Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Afferenta nerver inte bara förmedla information om normal fysiologi, men också signalera störd homeostas och patofysiologiska processer i olika organsystem från periferin mot det centrala nervsystemet. Som sådan har den ökade aktiviteten eller "sensibilisering" av mesenteriska afferenta nerver tilldelats en viktig roll i patofysiologin för visceral överkänslighet och abdominala smärtsyndrom.
Mesenteriska afferent nervaktivitet kan mätas in vitro i ett isolerat intestinala segment som är monterad i en specialbyggd organbad och från vilken den splanchnicus nerven isoleras, vilket gör att forskare för att direkt bedöma nervaktivitet i anslutning till det gastrointestinala segmentet. Aktivitet kan registreras vid baseline i standardiserade förhållanden under buk av segmentet eller efter tillsatsen av farmakologiska föreningar levereras intraluminalt eller serosally. Denna teknik medgerforskaren att enkelt studera effekten av läkemedel som riktar sig till perifera nervsystemet i kontrollprover; Dessutom ger det avgörande information om hur nervaktivitet förändras under sjukdom. Det bör dock noteras att mäta afferent neuronaktivitet endast utgör en relästation i det komplexa neuronala signalkaskad, och forskare bör ha i åtanke att inte förbise neuronal aktivitet på andra nivåer (t.ex. dorsalrotsganglier, ryggmärgen eller centrala nervsystemet ) för att fullt ut klarlägga komplexa neuronala fysiologi vid hälsa och sjukdom.
Vanligen använda applikationer inkluderar studier av neuronal aktivitet som svar på administrering av lipopolysackarid, och studiet av afferent nervaktivitet i djurmodeller av colon irritabile. I en mer translationell tillvägagångssätt, kan det isolerade mus tarmsegmentet exponeras för colonic supernatanter från IBS-patienter. Vidare, en modifieringav denna teknik har nyligen visat sig vara tillämplig i humana kolonprover.
Sensorisk signalering och smärtupplevelse är en komplex process som resulterar från ett intrikat samspel mellan afferenta nerver, spinal nervceller, stigande och fallande facilitatory och hämmande vägar och flera olika områden i hjärnan. Som sådana kan förändringar vid en eller flera av dessa nivåer resulterar i förändrad sensorisk signalering och visceral smärta vid sjukdomstillstånd. För att studera alla dessa olika aspekter av sensorisk signalering flera tekniker har utvecklats som sträcker sig från enstaka cellförsök (t.ex. kalcium avbildning på neuroner) till hela djurmodeller (t.ex. beteendemässiga reaktioner såsom visceromotor svar). Den teknik som beskrivs i detta dokument tillåter forskare att särskilt bedöma afferent nervaktivitet in vitro från en isolerad del av tunntarmen eller kolon hos gnagare. Kort sagt, en isolerad gastrointestinal segment (vanligen jejunum eller kolon) monterad i en specialbyggd inspelning kammare perfusion med en fysiologisk KRebs lösning. Den splanchnicus nerv dissekeras och kopplas till en elektrod möjliggör registrering av afferent neuronal aktivitet i splanchnicus eller bäcken afferenta nerver. Nervaktiviteten kan registreras basalt eller som svar på ökande intraluminala tryck och / eller farmakologiska föreningar som kan användas antingen direkt till inspelningen kammaren (serosally), eller via det intraluminala perfusat (mukosalt) för att bedöma deras effekt på afferenta urladdning 1-6 . Att notera, splanchnicus nerver innehåller också efferenta fibrer och viscerofugal afferenter utöver de sensoriska afferenter. En av de stora fördelarna med ex vivo splanchnicus nerv inspelning är det faktum att forskarna kan kvantifiera nervaktivitet utan modulering eller input från det centrala nervsystemet, tillåter en att studera den direkta effekten av lokalt tillämpade föreningar på nervaktivitet. Dessutom övervakning av vitala parametrar, som är nödvändigt med hjälp av in vivo tillvägagångssätt (se nedan), är no längre relevant. In vitro splanchnicus inspelning slutligen mycket mindre tidskrävande än dess in vivo motsvarighet.
Afferent neuronal aktivitet som svar på andra stimuli, såsom mukosal strök, sondering med användning av von Frey-hår eller stretching av segmentet, kan studeras i en modifierad experimentuppställning i vilken tarmvävnaden är nålas ner och öppnas i längdriktningen (som är i motsats till vår inställning med en intakt segment), som beskrevs i en tidigare utgåva 7,8. Dessutom, helt nyligen, var en teknik som beskrivs för att studera kolon afferenta nerv aktivering i kolon väggen själv via kalcium avbildning, återigen med hjälp av en nålas ner, längs öppnade segment 9.
En alternativ version av detta in vivo teknik består av att mäta neuronal aktivering nära afferenta inträde i ryggmärgen. Kort sagt är den sedated djuret placerades i framstupa läge, exposing lumbosacral ryggmärgen som afferenta nervränte projekt genom laminektomi, konstruera en paraffin fylld brunn med huden på snittet och draperingar rygg RÖTTER över en platina bipolär elektrod 10,11. Denna teknik medger dessutom forskare att karakterisera fibrer baserat på deras ledningshastighet, och särskilja omyeliniserade C-fibrer från tunt myeliniserade Aδ-fibrer. Vidare dorsala rottrådar uteslutande innehåller sensoriska afferenta fibrer, i motsats till de blandade afferenta och efferenta splanchnicus nerver som nämnts tidigare.
Inspelning afferenta nerv ansvarsfrihet vitro från isolerade tarmsegment kan också göras med hjälp av prover från människa, som två forskargrupper oberoende publicerade första-in-man manuskript inspelning kolonafferent nervaktivitet i human resektion exemplar 12,13. Genomförandet av denna teknik kan resultera i en mera lätt translatipå av murina data till humana tillstånd, och kan göra det möjligt för forskare att enkelt identifiera droger som riktar sig till sensibiliserade sensoriska nerver. Den kliniska betydelsen av karakterisera afferenta nervaktivitet, liksom upptäckten av nya terapeutiska reagens som riktar orimliga afferent nervaktivitet, har omsorgsfullt diskuterats av många experter på området 14-19.
Den tidigare nämnda in vitro teknik kompletterar mer känd in vivo mätning av afferent nervaktivitet. Under in vivo-nervaktivitet mätning kan nervaktiviteten mätas direkt i sedated djuret under vilken segmentet av intresse identifieras och därefter intuberades, och en flytande paraffin fylld väl konstrueras med användning av den abdominala väggen och huden på gnagare 20. Afferenta nerv av intresse identifieras sedan, snittades och placerades på en bipolär platinaelektrod, vilket gör att nervaktivitet measurement. Denna teknik gör det möjligt för forskare att modulera afferent nervaktivitet i levande än sederade djur; som sådan, kan man studera nervaktivitet svara på störningar såsom luminala buk eller intravenös administrering av en förening.
Translationell forskning fokuserar numera huvudsakligen på tillämpningen av supernatanter humant ursprung (eg., Från kolonbiopsier, odlade perifera mononukleära blodceller, etc.) på jejunala och / eller kolon mus afferenter 21,22. Forskare kan direkt tillämpa supernatanterna antingen till organbadet eller i intraluminal lösning som perfuses tarmen segmentet, så att differentiella effekter av serosala mot mucosal ansökan kan studeras på afferenta nerv urladdning. Som sådan, visade det sig att kolon slemhinnor biopsi supernatans från patienter med IBS kan orsaka överkänslighet i mus kolon afferenter, marsvin submukös nervceller och mus dorsalaganglieneuroner 21,23,24.
Slutligen spelar in neuronal aktivitet inte är begränsad till den mesenteriala och / eller bäcken neuroner som innerverar det gastrointestinala området. Andra har visat att nerv inspelningar kan utföras i afferenter levererar knäleden 25, medan andra har präglat blåsafferent nervaktivitet samt 26-28, och visade att bäcken afferenter från blåsan samt mag-tarmkanalen konvergerar, vilket kan leda till neuronal överhörning 29.
Protokollet i detta dokument beskriver en reproducerbar laboratorieteknik för att studera mesenteriska afferent nervaktivitet hos gnagare som används av vår grupp och andra 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritiska steg i protokollet omfattar snabb isolering av vävnaden, aspiration av nervsträngen i sug elektroden och adekvat "tätning" av glas kapillär från organbadet genom att aspirera omgivande fettvävnad i kapillären. Öppningen i glaskapillär bör bestämmas exakt: en öppning som är för litet …
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |