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Neuroscience

마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

구 심성 신경은 정상적인 생리학에 관한 정보를 전달할뿐만 아니라, 방해 항상성 및 중추 신경계 향해 주변으로부터 다양한 기관계의 병리 생리 학적 과정의 신호뿐만 아니라. 이와 같이, 증가 된 활성 또는 장간막 심성 신경 '증감'내장 과민 복통 증후군의 병태 생리에서 중요한 역할을 할당하고있다.

장간막 구 심성 신경의 활동 목적 내장 기관 욕에 장착되고 이로부터 내장 신경은 연구자 직접 위장 세그먼트에 인접한 신경 활성을 평가할 수 있도록 격리 된 격리 장 세그먼트 시험 관내에서 측정 할 수있다. 활성은 세그먼트의 팽창 또는 전달 serosally intraluminally 또는 약학 화합물의 첨가 동안 다음, 표준 조건의 기준을 기록 할 수있다. 이 기술은 수연구자 쉽게 제어 표본 말초 신경계를 대상으로 약물의 효과를 연구하는 단계; 게다가, 그것은 질병 중에 변경하는 방법 신경 활동에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 이는 구 심성 신경 소성 활성을 측정하는 것은 전용 캐스케이드 시그널링 복잡한 신경 하나의 중계국을 구성하고, 연구자들은 다른 레벨 (예컨대, 후근 신경절, 척수 또는 중추 신경계에서 신경 세포 활성도를 간과 숙지하지 부담해야하지만 유의해야 ) 완전히 건강과 질병의 복잡한 신경 생리학을 명료하게하기 위해서입니다.

일반적으로 사용되는 응용 프로그램은 리포 폴리 사카 라이드의 관리에 응답하여 신경 활동의 연구 및 과민성 대장 증후군의 동물 모델에서 구 심성 신경 활동의 연구를 포함한다. 더 병진 방법에서, 고립 된 마우스 장 세그먼트는 IBS 환자로부터 대장 상층 액에 노출 될 수있다. 또한, 변형이 기술의 최근 인간 결장 시험편에 적용하는 것으로 나타났다.

Introduction

감각 신호와 고통의 인식은 구 심성 신경, 척수 신경, 상승 및 하강 facilitatory 및 억제 경로 및 여러 가지 뇌 영역 사이의 복잡한 상호 작용의 결과 복잡한 과정이다. 따라서,이 수준 중 하나 이상에 변경 사항이 변경된 감각 신호와 질병 상태에서 내장 통증의 원인이 될 수 있습니다. 감각 신호 여러 기술이 모든 다양한 측면을 연구하기 위해 단일 세포 실험에 이르기까지 개발되고있다 (예를 들어, 신경 세포에 칼슘 이미징) 전체 동물 모델 (예를 들어, 같은 내장 운동 응답으로 행동 반응). 이 문서에 설명 된 기술은 연구자가 특별히 설치류에서 소장 또는 대장의 고립 된 세그먼트에서 시험관 내에서 구 심성 신경의 활동을 평가할 수 있습니다. 즉, 고립 위장 세그먼트는 (일반적으로 소장 또는 대장) 생리적 K와 관류 목적 내장 기록 챔버에 장착남군 솔루션입니다. 내장 신경 무연 해부 및 골반 내장의 또는 구심 신경의 구 심성 신경 활성의 등록을 허용하는 전극에 접속된다. 신경 활동 basally하거나, 또는 (점막)이 관내 관류 통해 기록 실 (serosally)에 직접 적용될 수 관내 압력 및 / 또는 약학 적 화합물의 증가에 응답 심성 방전 1-6에 미치는 영향을 평가하기 위해 기록 할 수있다 . 참고로, 내장의 신경은 원심성 섬유와 감각 구 심성에 추가 viscerofugal 구 심성이 포함되어 있습니다. 생체 내장 신경 기록의 주요 이점 중 하나는 연구자 신경 활성에 국소 도포 화합물의 직접적인 영향을 연구하기 위해 하나를 허용하는 중추 신경계에서 변조 또는 입력없이 신경 활성을 정량화 할 수 있다는 사실이다. 생체 내 방법을 사용하여 필요한만큼 또한, 중요 파라미터들의 모니터링은 N이다 (아래 참조)O 이상 관련. 시험관 내장의 기록이 최종적으로 더 적은 시간이 소요의 생체 대응보다.

이러한 점막 쓰다듬어 다른 자극, 본 프레이 모발을 사용하여 프로빙 또는 세그먼트의 연신에 응답하여 구 심성 신경의 활동은 창자 조직 아래 피닝과 대조적이다 (세로 방향으로 개방되는 개질 실험 구성에서 연구 될 수있다 로 이전 문제 7, 8에 설명 된)을 그대로 세그먼트를 사용하여 우리의 설치. 또한, 최근, 기술이 다시 길이 방향 세그먼트 (9)를 열어 아래로 고정하여 칼슘의 이미징 (imaging)을 통해 결장 벽 자체 결장 심성 신경 활성을 연구하기 위해 기술되었다.

생체 기술의 또 다른 버전은 척수에 구 심성의 항목 근처 신경 세포의 활성화를 측정 밖으로 구성되어 있습니다. 즉, 진정 동물이 발생하기 쉬운 위치, 전자에 위치건설 후궁 절제술의 수단으로 관심 프로젝트되는 구 심성 신경에 요천 추부 척수를 xposing 파라핀 충전 절개의 피부를 사용 백금 양극 전극 (10, 11)를 통해 지느러미 어린 뿌리를 드레이프 잘. 이 기술은 또한 연구자들은 얇게 유수 Aδ - 섬유 수초 C-섬유를 자신의 전도 속도에 따라 섬유의 특징과 구별 할 수 있습니다. 또한, 지느러미 작은 뿌리는 독점적으로 앞서 언급 한 혼합 구 심성 및 원심성 내장의 신경 대조적으로, 감각 구 심성 섬유를 포함하고있다.

절연 장 세그먼트에서 시험관 내에서 구 심성 신경 방전 기록은 독립적으로 인간의 절제에서 대장 구 심성 신경의 활동을 기록하는 최초의 남자 원고는 12, 13을 표본 게시 된 두 개의 연구 그룹으로, 인간의 표본을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 구현을보다 용이하게 발생할 수 translati인간적 상태로 쥐의 데이터에, 연구자 쉽게 감응 감각 신경을 대상으로 약물을 식별 할 수 있습니다. 구 심성 신경의 활동뿐만 아니라 과대 구 심성 신경의 활성을 표적으로 새로운 치료 시약의 발견을 특성화의 임상 중요성은 정교 필드 14-19 많은 전문가들이 논의되어왔다.

상기 시험 관내 기술은 더 일반적 심성 신경 활성의 생체 측정에 공지 보완한다. 생체 내에서 신경 세포 활성도를 측정하는 동안, 신경 활성을 주목 세그먼트 삽관이어서 식별되는 동안의 마취 동물에서 직접 측정 할 수 있고, 유동 파라핀 채워진 웰 설치류 20 복벽 및 피부를 사용하여 구성된다. 관심의 구 심성 신경이어서 신경 활동 measuremen 있도록, 식별 단면 바이폴라 백금 전극 상에 배치되고티. 이 기술은 진정 동물이기는하지만 생활에 구 심성 신경 활성을 조절하는 연구를 할 수 있습니다; 예로서, 하나는 내강 팽창 또는 화합물의 정맥 내 투여와 같은 간섭에 응답 신경 활동을 연구 할 수있다.

중개 연구는 오늘날 주로 인간 유래 상청액의 적용에 중점 (예., 결장 생검 재배 말초 혈액 단핵 세포 등으로부터) jejunal 및 / 또는 구 심성 결장 마우스 (21, 22)에. 점막 응용 프로그램 대 장막의 차동 효과는 구 심성 신경 방전에 공부를 할 수 있도록 연구자가 직접 장기 욕조에 또는 장 세그먼트를 관류되는 관내 솔루션으로 하나 상층 액을 적용 할 수 있습니다. 이와 같이, 마우스 대장 구 심성, 기니 돼지 점막 밑 신경 세포 및 마우스 등의 루트에 과민 반응을 일으킬 수 과민성 대장 증후군 환자에서 그 대장 점막 조직 검사 supernatans를 줬습니다신경절 신경 세포 21,23,24.

마지막으로, 신경 세포의 활동을 기록하는 장간막 제한 및 / 또는 골반 신경은 위장관에 분포되어 있지 않습니다. 기타 신경 녹음 무릎 관절 (25)에 공급 구 심성에서 수행 될 수있는 다른 사람도 26-28 블래 구 심성 신경의 활동을 특징 짓는 반면, 증명 및 방광, 골반 심성뿐만 아니라 위장관 가능성 신경 결과 수렴한다는 증명 크로스 토크 29.

Protocol

아래에 설명 된 모든 동물 실험은 의료 윤리위원회와 앤트워프 대학 (파일 번호 2012-42)에 실험 동물의 사용에 의해 승인되었다.

1. Jejunal의 조직 준비 및 대장 구 심성 신경

  1. jejunal 구 심성 신경의 준비
    1. 지역 윤리위원회의 사전 실험에 승인 된 청소년 또는 성인 설치류의 쥐 안락사를 수행합니다 (예., 심장 천공, 자궁 경부 전위 뒤에 단말기 진정 작용).
      참고 : 조직은 추가로 시험 관내에서 처리 될 때 상기 마취 또는 수술 치료를 필요로하지 않고, 따라서 실험 결과 동물을 희생 경추 탈구를 사용했다.
      참고 : 나이는 장간막 구 심성 mechanosensory 기능 (30), 우리는 따라서 기간 동안 특정 연령 그룹을 준수 연구자 조언을 감쇠하는 것으로 나타났다하나의 실험.
    2. 앙와위에서 희생 실험 동물을 놓고 치골까지 xyphoid 과정에서 연장 메스를 사용하여 피부와 복부 근육 층을 통해 복부 정중선 절개를 수행합니다.
    3. (크렙스 조성물 마르지 복강 내 조직을 방지하기 위해서, 감기 크렙스 용액으로 복강 목욕 : 120.03 mM의 염화나트륨, 6.22 mM의 KCl을을 1.57 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 15.43 밀리미터의 NaHCO3, 1.21 mM의 황산, 11.52 D mM의 글루코스 및 1.52 mM의 CaCl2를).
    4. 신속하게 주변 구조물이 손상되지 않도록주의를 복용하고, 그대로 jejunal 혈관과 구 심성 신경을 포함하는 대장의 장간막을 유지, 바로 말단으로 duodenojejunal 굴곡의 시작 소장의 약 20 cm의 절개로 날카로운 가위를 사용하여 전체 공장을 절제.
      참고 : 복강에 불과 jejunal 절개를 들어, 하나는 사용하지 않습니다이 아니라 실체가 용이하게 육안으로 가시화 될 수있다.
    5. 빙냉 크렙스 용액에 절제 소장 놓고 carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)에 연속적으로 크렙스 용액을 산소화 동안 얼음에 보관.
    6. 약 3 cm 긴 루프에서 날카로운 가위로 공장을 잘라. 어딘가에 각 루프의 중심 근처에 혈관과 내장 신경이 들어있는 장간막 번들을 준수하십시오.
    7. 내강 콘텐츠를 분리하고 이들 시험 관내 조직 샘플의 열화를 가속화 소화 효소를 포함하는 유미 즙으로 무딘 카테터를 사용 크렙스 용액으로 각 세그먼트 플러시.
      참고 : 융모의 파괴는 구 심성 신경의 활동을 변경할 수 있습니다 매개체의 방출 될 바와 같이, 세척시 루프의 루멘이 손상되지 않도록주의하십시오.
    8. 구 심성 신경 활동을 측정하는 세그먼트를 식별합니다 (예를 들어, 첫 번째 jejunal 61000-4-3 구분NT 말단 실리콘 탄성 중합체 층으로 코팅 된 특수 제작 기록 챔버 내에서의 트라 인츠 인대 또는 duodenojejunal 굴곡) 장소의이.
      참고 : 공장의 시작은 해부학 트라 인츠의 인대가 소장을 통과 소장의 일부로 정의, 또한 duodenojejunal 굴곡했다.
      주 : 웰 실험을 시작하기 전에 미리 얇은 실리콘 엘라스토머 층과 상기 기록 챔버의 바닥 커버. 이 탄성 중합체 층의 제조는 제조업체의 지침 1에 따라 수행되어야한다.
    9. 끊임없이 온난로 관류 챔버를 10 ㎖ / 분의 속도로 크렙스 용액 carbogenated 34 ° C에서 기록 챔버 상수 크렙스 '온도를 유지한다.
