Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
עצבים מביאים לא רק להעביר מידע הנוגע הפיסיולוגיה נורמלית, אלא גם לאותת הומאוסטזיס מופרע ותהליכי pathophysiological של מערכות האיברים השונות מהפריפריה כלפי מערכת העצבים המרכזית. ככזה, הפעילות המוגברת או 'הרגישות' עצבים מביאים mesenteric הוקצתה תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של רגישות יתר קרבית ותסמונות כאב בטן.
ניתן למדוד Mesenteric פעילות עצבית מביאה במבחנה בתוך קטע מעי מבודד כי הוא רכוב באמבט שנבנה במיוחד איברים שממנו העצב splanchnic מבודד, ומאפשר לחוקרים להעריך את פעילות עצב ישירות בסמוך במגזר העיכול. פעילות ניתן להקליט בתחילת המחקר בתנאים סטנדרטיים, במהלך ההתנפחות של המגזר או בעקבות התוספת של תרכובות תרופתיות נמסרו intraluminally או serosally. טכניקה זו מאפשרתהחוקר כדי לחקור את ההשפעה של תרופות המכוונות למערכת העצבים ההיקפית בקלות דגימות שליטה; וחוץ מזה, זה מספק מידע חיוני על איך העצבית פעילות משתנה במהלך המחלה. אצוין עם זאת כי מדידת פעילות ירי עצבית מביאה רק מהווה תחנת ממסר אחד העצבי מורכב מפל איתות, וחוקרים צריכים לזכור שלא להתעלם פעילות עצבית ברמות אחרות (למשל, גרעיני שורש הגבה, חוט שדרה או מרכזי מערכת עצבים ) על מנת להבהיר את הפיזיולוגיה העצבית מורכבים מלא בבריאות ובחולי.
בדרך כלל יישומים בשימוש כוללים את חקר פעילות עצבית בתגובת הממשל של lipopolysaccharide, ואת המחקר של פעילות עצבית מביאה במודלים של בעלי חיים של תסמונת מעי רגיז. בגישה translational יותר, קטע מעי העכבר המבודד יכול להיחשף supernatants גס מחולי IBS. יתר על כן, שינויבטכניקה זו הוצגה לאחרונה לחול בדגימות הגס האנושי.
איתות חושית תפיסת כאב היא תהליך מורכב נובע גומלין מורכב שבין העצבים מביאים, הנוירונים שדרה, עולה ושבילי facilitatory מעכבים וכמה אזורים שונים במוח יורדים. ככזה, שינויים באחת או יותר של רמות אלו עלולים לגרום איתות חושית שינתה וכאב בטן במדינות מחלה. כדי ללמוד את כל ההיבטים השונים הללו של מספר רב של טכניקות חושיות איתות פותחיו החל ניסויי תא בודדים (למשל, הדמית סידן על נוירונים) כדי במודלים של בעלי חיים שלמים (למשל, תגובות התנהגותיות כגון תגובת visceromotor). הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשרת לחוקרים להעריך את פעילות עצב מביאה במיוחד במבחנה מפלחת מבודדת של מעי דק או מעי גס במכרסמים. בקיצור, פלח עיכול מבודד (בדרך כלל מְעִי צָם או מעי גס) מותקן בתא הקלטה ייעודי perfused עם K פיסיולוגיפתרון ריב '. עצב splanchnic הוא גזור חינם ומחובר לאלקטרודה המאפשר רישום של פעילות עצבית מביאה בעצבים מביאים splanchnic או אגן. ניתן להקליט פעילות עצבית basally או בתגובת הגדלה לחצי intraluminal ו / או תרכובות תרופתיות שניתן ליישם באופן ישיר לתוך תא ההקלטה (serosally), או באמצעות perfusate intraluminal (mucosally) כדי להעריך את השפיע על פריקה מביא 1-6 . ראוי לציין, עצבים splanchnic מכילים גם סיבים efferent ו afferents viscerofugal בנוסף afferents חושית. אחד היתרונות הגדולים של הקלטה עצב splanchnic vivo לשעבר היא העובדה כי החוקרים יכולים לכמת פעילות עצבית ללא אפנון או קלט ממערכת העצבים המרכזית, המאפשר אחד כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של תרכובות מיושם באופן מקומי על פעילות עצבית. יתר על כן, ניטור של פרמטרים חיוניים, ככל שיהיה דרוש בגישת in vivo (ראה להלן), הוא no הכלח. הקלטה splanchnic במבחנה הוא סוף סוף הרבה פחות זמן רב יותר מאשר עמיתו vivo ב שלה.
הביא פעילות עצבית בתגובה לגירויים אחרים, כגון ליטוף רירי, חיטוט באמצעות שערות פון פריי או מתיחה של המגזר, ניתן ללמוד בתוך הגדרת ניסוי שונה שבו רקמת המעי היא מרותקת ופתח longitudinally (וזה בניגוד ההגדרה שלנו באמצעות מגזר שלם), כפי שתוארה בגיליון קודם 7,8. בנוסף, רק לאחרונה, טכניקה תוארה ללמוד הפעלת עצבים מביאים גסה בקיר הגס עצם באמצעות הדמית סידן, שוב באמצעות מרותקים, longitudinally נפתח קטע 9.
גרסה אלטרנטיבית של טכניקת in vivo זה מורכב מתוך מדידת הפעלה עצבית ליד הכניסה מביאה אל חוט השדרה. בקיצור, החיה המסוממת היא להציב בעמדה, דואר נוטהxposing חוט השדרה lumbosacral שאליו העצב מביא פרויקטים עניין באמצעות laminectomy, בניית היטב מולא פרפין באמצעות העור של החתך ומקשטות את הגב שָׁרשׁוֹן על אלקטרודה דו קוטבית פלטינה 10,11. טכניקה זו יתר על כן מאפשרת לחוקרים לאפיין סיבים מבוססים על מהירות ההולכה שלהם, ולהבדיל C-סיבי unmyelinated מ Aδ-סיב myelinated הדק. יתר על כן, שורשונים הגבו בלעדי מכילים סיבים חושיים מביאים, בניגוד עצבי splanchnic מביא ו efferent המעורבים כאמורים.
הקלטה פריקה עצב מביא במבחנה מפלחת בטן מבודדת יכול להיעשות גם באמצעות דגימות אנושיות, כמו שתי קבוצות מחקר שפורסמו עצמאי כתבי היד הראשונות ב-אדם הקלטת פעילות עצב מביא גס כריתת אדם דגימות 12,13. יישום טכניקה זו יכולה לגרום יותר בקלות translatiעל נתוני murine למדינה ההומנית, ויכול לאפשר לחוקרים לזהות תרופות מיקוד העצב התחושתי הרגיש בקלות. החשיבות הקלינית של מאפיינים את פעילות עצבים מביאים, כמו גם גילוי ריאגנטים טיפוליים חדשים כי למקד פעילות עצבית מביאה מופקעת, כבר ונדונה בהרחבה על ידי מומחים רבים בתחום 14-19.
האמורה במבחנת הטכניקה משלימה את ידוע יותר בכינויו במדידת vivo של פעילות עצבית מביא. במהלך in vivo מדידת פעילות עצבית, פעילות עצבית ניתן למדוד ישירות את החיה המסוממת שבמהלכו הקטע של עניין מזוהה ולאחר מכן מחובר לצינורות, וכן פרפין מלא נוזל גם נבנה באמצעות דופן הבטן והעור של המכרסמים 20. העצב של עניין המביא מזוהה אז, מחולק והניח על אלקטרודה פלטינה דו קוטבית, המאפשר measuremen פעילות העצביתt. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לווסת פעילות עצבית מביאה לחיות אם כי חיות מסוממות; ככזה, אפשר ללמוד הפעילות העצבית להגיב הפרעות כגון התנפחות לומינל או עירוי לוריד של תרכובת.
מחקר Translational כיום בעיקר מתמקד ביישום של supernatants נגזרות האנושיות (למשל., ביופסיות גסות, תאי הדם היקפיים mononuclear מעובדים, וכו ') על afferents עכבר jejunal ו / או מעי הגס 21,22. חוקרים יכולים ישירות להחיל supernatants או לאמבטית האיבר או לתוך תמיסת intraluminal כי perfuses במגזר המעי, כך השפעות שונות של serosal לעומת יישום רירי ניתן ללמוד על פריקת עצב מביאה. ככזה, הוא הוצג supernatans ביופסיה של רירית מעי גס כי מחולים עם תסמונת מעי רגיז יכול לגרום רגישות יתר ב afferents גס עכבר, נוירונים submucous שרקן ואת שורש הגבה עכברנוירונים גנגליון 21,23,24.
לבסוף, להקליט פעילות עצבית אינו מצטמצם אך בפגיעת mesenteric ו / או נוירונים אגן innervating מערכת העיכול. אחרים הוכיחו כי הקלטות עצבות יכולות להתבצע afferents באספקת הברך 25 משותפים, בעוד שאחרים הגדירו שלפוחית פעילות עצבית מביא גם 26-28, והוכיחו כי afferents אגן משלפוחית השתן וכן מערכת העיכול להתכנס, ואולי וכתוצאה מכך עצבי crosstalk 29.
הפרוטוקול במאמר זה מתאר טכניקת מעבדה לשחזור ללמוד פעילות עצבית מביא mesenteric במכרסמים כפי שמוצג על ידי הקבוצה שלנו ואחרים 3,4,7,8,12,20,21,31. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים את הבידוד המהיר של הרקמה, שאיפה של גדיל העצב לתוך האלקטרודה היניקה ו 'איטום' הנאה של נימי …
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |