Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
Afferente nerver ikke kun overføre information vedrørende den normale fysiologi, men også signalere forstyrret homeostase og patofysiologiske processer i respektive organsystemer fra periferien mod centralnervesystemet. Som sådan har den øgede aktivitet eller "overfølsomhed" af mesenteriske afferente nerver fået tildelt en vigtig rolle i patofysiologien af visceral hypersensitivitet og mavesmerter syndromer.
Mesenteriske afferent nerve aktivitet kan måles in vitro i et isoleret tarm segment, der er monteret i et specialbygget organbad, og hvorfra splanknisk nerve er isoleret, hvilket tillader forskerne til direkte vurdere nerveaktivitet støder op til den gastrointestinale segment. Aktivitet kan optages ved baseline i standardiserede forhold, under udspiling af segment eller efter tilsætning af farmakologiske forbindelser leveret intraluminalt eller serosally. Denne teknik tilladerforskeren for nemt undersøge effekten af lægemidler rettet mod det perifere nervesystem i kontrol prøver; Desuden er det giver vigtige oplysninger om, hvordan neuronal aktivitet ændres under sygdom. Det skal dog bemærkes, at måling afferent neuronal fyring aktivitet kun udgør én relæstation i den komplekse neuronal signalering kaskade, og forskerne skal huske på ikke at overse neuronal aktivitet på andre niveauer (fx dorsalrodsganglier, rygmarv eller centralnervesystemet ) for fuldt ud at belyse den komplekse neuronale fysiologi i sundhed og sygdom.
Almindeligt anvendte applikationer omfatter studiet af neuronal aktivitet som respons på administrationen af lipopolysaccharid, og studiet af afferent nerve aktivitet i dyremodeller af irritabel tarmsyndrom. I en mere translationel tilgang, kan det isolerede intestinale segment mus udsættes for colon supernatanter fra IBS-patienter. Desuden er en modifikationved denne teknik er for nylig blevet vist at være anvendelig i humane colon prøver.
Sensorisk signalering og smerteopfattelse er en kompleks proces, der resulterer fra en indviklet samspil mellem afferente nerver, spinal neuroner, op- og nedstigende facilitatory og hæmmende veje og flere forskellige hjerneområder. Som sådan kan ændringer ved en eller flere af disse niveauer resultere i ændret sensorisk signalering og visceral smerte i sygdomstilstande. For at undersøge alle disse forskellige aspekter af sensorisk signalsystemer flere teknikker er blevet udviklet lige fra encellede eksperimenter (f.eks calcium imaging på neuroner) til hele dyremodeller (f.eks adfærdsmæssige reaktioner såsom visceromotor respons). Den i dette dokument teknik tillader forskerne at foretage en specifik vurdering afferent nerve aktivitet in vitro fra et isoleret segment af tyndtarmen eller tyktarmen hos gnavere. Kort sagt er en isoleret gastrointestinal segment (sædvanligvis jejunum eller colon) monteret i et specialbygget optagelse kammer perfunderet med en fysiologisk KRebs opløsning. Den splanknisk nerve dissekeres fri og forbundet til en elektrode tillader registrering af afferent neuronal aktivitet i splanknisk eller bækken afferente nerver. Nerveaktivitet kan optages basalt eller som reaktion på stigende intraluminale tryk og / eller farmakologiske forbindelser, der kan anvendes enten direkte ind i optagelsen kammeret (serosally), eller via intraluminale perfusat (mucosalt) for at vurdere deres virkning på afferent udledning 1-6 . Af note, splanknisk nerver indeholder også efferente fibre og viscerofugal afferenter foruden de sensoriske afferenter. En af de store fordele ved ex vivo splanknisk nerve optagelse er, at forskerne kan kvantificere nerveaktivitet uden graduering eller input fra centralnervesystemet, tillader en at studere den direkte virkning af lokalt anvendte forbindelser på nerveaktivitet. Endvidere monitorering af vitale parametre, som det er nødvendigt under anvendelse af in vivo fremgangsmåde (se nedenfor), er no længere relevant. In vitro splanknisk optagelse er endelig langt mindre tidskrævende end in vivo modstykke.
Afferent neuronal aktivitet som respons på andre stimuli, såsom mucosal strøg, sondering hjælp von Frey-hår eller strækning af segmentet, kan studeres i en modificeret forsøgsopstilling, hvor det intestinale væv holdt nede og åbnet på langs (som er i modsætning til vores setup ved hjælp af en intakt segment), som blev beskrevet i en tidligere emne 7,8. Hertil kommer, først for nylig, blev en teknik beskrevet at studere colon afferent nerve aktivering i selve colon væg via calcium imaging, igen ved hjælp af et fastgjort ned, på langs åbnet segment 9.
En alternativ version af denne in vivo teknik består af måling neuronal aktivering nær afferente indtræden i rygmarven. Kort sagt er den sederet dyr anbringes i bugleje, exposing lumbosacral rygmarven, som afferent nerve steder projekter ved hjælp af laminektomi, opføre et paraffin-fyldt brønd under anvendelse af huden af snittet og drapering den dorsale rootlet over en platin bipolær elektrode 10,11. Denne teknik gør det endvidere muligt for forskerne at karakterisere fibre baseret på deres ledningshastighed, og skelne umyelinerede C-fibre fra tyndt myelinerede Aδ-fibre. Endvidere dorsale rodspirer udelukkende indeholder sensoriske afferente fibre, i modsætning til de blandede afferente og efferente splanknisk nerver nævnt tidligere.
Optagelse afferente nerve udledning in vitro fra isolerede gut segmenter kan også gøres ved hjælp af humane prøver, som to forskergrupper uafhængigt offentliggjort første-i-mand manuskripter optagelse colon afferent nerveaktivitet i human resektion prøver 12,13. Gennemførelsen af denne teknik kan resultere i en lettere translatipå af murine data til human tilstand, og kan gøre det muligt for forskerne at nemt at identificere lægemidler rettet mod den sensibiliserede sensoriske nerve. Den kliniske betydning af karakterisere afferent nerveaktivitet, samt opdagelsen af nye terapeutiske reagenser, der er målrettet ublu afferent nerveaktivitet, er blevet kunstfærdigt diskuteret af mange eksperter på området 14-19.
Den førnævnte in vitro teknik supplerer mere almindeligt kendt in vivo måling af afferent nerveaktivitet. Under in vivo neuronal aktivitet måling, kan nerveaktivitet måles direkte i sederet dyr, i hvilken segmentet af interesse identificeres og efterfølgende intuberet, og en flydende paraffin fyldt godt konstrueres ved anvendelse bugvæggen og huden af gnaver 20. Den afferent nerve af interesse identificeres derefter, snittet og placeres på en bipolær platinelektrode, tillader neuronal aktivitet measurement. Denne teknik gør det muligt for forskeren at modulere afferent nerveaktivitet i levende omend bedøvede dyr; som sådan, kan man studere neuronal aktivitet at reagere på interferens såsom luminal udspiling eller intravenøs administration af en forbindelse.
Translationel forskning fokuserer i dag primært på anvendelse af human-afledte supernatanter (f.eks. Fra biopsier fra colon, dyrkede perifere mononukleære blodceller, etc.) på jejunale og / eller colon mus afferenter 21,22. Forskere kan direkte anvende supernatanter enten ind i organet bad eller i den intraluminale løsning, der gennemløber vævet tarmen segmentet, således at forskellige virkninger af serosa versus slimhinde ansøgning kan studeres på afferent nerve udledning. Som sådan blev det vist, at colon mucosa-biopsi supernatanter fra patienter med irritabel tyktarm kan forårsage overfølsomhed i muse colon afferenter, marsvin submukøse neuroner og muse dorsale rodganglieneuroner 21,23,24.
Endelig optagelse neuronal aktivitet er ikke begrænset til den mesenteriale og / eller bækken neuroner innerverer mavetarmkanalen. Andre har vist, at nerve optagelser kan udføres i afferente levere knæleddet 25, mens andre har karakteriseret blære afferent nerveaktivitet samt 26-28, og viste, at bækken afferenter fra blæren samt mavetarmkanalen konvergere, hvilket kan resultere i neuronal crosstalk 29.
Protokollen i dette papir beskriver en reproducerbar laboratorium teknik til at studere mesenteriske afferent nerveaktivitet hos gnavere som bruges af vores gruppe og andre 3,4,7,8,12,20,21,31. Kritiske trin i protokollen omfatte hurtig isolering af vævet, aspiration af nerve-strengen ind i suge- elektrode og tilstrækkelig "forsegling" af glaskapillar fra organbadet ved sugning omgivende fedtvæv i kapillarrøret. Åbningen af glasset kapillar skal bestemmes præcist: en blænde, der er for …
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |