteínas de la función inmune.
Comúnmente, el estudio de la expresión de gangliósidos se basa en técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) 7, pero esta técnica no permite la localización espacial de los gangliósidos en la membrana plasmática o en compartimentos subcelulares, limitando el análisis biológico.
En este trabajo, se describe un protocolo para la identificación mediada por anticuerpos y localización de GD3 y GD2 gangliósidos en células T CD4 + vírgenes humanos y PBMCs después de la activación anti-CD28 anti-CD3 /. Con este protocolo se iTambién es posible analizar el gen y la expresión molecular de gangliósidos en un bajo número de células en suspensión, con la adquisición de imágenes de alta calidad 6, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los linfocitos (9 m).
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Protocol
La sangre periférica de donantes varones sanos se obtuvo con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Bioética del Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
1. Aislamiento y activación de T humanas indiferenciadas CD4 + células
- Recoger 2 ml de sangre periférica derivadas de donantes humanos sanos mediante el consentimiento informado y se diluye con 2 ml de PBS estéril-EDTA (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Añadir la sangre diluida lentamente en la parte superior de 3 ml de solución de sacarosa con 1,077 de densidad como se describe anteriormente 8.
Nota: La migración diferencial durante la centrifugación causado por diferencias en la densidad hará que los eritrocitos sedimentan a completamente y una capa de células mononucleares menos densos formará anteriormente. 2 ml de sangre periférica se rinden aproximadamente 0,5 x 10 6 células T CD4 + vírgenes después de la Purificatisobre las medidas. - Centrifugar 30 minutos a 250 xg en 21 ° C (uso rotor para tubos de fondo redondo con ángulo fijo de 30 mm) sin interrupción para generar el gradiente de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Después de la centrifugación, el PBMC se puede observar claramente como un anillo blanco. Recoger las PBMCs con una pipeta y transferir al tubo estéril para el lavado.
- Después de tres lavados con solución de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min proceder a la purificación de células T CD4 + vírgenes. métodos de selección o varios tipos de kits de purificación están disponibles para este propósito. Preferiblemente, utilice> 1 x 10 7 PBMCs para la purificación.
- Purificar las células T CD4 + no tratados previamente por selección negativa con perlas magnéticas. Realizar la selección negativa con anticuerpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, y CD235a (glicoforina A). Evaluar el porcentaje de pureza mediante la determinación de células CD45RA + CD4 + a través de fcitometría de baja.
Nota: Opcionalmente, se procede a la incubación de las PBMC durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 con una densidad de 1 x 10 6 células / ml en 10 ml de medio suplementado para promover la adhesión de los monocitos y continuar con la purificación ingenuo células T CD4 +. La recuperación eficiente de las células T CD4 + vírgenes de sangre periférica depende en gran medida del sistema de purificación.
- Purificar las células T CD4 + no tratados previamente por selección negativa con perlas magnéticas. Realizar la selección negativa con anticuerpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, y CD235a (glicoforina A). Evaluar el porcentaje de pureza mediante la determinación de células CD45RA + CD4 + a través de fcitometría de baja.
- Preparar placas de cultivo celular de 24 pocillos mediante la adición de 250 l por pocillo de PBS con anticuerpo 5 mg / ml de anti CD3 monoclonal y se incuba durante al menos 2 horas a 37 ° C.
Nota: Las placas con 96 pocillos se pueden utilizar cuando se utiliza un número más pequeño de células T CD4 + no tratados previamente (por ejemplo, 2 x 10 4 -1 x 10 5). - Retire la dilución de anticuerpo anti CD3 desde el 24 de pozo o placas de 96 pocillos y se lavan las placas dos veces con PBS estéril 1x.
- Diluir las células T CD4 + no tratados previamente con> 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a una densidad de 1 x 10 6 células / ml en avanzado 1640 medio RPMI suplementado con 3% de suero bovino fetal (o RPMI suplementado con 10% de suero), glutamina 2 mM y antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 g / ml de estreptomicina).
Nota: Si se requiere la localización de gangliósidos en PBMCs, siguen el mismo protocolo para la dilución y estimulación como se describe a continuación. - Añadir 500 l de la dilución de células a pocillos recubiertos anti-CD3 y a los pozos no recubiertos (células de control) en la placa de 24 pocillos. Alternativamente, añadir 100 l de la dilución de células a los pocillos de la placa de 96 pocillos.
- Completar las condiciones de estimulación de células T CD4 + vírgenes en los pozos de anti-CD3 recubiertos mediante la adición de 1 mg / ml de anticuerpo anti CD28.
- Mantener las células T CD4 + en reposo como el control en los pocillos no revestidos sin la adición de anticuerpos anti CD28. Incubar el reposo y activadas de células T CD4 + durante 0 a 72 horas en condiciones estándar de 37 °C y 5% de CO 2.
- Para verificar una activación adecuada evaluar mediante citometría de flujo la expresión del marcador de activación temprana CD69 (16 horas después de la activación) o CD25 marcador de activación tardía (48 horas después de la activación) en reposo y activadas las células T CD4 + vírgenes se incubaron a 37 ° C y 5% de CO 2 en ausencia o presencia de anticuerpos anti CD3 / CD28 9,10.
2. La adhesión de reposo y activadas las células T naive CD4 +
- Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos en autoclave y exposición a la luz UV durante al menos 15 minutos.
- Coloque los cubreobjetos en placas de cultivo celular de 24 pocillos estériles.
Nota: Para los cultivos con células de menos de 1 x 10 5, es preferible utilizar cámaras de diapositivas con pozos pequeños adaptados para evitar la dispersión de células en cubreobjetos. - cubreobjetos de la capa (o cámara de diapositivas) con 200 l de poli-L-lisina (MW 150 a 300 KDa) 0,1% (w / v) de la solución y se incuba durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar y secar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente.
- Mezclar con cuidado y recoger el reposo y las células T CD4 + activadas ingenuas de las placas de 24 pocillos. Contar las células y, si es necesario, ajustar con medio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Se incuban las células durante un mínimo de 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
3. La recolección y fijación de reposo y activadas Naïve células T CD4 +
- Retirar con cuidado el medio de reposo y se cultivaron las células T CD4 + activadas ingenuos.
- Añadir 500 l de PBS estéril RT lentamente.
Nota: Además cuidadosa y la eliminación de soluciones de los pozos impide el desprendimiento de células del cubreobjetos. - Desechar el PBS y añadir otros 500 l de PBS para eliminar completamente los medios de cultivo.
- Fijar las células mediante la adición de 500 l filtrada paraformaldehído al 4% (filtración elimina micropartículas que pueden interferir con el análisis de microscopía) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (preferido) o durante la noche a 4 ° C.
Precaución: El paraformaldehido es un compuesto tóxico y volátil. Se sabe que es un carcinógeno humano. Utilice con cuidado con un protocolo de seguridad adecuado. - Retire el fijador y lavar al menos dos veces con PBS a temperatura ambiente.
- Proceder al siguiente paso o mantener los pozos de la placa con 500 l de PBS a 4 ° C durante varios días hasta que las manchas.
Nota: La esterilidad durante este proceso ayuda a evitar el crecimiento de microorganismos.
4. La tinción, montaje y visualización mediante microscopía confocal
- Retire el PBS de los pozos. Añadir 500 l de tampón de bloqueo frío (1x PBS, 0,5% de grado estándar de albúmina de suero bovino, 1% de suero fetal bovino pH 7,4). Incubar durante 20 minutos en hielo.
- Retire el amortiguador de bloqueo y añadir con cuidado los anticuerpos primarios (anti gangliósidos GD3 R24 clon, clon GD2 14G2a),PE-conjugado anti CD25 y APC-conjugado anti TCR e isotipos controles diluidos en tampón de bloqueo a 2,5 g / ml.
- Incubar 2 horas en el hielo o la noche a 4 ° C.
Nota: agitación orbital lenta es preferible. - Retire el anticuerpo con cuidado y lentamente añadir 500 l de PBS. Repetir dos veces.
- Añadir los anticuerpos secundarios (FITC conjugado anti IgG3 para R24 contra GD3, Alexa Fluor 488-conjugado o Alexa Fluor 647-conjugado anti IgG2a para 14G2a contra GD2) diluido en tampón de bloqueo a 0,1 g / ml.
- Incubar durante 1 hora en hielo en la oscuridad sin agitación.
- Lavar tres veces en PBS como se describe en 4.4). Mantener los pocillos con PBS suficiente para evitar la deshidratación de las muestras.
- Añadir Hoechst 333258 mancha diluido en PBS a 0,1 g / ml.
- Incubar 15 minutos a temperatura ambiente y quitar. Lavar tres veces en PBS.
- Colocar los portaobjetos en una toalla de papel y añadir 20 l de solución de montaje (50% de glicerol en PBS) o solución de montaje comercials para evitar la decoloración y el enfriamiento rápido de las muestras.
- Recoja cuidadosamente el cubreobjetos con unas pinzas finas y colocarlo en la solución de montaje. Asegúrese de que el lado del cubreobjetos donde se unen las células está en contacto con la solución. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y analizar mediante fluorescencia o microscopía confocal.
5. Aislamiento de ARN
- Preparar anticuerpo anti CD3 (5 mg / ml) recubiertas placas de 96 pocillos. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes / pocillo en 100 l de medio de cultivo suplementado con el anticuerpo CD28 contra (1 mg / ml) para completar el estímulo. Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 0-72 hr.
- Después de diferentes tiempos post-activación colocar las células en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 500 l de PBS y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de reactivo Trizol.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mantener la muestra a -8076; C durante al menos 24 h. Proceder con el aislamiento de ARN cuando sea necesario.
Nota: Dejar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 horas mejora el rendimiento de ARN. Además, el uso de guantes de la mano es esencial para evitar la degradación del ARN por RNasas. - Descongelar la muestra de incubación a 37 ° C durante 2 min en un baño de agua.
- Añadir 200 l de cloroformo y agitar con fuerza a mano durante 30 segundos (para evitar la mezcla agresiva de ARN mediante agitación). Incubar 5 min a TA.
- Centrifugar 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
- Recuperar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Añadir 500 l de isopropanol y se invierte el tubo tres veces.
- Incubar 10 min a RT y se centrifuga durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante por inversión.
- Añadir 1 ml de hielo frío de etanol 75% y se centrifuga 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
- Completamente descartar el sobrenadante y secar el pellet de ARN dejando el tapón del tubo abierto.
Noe: En este punto el pellet no es claramente visible. Procede de todas maneras. - Resuspender el precipitado en 20 l de agua de grado molecular. Calcular la concentración y pureza de los ácidos nucleicos mediante la medición de la absorbancia 260 nm y 280 nm usando NanoDrop.
- Proceder con cuidado para la síntesis de ADNc mediante el uso de cualquier kit de transcriptasa inversa convencional y siguiendo el protocolo del fabricante.
Nota: Aproximadamente 0,5 a 2 g de ARN se obtiene a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes. cDNA puede ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN y se utiliza en tiempo real, las reacciones de PCR sin la necesidad de kits de entrada baja de ARN.
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Representative Results
El protocolo descrito en este manuscrito hace que una buena calidad de culto y de descanso adherido y las células T CD4 + vírgenes humanos activados (Figura 1). Las células T CD4 + activadas muestran el perfil proliferativa característica (Figura 1B) en comparación con la condición de reposo (Figura 1A). El marcador de activación CD25 tarde es útil para evaluar la activación eficiente en 72 hr observada por microscopía confocal (Figura 1C). El marcador CD69 se utiliza actualmente como marcador de activación temprana mediante citometría de flujo o microscopía. La adhesión de reposo y las células T CD4 + no tratados previamente activados a un cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina son útiles para estudiar la expresión y localización de GD3 y TCR mostró por un doble marcaje con anticuerpos anti TCR contra (Figura 2) y GD3. Como se informó anteriormente, la activación se acompaña de remodelaciónING de GD3 y GD2 gangliósidos en las células superficiales 6. Además, la cuantificación de la expresión génica de las sintasas de GD3 y GM2 / GD2 se realiza a partir de 4 x 10 4 células (Figuras 2 y 3). La neo-expresión del gangliósido GD2 y colocalización TCR se observa adecuadamente por microscopía confocal, lo que demuestra un posible papel de GD2 en TCR agrupación durante la activación (figura 3). Figura 4 muestra la localización del gangliósido GD3 y GD2 manchado simultáneamente en CD4 activado + células T. Además, PBMCs activadas fueron teñidas con anti anticuerpos anti GD2 que muestran que este protocolo se puede utilizar en otras poblaciones de células inmunes que se encuentran en PMBCs, particularmente GD2 que se encontró que se expresa en todos los PMBCs activados (Figura 5) y GD3.
Figura 1: Visualización de células T CD4 + vírgenes después de la adhesión y eficiente contra la activación de CD3 / anti-CD28 (A) las células T en reposo CD4 + en 72 horas después de la activación adjunto sobre tratada de poli-L-lisina cubreobjetos se observan por campo claro. microscopía. (B) Activado células T CD4 + a 72 hr adjunto sobre tratada de poli-L-lisina cubreobjetos. (C) la expresión del marcador CD25 (rojo) y Hoechst 333258 núcleos teñidos (azul) de las células anti-CD3 / anti CD28 activados T CD4 + a las 72 horas después de la activación. Barra de escala = 50 micras. Las imágenes fueron obtenidas por microscopía confocal con un objetivo de aceite 60X S / 1.3 y un zoom digital de 2X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: gangliósido GD3 y mancha TCR y microscopía de localización en reposo y activadas las células T CD4 + vírgenes a las 72 h post-activación de células T en reposo CD4 + con núcleos (A) se tiñeron con Hoechst 333258, (B) GD3 localización gangliósido, (. C) Combinar de núcleos y gangliósido GD3. Células T CD4 + activadas con núcleos (D) se tiñeron con Hoechst 333258, (E) GD3 localización gangliósido y (F) fusión de los núcleos y el gangliósido GD3. (G) y (H) muestran TCR y gangliósidos GD3 en células T en reposo CD4 + vírgenes. (J y K) corresponde a TCR y GD3 tinción gangliósido en las células T CD4 + activadas. Las imágenes confocales de TCR (rojo) y el gangliósido localización (verde) GD3 en células en reposo naïve T CD4 + (I) yanti-CD3 / CD28 activado las células T CD4 + no tratados previamente 72 horas después de la activación (L). El GD3, TCR y núcleos de tinción se evaluó mediante microscopía confocal de una pila con una 60X S / 1.3 petróleo objetivo con zoom digital de 2X. (H) El gráfico muestra la expresión génica de GD3 sintasa determinada por PCR en tiempo real se expresó como cambio veces a partir de 4 x 10 4 reposo (descanso) y las células activado (TCA) naive T CD4 + a las 72 horas después de la activación. Los datos son la media ± SD de tres donantes independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: gangliósido GD2 y mancha TCR y localización microscopía en reposo y células T CD4 + no tratados previamente activadas a las 72 h post-activación. + con núcleos (A) se tiñeron con Hoechst 333258, (B) GD2 gangliósido localización, (C) fusión de los núcleos y el gangliósido GD2. Células T CD4 + activadas con núcleos (D) se tiñeron con Hoechst 333258, (E) GD2 localización gangliósido y (F) fusión de los núcleos y el gangliósido GD2. (G y H) muestran TCR y gangliósido GD2 en células T en reposo CD4 + vírgenes. (J y K) corresponde a TCR y GD2 tinción gangliósido en las células T CD4 + activadas. Confocal de imágenes de TCR (rojo) y el gangliósido GD2 localización (verde) en las células en reposo ingenuos T CD4 + (I) y anti-CD3 / CD28 Activado células T CD4 + vírgenes 72 horas después de la activación (L). La mancha GD2, TCR y los núcleos se evaluó por microscopía confocal de una pila con una60X S / 1.3 petróleo objetivo con zoom digital de 2X. (H) El gráfico muestra la expresión génica de GM2 / GD2 sintasa determinada por PCR en tiempo real se expresó como cambio veces a partir de 4 x 10 4 reposo (descanso) y las células activado (TCA) naive T CD4 + a las 72 horas después de la activación. Los datos son la media ± SD de tres donantes independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Mancha doble con anticuerpos anti-GD2 para GD3 y GD2 gangliósidos localización anti-GD3 y gangliósido (A) GD3 identificado con el anticuerpo R24 contra GD3 en las células T CD4 + activadas muestra intracelular y la membrana de localización. (B) GD2 gangliósido identificado con 14G2un anticuerpo anti GD2 en las células T CD4 + activadas sólo muestra la localización de membrana de plasma. (C) la microscopía de campo claro a partir de células T CD4 + activadas. La mancha GD3 y GD2 se evaluó mediante microscopía confocal de una pila con un objetivo de aceite 60X S / 1.3 y un zoom digital de 2X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. GD3 y GD2 gangliósido localización en PBMCs activados (A) GD2 gangliósido se detectó con anticuerpo 14G2a contra GD2 en contra CD28 72 hr superposición CD3 / anti post-activado PBMCs con campo claro microscopía, (B) expresión de gangliósidos GD2 y (C ) GD2 gangliósido y los núcleos se funden. (D) ganglios GD3IDE manchado con superposición de anticuerpos contra GD3 R24 con campo claro, (E) y la expresión de gangliósidos GD3 (F) y el gangliósido GD3 núcleos se fusionan. El GD3, GD2 y núcleos de tinción se evaluó mediante microscopía confocal de una pila con una 60X S / 1.3 petróleo objetivo con zoom digital de 2X. Barra de escala = 45 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 + o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente.
Este protocolo combinado con un análisis de microscopía confocal de buena calidad es una ventaja clave de la utilización de técnicas tales como cromatografía en capa fina para la detección de los gangliósidos porque revela la localización espacial y la dinámica de los gangliósidos durante el tratamiento (por ejemplo, la activación de células T), dando lugar a adquisición de datos 11,12,13 biológicamente relevante. Además, este protocolo permite la evaluación de la expresión de gangliósidos a partir de un pequeño número de células T CD4 + (2 x 10 4) Que es útil para optimizar el número de repeticiones o 6 ensayos diferentes.
El tratamiento cuidadoso durante el lavado y la tinción de anticuerpos después de la adhesión es crucial para mantener el número de células y la integridad. Debido a la débil unión de las células T CD4 + en el cubreobjetos, también es muy importante para agregar y quitar cuidadosamente soluciones; de lo contrario se encontró una reducción en el número de células y el aumento de restos fluorescente. Cuando se evaluó mediante microscopía confocal, la inmunotinción de gangliósidos confiere información adicional, como la localización espacial o co-localización con otras moléculas en la membrana plasmática o compartimentos intracelulares. Localización subcelular requiere el uso de marcadores subcelular 14, 15. Además, las células T CD4 + fresco y no fija deben ser utilizados para la tinción para determinar la expresión de gangliósidos restringido a la superficie celular. Aunque la fijación de linfocitos T CD4 + ceLLS ayuda a preservar la muestra durante al menos 5 días, que conlleva el riesgo de permeabilización y tinción intracelular.
Sin embargo, debido a la similitud estructural entre los gangliósidos, siempre es recomendable tener en cuenta la especificidad de los anticuerpos usados. Varios de los anticuerpos monoclonales anti-gangliósido disponibles comercialmente se pueden utilizar y para algunos de ellos la especificidad ha sido sondeado por ELISA, TLC, etc. 16,17,18.
Trabajos anteriores demuestran que es posible obtener información sobre la localización y la expresión de GD3 y GD2 gangliósidos a partir de 2 x 10 4 células / por condición 6. Además, este protocolo describe la capacidad de realizar experimentos de genes de perfiles a partir de 4 x 10 4 células, lo que permite la optimización de silenciar experimentos tales como los basados en partículas lentivirales 6.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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