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Neuroscience

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

Afferenten Nerven nicht nur Informationen über die normale Physiologie vermitteln, sondern auch die Signal gestörter Homöostase und pathophysiologischen Prozessen der verschiedenen Organsysteme von der Peripherie in Richtung des zentralen Nervensystems. Als solche hat die erhöhte Aktivität oder "Sensibilisierung" von mesenterischen afferenten Nerven wurde eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der viszerale Hypersensitivität und Bauchschmerzsyndromen zugeordnet.

Mesenteriale afferenten Nerven - Aktivität in vitro in einem isolierten Darm-Segment gemessen werden , die in einem eigens errichteten Organbad montiert ist und aus dem die Splanchnicus isoliert ist, so dass die Forscher direkt Nervenaktivität neben dem Magen - Darm - Segment zu beurteilen. Aktivität kann in standardisierten Bedingungen an der Basislinie aufgezeichnet werden, während der Aufblähung des Segments oder nach der Zugabe von pharmakologischen Verbindungen geliefert intraluminal oder serös. Diese Technik ermöglichtdie Forscher leicht die Wirkung von Medikamenten untersuchen das periphere Nervensystem in Kontrollproben ausgerichtet sind; Außerdem liefert es wichtige Informationen darüber, wie die neuronale Aktivität während der Krankheit verändert. Es sollte jedoch beachtet werden , dass nur afferente neuronale Aktivität Messung der Aktivität einer Relaisstation in der komplexen neuronalen bildet Signalkaskade, und Forscher sollten bedenken , nicht auf die neuronale Aktivität auf anderen Ebenen (zB Dorsalwurzelganglien, Rückenmark oder das zentrale Nervensystem übersehen ), um die komplexen neuronalen Physiologie in Gesundheit und Krankheit vollständig aufzuklären.

Häufig verwendete Anwendungen umfassen die Untersuchung der neuronalen Aktivität in Reaktion auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid und das Studium der afferenten Nerven-Aktivität in Tiermodellen von Reizdarmsyndrom. In einem translationalen Ansatz kann der isolierten Maus intestinalen Segment colonic Überständen von IBS-Patienten ausgesetzt werden. Weiterhin ist eine Modifikationdieser Technik in menschlichen Kolon-Proben vor kurzem anwendbar erwiesen hat.

Introduction

Sensory-Signalisierung und die Schmerzwahrnehmung ist ein komplexer Prozess, der zwischen afferenten Nerven, Rücken Neuronen, auf- und absteigende fazilitierenden und hemmenden Bahnen und verschiedene Hirnregionen aus einem komplizierten Zusammenspiel ergibt. Als solche Änderungen an einer oder mehreren dieser Stufen in veränderte sensorische Signalgebung und viszeralen Schmerzen bei Krankheitszuständen führen können. Um all diese verschiedenen Aspekte der sensorischen Signal mehrere Techniken studieren wurden von Einzelzellexperimenten entwickelt Bereich (zB Kalzium - Imaging auf Neuronen) auf ganze Tiermodellen (zB Verhaltensreaktionen wie die viszeromotorische Antwort). Die Technik , die in diesem Papier beschrieben ermöglicht es den Forschern , um spezifisch zuführenden Nervenaktivität in vitro aus einem isolierten Segment des Dünndarms oder Dickdarms bei Nagetieren zu bewerten. Kurz gesagt, ein isoliertes Magen-Darm-Segment (in der Regel Jejunum oder Kolon) in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer physiologischen K durchbluteten montiertrebs Lösung. Der Splanchnicus wird freipräpariert und mit einer Elektrode verbunden Registrierung von afferenten neuronalen Aktivität in splanchnic oder Becken afferenten Nerven ermöglicht. Nervenaktivität kann basal oder als Reaktion auf zunehmenden intraluminalen Druck und / oder pharmakologische Verbindungen aufgezeichnet werden , die entweder direkt in die Aufnahmekammer eingesetzt werden kann (serös), oder über die intraluminale Perfusat (mukosal) ihre Wirkung auf afferenten Entladung zu bewerten 1-6 . Zu beachten ist, splanchnici enthalten auch Efferenzen und viscerofugal afferents zusätzlich zu den sensorischen Afferenzen. Einer der wichtigsten Vorteile von ex vivo Splanchnicus Aufnahme ist die Tatsache , dass die Forscher die Nervenaktivität ohne Modulation oder Input aus dem zentralen Nervensystem zu quantifizieren, so dass man die direkte Wirkung von lokal applizierten Verbindungen auf die Nervenaktivität zu untersuchen. Weiterhin Überwachung von Vitalparametern, wie notwendig ist , die in vivo - Ansatz (siehe unten), ist no mehr relevant. In - vitro - splanchnic Aufnahme ist schließlich viel weniger zeitaufwendig als die in - vivo - Pendant.

Zuführenden neuronalen Aktivität in Reaktion auf andere Reize, wie Schleimhaut Streicheln, Sondieren mittels von Frey Haare oder Dehnen des Segments können in einer modifizierten Versuchsaufbau untersucht werden, in denen das Darmgewebe ist festgenagelt und in Längsrichtung geöffnet (die im Gegensatz zu unser Setup ein intaktes Segment) verwenden, wie es in einer früheren Ausgabe 7,8 beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde erst kürzlich eine Technik beschrieben colonic afferenten Nervenaktivierungs in der Kolonwand selbst über Calcium Bildgebung zu studieren, wieder festgenagelt Verwendung longitudinal geöffnet Segment 9.

Eine alternative Version dieser in vivo - Technik besteht aus neuronale Aktivierung in der Nähe der Eintrag des afferenten in das Rückenmark zu messen. Kurz gesagt, wird die sedierten Tier in der Bauchlage, e platziertxposing lumbosakralen Rückenmark ein Paraffin gefüllt und mit der Haut des Einschnitts an dem die afferente von Interesse Projekte durch Laminektomie, den Bau und die dorsale rootlet über eine Platin bipolaren Elektrode 10,11 drapieren. Diese Technik erlaubt zudem Forscher Fasern zu charakterisieren basierend auf ihrer Leitungsgeschwindigkeit und unterscheiden unmyelinated C-Fasern, die aus dünn myelinisierten A & dgr-Fasern. Weiterhin dorsalen Wurzelfasern enthalten ausschließlich sensorischen afferenten Fasern, im Gegensatz zu den gemischten und abführenden splanchnici zuvor erwähnt.

Aufnahme afferenten Nervenentladung in vitro aus isolierten Darmsegmente können auch unter Verwendung von humanen Proben durchgeführt werden, als zwei Forschergruppen unabhängig veröffentlicht first-in-man Manuskripte Kolon afferenten Nervenaktivität in menschlichen Resektionsproben 12,13 Aufnahme. Die Umsetzung dieser Technik in einem mehr führen könnte leicht translatiauf der Maus-Daten an den humanen Zustand und könnte den Forschern ermöglichen, auf einfache Weise Medikamente zu identifizieren, die sensibilisiert sensorischen Nerven Targeting. Die klinische Bedeutung der zuführenden Nervenaktivität zu charakterisieren, sowie die Entdeckung neuer therapeutischer Reagenzien , die exorbitant afferenten Nervenaktivität Ziel, wurde von vielen Experten auf dem Gebiet 14-19 ausführlich diskutiert.

Die zuvor genannte In - vitro - Technik ergänzt die am häufigsten in vivo - Messung von afferenten Nervenaktivität bekannt. Während in vivo kann neuronalen Aktivitätsmessung, Nervenaktivität direkt im sediert Tieres gemessen werden , während der das interessierende Segment identifiziert wird und anschließend intubiert und ein flüssiges Paraffin gefüllt und wird mit Hilfe der Bauchdecke und die Haut 20 des Nagetier konstruiert. Der afferente von Interesse wird dann identifiziert, geschnitten und auf einer bipolaren Platinelektrode gelegt, die neuronale Aktivität ermöglicht Messung!t. Diese Technik erlaubt es dem Forscher afferenten Nervenaktivität zu modulieren, wenn auch sediert Tiere in lebenden; als solche kann man reagieren neuronale Aktivität zu Störungen wie luminalen Distension oder intravenöser Verabreichung einer Verbindung studieren.

Translationale Forschung heutzutage konzentriert sich hauptsächlich auf die Anwendung von Menschen stammenden Überstände (z. B. aus Kolonbiopsien, kultivierten peripheren mononukleären Blutzellen, etc.) auf jejunal und / oder Kolon - Maus Afferenzen 21,22. Die Forscher können direkt Stände gelten entweder in das Organ Bad oder in die intraluminale Lösung, die das Darmsegment perfundiert, so dass die unterschiedlichen Wirkungen von serösen gegen Schleimhaut-Anwendung kann auf afferenten Nervenentladung untersucht werden. Als solches war es, dass Kolon-Schleimhaut-Biopsie supernatans von Patienten mit Reizdarmsyndrom gezeigt, Überempfindlichkeit in Maus Kolon Afferenzen, Meerschweinchen submucöse Neuronen und Maus dorsalen Wurzel verursachenGanglionneuronen 21,23,24.

Schließlich wird die neuronale Aktivität der Aufnahme nicht auf die mesenterialen eingeschränkt und / oder Becken Neuronen Innervation des Magen-Darm-Trakt. Andere haben gezeigt, dass Nerven Aufnahmen können in afferents Versorgung des Kniegelenks 25 durchgeführt werden, während andere Blase afferenten Nervenaktivität gekennzeichnet sind und 26-28, und zeigte , dass Becken Afferenzen aus der Blase als auch den Magen - Darm - Trakt zusammenlaufen, was möglicherweise zu neuronalen Übersprechens 29.

Protocol

Alle nachfolgend beschriebenen Tierversuche wurden vom Ausschuss für Medizinische Ethik und die Verwendung von Versuchstieren an der Universität Antwerpen (Dateinummer 2012-42) zugelassen.

1. Gewebepräparation von Jejunal und Kolon Afferenzen

  1. Die Herstellung des jejunal afferente
    1. Führen Sie Nagetier Euthanasie des Jugendlichen oder Erwachsenen Nagetier , das von der lokalen Ethikkommission vor dem Experiment genehmigt wurde (z. B. Terminal Sedierung , gefolgt von Herz-Einstich, Genickbruch, etc.).
      HINWEIS: Wir haben Zervikaldislokation die Tiere resultierende für weitere Anästhesie oder postoperative Versorgung ohne die Notwendigkeit , in den Experimenten so zu opfern , als Gewebe weiter in vitro verarbeitet werden.
      HINWEIS: Alter wurde 30 mechanosensorischen Funktionen mesenterialen afferenten gezeigt zu dämpfen, wir raten Forscher daher auf eine bestimmte Altersgruppe anhaften für die Dauer derein einzelnes Experiment.
    2. Legen Sie das geopfert Labortier in Rückenlage und führen Sie eine Bauchmittelschnitt durch die Haut und Bauchmuskelschicht mit einem Skalpell, die sich von dem Xyphoid Prozess bis zum Schambein.
    3. Bathe die Bauchhöhle mit kaltem Krebs - Lösung , um die intra-abdominalen Gewebe vor dem Austrocknen (Krebs Zusammensetzung zu verhindern: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15,43 mM NaHCO3, 1,21 mM MgSO 4, 11.52 mM D-Glucose und 1,52 mM CaCl 2).
    4. Schnell die gesamte Jejunum durch Exzision ca. 20 cm des Dünndarms mit einer scharfen Schere auszuschneiden unmittelbar distal der duodenojejunalis Biegung beginnen, dabei nicht die umgebenden Strukturen zu beschädigen und den Darm des Gekröse zu halten, die jejunal Blutgefäße und afferenten Nerven enthält, intakt.
      HINWEIS: Für die bloße jejunal Dissektion in der Bauchhöhle, muss man nicht verwenden müssenein Stereomikroskop, wie dies kann leicht mit dem bloßen Auge sichtbar gemacht werden.
    5. Legen Sie die ausgeschnittenen Jejunum in eiskaltem Krebs - Lösung und auf Eis halten, während die Krebs Sauerstoffanreicherungslösung kontinuierlich mit Carbogen (95% O 2, 5% CO 2).
    6. Schneiden Sie das Jejunum mit einer scharfen Schere in ca. 3 cm langen Schleifen. Beachten Sie die mesenterialen Bündel die Gefäße und Splanchnicus irgendwo in der Nähe der Mitte der jeweiligen Schleife enthält.
    7. Spülen jedes Segment mit Krebs - Lösung , die einen stumpfen Katheter luminalen Inhalte zu entfernen und Speisebrei da diese Verdauungsenzyme enthalten, die die Verschlechterung der Gewebeprobe in vitro beschleunigt.
      HINWEIS: Achten Sie darauf , dass das Lumen der Schleife zu beschädigen beim Spülen, wie die Zerstörung der Darmzotten in der Freisetzung von Mediatoren führen wird, die die zuführenden Nervenaktivität verändern kann.
    8. Identifizieren Sie das Segment der afferenten Nervenaktivität zu messen (zB die erste jejunal SEGMnt distal des Treitz-Band oder der duodenojejunalis Biegung) und Ort dieser in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer Siliconelastomerschicht beschichtet.
      HINWEIS: Der Anfang des Jejunums anatomisch als Teil des Dünndarms definiert ist, wo das Ligamentum Treitz den Dünndarm durchquert, auch die duodenojejunalis Biegung bezeichnet.
      HINWEIS: Bedecken Sie den Boden der Aufnahmekammer mit einer dünnen Silikonkautschukschicht im Voraus vor Beginn des Experiments. Die Herstellung dieser Elastomerschicht sollte 1 gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.
    9. Perfuse die Kammer ständig mit warmem, carbogenated Krebs-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / min und halten die Temperatur "Krebs in der Aufzeichnungskammer konstant bei 34 ° C.
    10. Montieren Sie das Jejunalsegment im Organbad so, dass die orale Ende mit dem Spritzentreiber verbunden ist die Bereitstellung luminalen Fluss und das aboral Ende verbindet sich mit dem Abfluss. Etwas stwürgen das Segment aber darauf achten, nicht zu viel Spannung auszuüben. Bringen Sie beide fest mit 4/0 Seide Ligatur Enden zu den Ein- und Austrittsöffnungen.
    11. Bringen Sie die Spritze Treiber zur mündlichen Ende, und perfuse das Jejunalsegment intraluminally mit Krebs-Lösung (nicht mit Sauerstoff angereichert, Umgebungstemperatur) mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / h.
    12. Pin das Gekröse des montierten Darm-Segment flach gegen die Silikonelastomer Bodenschicht, unter Verwendung von Insekten Pins. Dehnen Sie den Gekröse aus, um die Visualisierung des mesenterialen Bündel zu optimieren; nicht belasten das Bündel oder Jejunum ausüben.
    13. Eine Testrampen Distension (vide infra) durch den Ausgangsport Schließen bis der intraluminale Druck des intestinalen Segments erreicht 60 mmHg, um zu verifizieren, daß keine intraluminalen Krebs-Lösung aus dem montierten Segment austritt. Beachten Sie einen glatten Anstieg der intraluminale Druck ohne Unterbrechungen.
    14. Beobachten kleine Kontraktionen des Segments (peristaltische wavn) während der anfänglichen Aufblähung Phase. Falls erforderlich, blockieren durch Peristaltik Zugabe von 1 & mgr; M des L-Typ-Calciumkanalblocker Nifedipin zur Lösung Krebs.
      HINWEIS: Durch Hinzufügen 1 uM Atropin auf die Krebs-Lösung neben Nifedipin, das Darmsegment vollständig lahmlegen. Wir haben jedoch keine persönliche Erfahrung mit der Nutzung und Wirkung von Atropin auf afferenten Nerven Aufnahme.
    15. Unter einem Stereomikroskop, beginnen sanft das Fettgewebe aus dem Gekröse durch leichtes Ziehen sie mit zwei kleinen Pinzette zu schälen, dabei nicht die Gefäße und afferenten Nerven zu beschädigen, die im Fettgewebe begraben liegen.
    16. Beginnen Sie an einem entfernten Abstand von dem Jejunum, und setzen beide Blutgefäße im mesenterialen Bündel.
    17. Beachten Sie die zuführenden jejunal Nerv zwischen den beiden Gefäßen als dünner, weißer Faden im Fettgewebe verkapselt. Nur sezieren proximal in Richtung des Jejunum mehr durch sanft das Fettgewebe Ablösen mit einer Pinzette, wenn dieerste Identifizierung der beiden Mesenterialgefäße und / oder der afferenten Nerven ist schwierig.
    18. Präparieren Sie die jejunal mesenteric Nerv des Segments frei über eine Entfernung von mehreren Millimetern, durch das Fettgewebe Anhänger der Nerv zu entfernen.
    19. TRANSECT den Nerv mit einer scharfen Schere Gewebe. Falls erforderlich, ziehen Sie die restliche Fett und Bindegewebe sowie die epineuronal Hülle durch leichtes Ziehen sie mit den kleinen Pinzette ab.
    20. Verwendung eines Mikromanipulators, senken die Spitze der Saugelektrode, verbunden mit einer Spritze mit dem Kolben in das Organbad; Dann wird durch den Plunger Manipulieren sanft einige Krebs - Lösung aus dem Organbad absaugen , so dass die Spitze der Elektrode in der Krebs - Lösung (Figur 1) eingetaucht ist. Stellen Sie sicher, dass die Krebs-Lösung der Drahtelektrode im Inneren der Saugelektrode abdeckt.
      HINWEIS: Vorbereiten des Saug Borsilikatglas kapillaren daß die Drahtelektrode vor dem Start des Experiments enthält using einer Pipette Puller.
    21. Positionieren Sie die Spitze der Saugelektrode unmittelbar neben dem trennt afferenten Nervenstrang und ziehen den durchtrennten Nervenstrang in die Kapillare über seine gesamte Länge.
    22. Manövrieren Sie die Spitze der Elektrode in Richtung einige Fettgewebe und aspirieren diese in die Glaskapillare während fest mit dem Kolben angesaugt, wodurch mechanisch "Versiegelung" der Nerv in der Kapillare von dem Inhalt des Organbad.
    23. Überprüfen Sie die Aufzeichnung von afferenten Nervenaktivität der Datenerfassungssystem, beispielsweise durch eine Rampe Distension-induzierte Zunahme der afferenten Durchführung Abfeuern (vide infra). Nach der Isolierung des Nerven in die Saugelektrode, stabilisieren die Vorbereitung für 15 Minuten, um einen stabilen Zustand spontan afferenten Nervenaktivität zu erhalten, bevor die eigentlichen Experimente durchführen.
    24. Zur Rampe Aufblähung führen, blähen die intestinale Segment durch den Ausgangs-Port zu schließen, was zu gradzelnen Druckanstieg im Darmsegment (bis 60 mmHg). Führen Sie nur die gewünschte Versuchsprotokoll , wenn drei aufeinanderfolgende Rampe Dehnungen (mit einem 15 Minuten - Intervall) ergeben eine reproduzierbare Multi-Unit - Entladung (Abbildung 2).
  2. Vorbereitung der lumbalen splanchnic zuführenden (Kolon afferente)
    HINWEIS: Die Präparation von Kolon afferenten Nerven erfordert eine detaillierte Analyse. Abweichungen von der früheren "jejunal 'Protokoll sind im Folgenden aufgelistet:
    1. Euthanize das Tier durch eine humane Methode, legen Sie sie in Rückenlage, eine Mittellinie Laparotomie durchführen und übermäßig eiskaltem Krebs-Lösung in der Bauchhöhle zu gießen. HINWEIS: Krebs Zusammensetzung: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 NaHCO 3, 1,2 mM MgSO 4, 11 mM D-Glucose und 2,5 mM CaCl 2, 3 uM Indomethacin.
      HINWEIS: Beachten Sie die veränderte Zusammensetzung der Krebs-Lösung; Indomethacin ist mit dem so hinzulution, um durch Prostaglandine Veränderungen der afferenten Nervenaktivität zu verhindern.
    2. Entsorgen Sie das Fettgewebe, Blase und inneren Genitalien und sanft den Dünndarm zu einer Seite in der Bauchhöhle verschieben. Führen Sie eine erweiterte prelevation des distalen Teil des Dickdarms mit intakten Mesenterialnerven aus dem Bauch.
      HINWEIS: Wichtige Sehenswürdigkeiten, die in dieser Sektion enthalten sein können, weitere Vorbereitung des Gewebes zu unterstützen gehören die Bauchaorta und Hohlvene, die linke Niere und die Beckenbodenmuskulatur.
      HINWEIS: Während der Präparation darauf achten, dass die Traktion auf dem Verbindungsgewebe zwischen Kolon und der abdominalen Aorta auszuüben, da diese Region die Lenden- splanchnici enthält.
    3. Übertragen Sie das Gewebesegment in das Silikonelastomer Aufnahmekammer ausgekleidet. Verwenden Sie die linke Nierenarterie, die aus der Bauchaorta stammt, als Ausgangspunkt. Folgen Sie der Bauchaorta in aboraler Richtung, stoßen die überlegenen mesenteric Arterie zusammen mit der Zöliakie und mesenterica superior Ganglion. Schließlich kommen an dem Verbindungsgewebe zwischen dem distalen Teil des Kolons und der Aorta, wobei der Nerv von Interesse befindet.
    4. Identifizieren Sie die A. mesenterica inferior aus der Bauchaorta stammen. Die Lenden splanchnic afferente kann an der Basis der A. mesenterica inferior identifiziert werden; sie verläuft parallel zu der Arterie (Abbildung 3).
    5. Nach der Durchtrennung des Nervs, abblättern sanft die umgebende Bindegewebe und necken den Nerv in mehrere feine Fäden. Achten Sie auf einen sicheren Abstand vom Doppelpunkt zu halten.
    6. Zeichnen Sie eine dieser Einzelfäden in die Saugelektrode, "Siegel" die Kapillare mit umliegenden Fettgewebe, wie zuvor beschrieben, und führen Sie die gewünschte Versuchsprotokoll.
    7. Entsorgen Sie alle überflüssigen Gewebe , das in das Organbad vorhanden ist (zB Nieren, Bauchgefäße, Muskelgewebe), eins diese das afferente Signal stören.
      HINWEIS: Nifedipin (1 uM) kann das afferente Signal durch spontane Darmbewegung auf die Krebs-Lösung für den Fall hinzugefügt werden aufgrund der glatten Muskulatur Zellkontraktionen gestört wird.
      HINWEIS: Medikamente können an drei verschiedenen Stellen verabreicht werden: 1) serös durch die gewünschte Verbindung in das Krebs aufzulösen, die die Aufnahmekammer durchströmt, 2) direkt in das Organbad während vorübergehend die Perfusion gestoppt oder 3) intraluminal durch die Verbindung von Interesse Auflösen in die Krebs-Lösung in der Spritze Laufwerk. Desensibilisierung der afferenten Nerven kann auftreten, wenn kumulative Dosierungen einer Verbindung zu verabreicht werden schnell hintereinander.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Zweck gebauten Aufnahmekammer und Saugelektrode detaillierte Übersicht über die techni. cal Aufbau mit der Saugelektrode und der Aufzeichnungskammer statt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Repräsentative Tracing der In - vitro - Aufnahme von Jejunal afferente Aktivität Typische Aufnahme von jejunal Multi-Unit - afferenten Nervenaktivität (imp.sec -1) (oberes Feld) zu Beginn der Studie und als Reaktion auf 2 Rampe Dehnungen bis 60 mmHg. (unteres Bild) und die anschließende Identifizierung (wavemark Analyse) verschiedener Single-Einheiten im Nervensignal (drittes Feld). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Fig . 3: Neuroanatomie des Colon A) sensorischer Information aus dem Dickdarm wird über die Lenden colonic Nerven (LCN) in Richtung auf das Zentralnervensystem transportiert wird , mit der LCN in unmittelbarer Nähe der Arteria mesenterica inferior läuft (IMA). Ein Teil der Fasern aus dieser Lendenwirbel Kolon Nerv wird natürlich entlang der intermesenteric Nerv (IMN), um die Lenden splanchnici (LSN) zu bilden. Die mesenterica inferior ganglion (IMG) am Ursprung der IMA aus der Bauchaorta angeordnet. Distal von der IMG - Aufnahme ist obligatorisch sollten Forscher viscerofugal afferenten Nervenaktivität. B) eine schematische Übersicht der Versuchsaufbau studieren möchten. Afferenten Aufzeichnung des LCN wird in einem Organ sowohl mittels einer Saugelektrode verbunden mit dem Datenerfassungssystem durchgeführt. Rampe Distension kann beim Schließen der Auslaöffnung durchgeführt werden, während das Einströmen von fortKrebs - Lösung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Datenerfassung

  1. Notieren Sie sich die Nervenaktivität über eine Saugelektrode mit einem heads verbunden. Amplify (Verstärkung 10k) und filtern das Signal (Bandpass 500 - 5.000 Hz) 20.
    HINWEIS: A 50/60 Hz Schalldämpfers sollten im Versuchsaufbau einbezogen werden, um Signale zu entfernen, 50/60 Hz elektrische Störgeräusche. Das Signal wird automatisch digitalisiert und bei 20 kHz für die Analyse entnommen.

3. Analyse 5,20

  1. Berichten über die afferenten Nervenentladung als die Gesamtzahl der Impulse / Sekunde für den gesamten Nerven- oder spezielle Software verwenden, um eine weitere Analyse durchzuführen, als mehrgliedrige Aufnahmen Aktivitätsgesamtnervenaktionspotentiale unterschiedlicher Form, Amplitude und Breite enthalten, entsprechend verschiedenen Nerven Einheitenin jedem afferenten Fasern (Abbildung 2).
  2. Wer passt zu einzelnen wavemarks zu vordefinierten Vorlagen, so dass eine Unterscheidung zwischen einzelnen Einheiten. Vor Zuweisung einer Spitze bis zu einem gewissen Wellenzeichen, ein Signal-Rausch-Verhältnis von> 2: 1 sollte erzwungen werden.
    HINWEIS: Während der wavemark Analyse haben wir eine neue Vorlage zu konstruieren, wenn mindestens 10 ähnliche Spitzen durch die Analysesoftware identifiziert werden. Keine Vorlage für Formen seltener als 1 in 50 Spitzen konstruiert. Eine Spitze wird zu einer Vorlage angepaßten Hauptkomponentenanalyse zu verwenden, wenn mindestens 80% der Punkte auf der Schablone Spike identisch sind. Template Matching ist betreiberabhängig und sollte immer von der gleichen Forscher in verblindet durchgeführt werden.
  3. Berechnen der Aktionspotentialantworten durch die spontane Aktivität an der Basislinie subtrahiert wird (intraluminale Druck von 0 mmHg) aus der Reaktion während der Aufblähung zu festen Zeitpunkten (5 mmHg von Inkrement 0-20 mmHg intraluminalen Druck, Inkrementen von 10mmHg von 20 mmHg an). Messen Sie Entladung Basis zuführenden eine bin Größe von 10 Sekunden verwendet wird.
  4. Verwenden Sie die Single-Unit - Analyse zu Fasern klassifizieren basierend auf ihrer Entladeprofil während Rampe Aufblähung (Abbildung 4). Zusätzlich kann Single-Unit-Analyse, um die chemosensitiven Profil verschiedener Arten von Einheiten, da nicht alle Typen von Einheiten zeigt das gleiche veränderte Brenn Aktivität in Reaktion auf ein Arzneimittel oder eine Verbindung zu studieren verwendet werden.
  5. Klassifizieren Fasern als niedrige Schwellenfasern ( "LT", in der Regel auf den unteren Aufblähung Druck erhöht Entladung ausüben), hohe Schwelle Fasern ( "HT", üben erhöhte Entladung auf den höchsten Aufblähung Druck), einen großen Dynamikbereich Fasern ( "WDR", demonstrieren erhöht Brennen während der gesamten Rampe Aufblähung) oder mechanisch unempfindlich zuführenden ( 'MIA', Nervenfasern , die in der Regel nicht reagieren Dehnungen) 5 Rampe; 20.
  6. Express die Nerven Brennen Reaktion bei 20 mmHg als percentage der maximalen Brennverhalten während Aufblähung (LT%), da sie das Ausmaß des Brennens bei niedrigen Aufblähung Druck widerspiegelt.
    HINWEIS: Daher LT Fasern von einem LT%> 55% gekennzeichnet sind, während HT werden durch einen Wert von <15% definiert. Die Werte für die WDR-Einheiten im Bereich zwischen 15 und 55% (20). Ein MIA zeigt spontane zuführenden Brennen, die durch Dehnungen nicht beeinträchtigt wird.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Schematische Darstellung der verschiedenen Fasereinheiten Afferent auf der Basis ihrer mechanosensitiven Profileinheiten basieren auf dem Prozentsatz (LT%) eingestuft ihrer Feuerrate bei 20 mmHg Druck Dehnung im Vergleich zu der maximalen Brennverhalten während Aufblähung. Niedrigschwellige Fasern (obere linke Tafel) überwiegend eine erhöhte Nervenaktivität bei niedrigen Aufblähung Druck, was zu einem LT% von über 55% an. Hohe Schwelleneinheiten (oben rechtsPanel) im Gegenteil nur eine Erhöhung der Feuerrate bei schädlichen Druck (% LT <15) anzuzeigen. Großer Dynamikbereich Fasern (untere linke Tafel) während der gesamten Aufblähung (% LT im Bereich zwischen 15 und 55), einen allmählichen Anstieg der Nervenaktivität angezeigt werden, während mechanisch unempfindlich Fasern (unteres rechtes Bild) reagieren nicht Aufblähung Druck zu erhöhen. LT%: (zuführenden bei 20 mmHg / maximal zuführenden Brennen Brennen) Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Representative Results

Jejunal afferenten Nervenaktivität wurde zu Beginn der Studie gemessen und als Reaktion OF-1-Mäusen Aufblähung in 9 acht Wochen alte männliche Rampe. Die Tiere wurden in Gruppen in standardisierten Bedingungen (6 Tiere pro Käfig, 20-22 ° C, Luftfeuchtigkeit 40 - 50%, 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus) untergebracht ist mit unbegrenzten Zugang Wasser und regulärem Futter zu erschließen. Jejunumsegmenten der Mäuse zeigten unregelmäßige spontane afferente Entladung zu Beginn der Studie bei einem intraluminalen Druck von 0 mmHg (mittlere spontane Aktivität 11,47 ± 3,31 Imp / sec).

Die jejunal afferenten Nervenaktivität erhöht Rampe Dehnungen bei der Durchführung bis 60 mmHg auf. Typischerweise wird die Zunahme der afferenten Nervenaktivität nach dem Anstieg der intraluminale Druck wird durch eine biphasische Reaktion (5) gekennzeichnet, die aus einem anfänglichen schnellen Anstieg der Brenn Aktivität , bis der intraluminale Druck von 20 mmHg erreicht, which ist im Wesentlichen auf die erhöhte Feuerrate von niedrigen Schwellen Fasern zurückzuführen. Dies wird dann durch eine Plateauphase gefolgt, wonach ein zweiter Anstieg der Brenn Aktivität kann ab 40 mmHg beobachtet werden, die die Aktivierung von überwiegend hohen Schwellenfasern.

Basierend auf ihren Wellenformen können Einzeleinheiten in jedem Mehreinheitsaufzeichnungs diskriminiert werden und in einem der oben genannten vier Kategorien klassifiziert. In 9 Mäusen unterschieden wir 40 verschiedene Einheiten (4,44 ± 1,01 Einheiten / Nerven jejunal zuführenden) mit den LT - Einheiten , die am häufigsten diejenigen zu sein, gefolgt von WDR und HT - Fasern (Abbildung 6). Die Brenn Aktivität der verschiedenen Einheiten in Reaktion Distension Rampe kann in 7 beobachtet werden.

Abbildung 5
Abbildung 5: g> Mesenteriale afferente Entladung (imp.sec - 1). während der Rampe Aufblähung Wildtyp-Mäusen für die ganze Nerv während Ramp Aufblähung Wildtyp - Mäusen Mesenteriale Entladung Multi-Unit - afferente (Imp / s -1) in. Die Werte stellen den Mittelwert zuführenden Entladung ± SEM, n = 9 Mäusen. imp.sec -1:. Impulse pro Sekunde Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6:. Einzel Unit Distribution von 40 Einheiten Identifizierte in Jejunal Afferenzen von 9 Wildtyp - Mäusen HT: hohe Schwelle Faser, LT: niedrige Schwelle Faser, MIA: mechanisch unempfindlich Faser, WDR: einen großen Dynamikbereich Faser._blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7:. Pressure-Wirkungs-Kurven für die verschiedenen Arten von Untereinheiten in Wildtyp - Mäusen Die Single-Unit - afferente Entladung (imp.sec -1) aus den vier verschiedenen Einheiten , die identifiziert werden können, in Wildtyp - Mäusen während der Rampe Dehnungen. Eine niedrige Schwelle Faser (LT, obere linke Abbildung) durch einen anfänglichen schnellen Anstieg der Brenn Aktivität während der Dehnungen gekennzeichnet, während die hohe Schwellen Fasern (HT, linke untere Abbildung) nur Anzeige während der schädlichen intraluminale Druck erhöht Brennen. Großer Dynamikbereich Fasern (WDR, obere rechte Abbildung) zeigen einen stetigen Anstieg der Brenn Aktivität während des gesamten Aufblähung und mechano-insensitive Afferenzen (MIA, untere rechte Abbildung) reagieren nicht intraluminale Druck zu erhöhen. Werte repübel mittlere zuführenden Entladung ± SEM imp.sec -1:. Impulse pro Sekunde Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt eine reproduzierbare Labortechnik mesenteric afferenten Nervenaktivität bei Nagetieren zu studieren als 3,4,7,8,12,20,21,31 von unserer Gruppe und andere. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls gehören die schnelle Isolierung des Gewebes, das Streben des Nervenstrang in die Saugelektrode und die angemessene "Versiegelung" der Glaskapillare aus dem Organbad durch umgebende Fettgewebe in die Kapillare abgesaugt. Die Öffnung der Glaskapillare sollte genau bestimmt: eine Öffnung, die zu klein ist, wird das Streben des Nervenstrang in die Elektrode erschweren, während eine zu große Blende die "Versiegelung" der Kapillare mit Fettgewebe zu behindern, was zu redundanten Hintergrundrauschen, das die Analyse (Low-Signal-zu-Rausch-Aufnahmen) behindern. Damit für einen zuverlässigen Single-Unit-Klassifikation sollte splanchnic Afferenzen in verschiedenen Stränge aufgeteilt werden, um die zu reduzierenAnzahl der Einheiten in der Aufnahme. Normalerweise würden wir vorschlagen Ziel maximal 4 zu haben - in jeder Aufnahme 5 Einheiten. Die Forscher daher sollte die Blende einzustellen auf die Faser von Interesse basiert, und das Labor Tier, das angewendet wird.

Ein weiterer kritischer Punkt umfasst die ausreichende Erdung des experimentellen Aufbaus. Die Saugelektrode und Aufnahmekammer sollte ausreichend durch einen Faraday-Käfig, um elektrische Felder zu minimieren geerdet und abgedeckt werden störende, die die Analyse der neuronalen Aktivität behindern, wohingegen alle anderen Geräte einschließlich der Aufzeichnungsvorrichtungen, Spritzentreiber et cetera außerhalb des Käfigs eingebaut werden sollte, .

Durch die Aufzeichnung afferenten Nervenaktivität in der Nähe des Jejunum oder Kolon, kann man den ersten Teil der zuführenden Signaltransduktionskette isolieren und leicht den Beitrag und die Veränderungen untersuchen, die im alleinigen zuführenden Ebene auftreten, ohne Einmischung von der zentralen Nerven-ous System. Nur eine der Grenzen dieser Technik ist die Tatsache , dass in vitro Beobachtungen nicht immer leicht in die in vivo Umgebung hochgerechnet werden, da die in vitro Einrichtung eine Relaisstation in der komplexen Nervensignalkaskade enthält. Als solche muss ein umfassenderes Bild alle anderen Stationen gemacht werden , enthalten, wie zum Beispiel die Dorsalwurzelganglien, zentrales Nervensystem (zB funktionelle Bildgebung des Gehirns) und abwärts (inhibitorischen) efferenten Bahnen.

Ein weiterer Vorteil dieser Methode stellt den eher einfachen technischen Verfahren, wie man hat nicht mehr das Wohlbefinden des Versuchstier zu überwachen, die die Magen-Darm-Probe zur Verfügung stellt. Auf der anderen Seite ist die in - vitro - Messung der neuronalen Aktivität die Wirkung eines systemisch verabreichten Medikaments für die Aufklärung über afferente Entladung nicht geeignet, aber die Forscher theoretisch dieses Hindernis durch systemische Verabreichung des Arzneimittels o überwinden kannf Interesse an das Tier, gefolgt von der ex vivo in vitro Erfassung der afferenten Nervenaktivität. Allerdings sollte man auf die Tatsache aufmerksam, dass jedes Medikament in der Aufnahmekammer aufgrund der Badperfusion während der Präparation und nachfolgende Aufnahmen verdünnt wird. Schließlich Aufnahmen in vitro Splanchnicus Durchführung gentechnisch veränderten Tieren unter Verwendung könnte den Forschern ermöglichen , in vollem Umfang die Rolle der verschiedenen Kanäle und Rezeptoren auf Afferenzen ausgedrückt aufzuklären.

Forscher versuchen, diese Technik zu implementieren muss auch bedenken, dass die Identifizierung und Isolierung des mesenterialen zuführenden und Becken afferents offensichtlich Kenntnisse der grundlegenden Anatomie und technische Ausbildung erfordert, und Forscher sollten mit den grundlegenden Prinzipien der neuronalen Elektro vertraut sein.

Die In - vitro - Einstellung weiterhin ermöglicht es den Forschern leicht mögliche pharmakologische Teer zu identifizierenerhält, und liefert Erkenntnisse über die physiologische Rolle von neuronaler Aktivität sowie veränderte sensorische Signalgebung in mehreren Krankheitsprozessen.

Im Falle von jejunal zuführenden Messungen können mehrere Gewebesegmente von einem einzigen Tier gleichzeitig untersucht werden, ein Feature , das ziemlich schwierig ist , eine in vivo - Setup. Die Forscher sollten jedoch vorsichtig Ergebnisse aus verschiedenen Segmenten, die regionalen Unterschiede könnten Bias erzielten Ergebnisse zu interpretieren. Daher würden wir konsequent empfehlen afferenten Nervenaktivität aus dem gleichen Ort messen (zB erste Segment distal vom Treitz - Band oder der duodenojejunalis Biegung).

Typische aktuelle und zukünftige Anwendungen dieser Technik umfassen das Screening von pharmakologischen Verbindungen, die Sensibilisierung der mesenterialen Afferenzen bei Pathologien, die gekennzeichnet sind durch viszerale Überempfindlichkeit und Schmerzen verändern kann. Wie bereits zuvor erwähnt, das Ziel derse Verbindungen können irgendwo entlang der komplizierten Nervensystem angetroffen werden, die von dem magensaftresistenten intrinsischen Nervensystem zum Gehirn; als solche, die Charakterisierung und Aktivität afferente trägt zum Gesamtbild zu modulieren , die auch die Kalzium - Imaging der inneren magensaftresistente Nerven und Dorsalwurzelganglien, die Messung der viszeromotorische Reaktion als Indikator für viszerale Überempfindlichkeit in vivo und funktionelle Bildgebung des Gehirns umfasst, unter anderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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<em>In</em> - <em>vitro</em> - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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