    10. 경구 단부 내강 흐름과 반구 단부 유출에 연결을 제공하는 주사기 구동기에 접속되도록 기관 용기에 jejunal 세그먼트를 탑재. 약간 일세그먼트를 구역질하지만 과도한 장력을 발휘 않도록주의하십시오. 모두 단단히 IN- 및 유출 포트 4/0 실크 합자를 사용하여 종료 연결합니다.
    11. 구강 단부 주사기 구동기를 장착 한 10 ㎖ / hr의 속도로 intraluminally 크렙스 용액 (비 산소, 주위 온도)와 jejunal 세그먼트 관류.
    12. 곤충 핀을 사용하여 실리콘 엘라스토머 바닥 층에 대한 마운트 장 세그먼트 평면의 장간막 핀. 장간막 번들의 시각화를 최적화하기 위해 장간막을 스트레칭; 번들 또는 공장에 부담을주지 않습니다.
    13. 출력 포트를 닫아서 테스트 램프 팽만 (보라 적외선)을 수행 장 세그먼트의 관내 압력은 관내 크렙스 솔루션이 탑재 된 세그먼트에서 유출되지 않았 음을 확인하기 위해 60 mmHg로 도달 할 때까지. 중단없이 관내 압력의 부드러운 상승을 관찰한다.
    14. 세그먼트의 작은 수축을 관찰 (연동 WAVES) 초기 팽창 단계 동안. 필요한 경우, 크렙스 용액으로 L 형 칼슘 채널 차단제 니페디핀 1 μM을 첨가하여 활성을 차단 연동.
      주 : 니페디핀 이외에 크렙스 용액으로 1 μM 아트로핀 추가 완전히 장 구간을 마비된다. 그러나 우리는 구 심성 신경 기록에 아트로핀의 사용과 효과 개인적인 경험이 없다.
    15. 실체 현미경에서 부드럽게 부드럽게 지방 조직에 묻혀 거짓말 선박 및 구 심성 신경이 손상되지 않도록주의하면서, 두 개의 작은 핀셋으로 잡아 당 겼하여 장간막의 지방 조직을 벗겨 시작합니다.
    16. 소장으로부터 먼 거리에서 시작하고 장간막 다발 모두 혈관 노출.
    17. 지방 조직에서 캡슐화 된 얇은 흰색 스레드로 두 선박 사이의 구 심성 jejunal 신경을 준수하십시오. 만 부드럽게 핀셋을 사용해서 멀리 지방 조직을 박리하여 공장을 향해 더 근위 해부장간막 혈관 및 / 또는 구 심성 신경 모두 초기 식별은 곤란하다.
    18. 신경에 대한 지방 조직의 부착 성을 제거하여 수 mm의 거리에 여유 세그먼트의 jejunal 장간막 신경 해부.
    19. 날카로운 조직 가위를 사용하여 신경을 가로로 쪼개다. 필요한 경우 부드럽게 작은 핀셋을 당기는하여 나머지 지방과 연결 조직뿐만 아니라 epineuronal 피복을 벗겨.
    20. 미세 조작기를 사용하여, 장기 욕에 플런저와 주사기에 연결된 흡입 전극의 선단을 낮출; 그리고, 상기 플런저를 조작하여 부드럽게 전극의 선단이 크렙스 용액 (도 1)에 침수되도록 기관 욕 일부 크렙스 용액 대기음. 크렙스 용액 흡입 전극 내부의 와이어 전극을 덮도록 보장한다.
      주 : 우리 실험의 개시 이전에 와이어 전극을 포함하는 붕규산 유리 모세관 흡입 준비피펫 풀러를 보내고.
    21. 바로 옆에 횡단 구 심성 신경 가닥에 흡입 전극의 끝 부분을 놓고 전체 길이에 걸쳐 모세관에 횡단 신경 가닥을 그립니다.
    22. 일부 지방 조직으로 전극의 끝 부분을 기동 단단히, 플런저로하여 기계적으로 '밀봉'장기 목욕의 내용에서 모세 혈관의 신경을 흡입하는 동안 유리 모세관에이 대기음.
    23. (보라 적외선)을 소성 심성에서 램프 팽창 유도 증가를 수행하여, 데이터 수집 시스템을 이용하여 구 심성 신경의 활동 등의 기록을 확인한다. 흡입 전극으로 신경의 분리 이후, 실제의 실험을 수행하기 전에 정상 상태 자연 구 심성 신경 활성을 획득하기 위해 15 분 동안 제제를 안정화.
    24. 램프 팽만을 수행하기 래드 선도 출력 포트를 폐쇄함으로써 장내 세그먼트 넓히다(60 mmHg로까지) 장 세그먼트의 압력 연간 상승. 만 (15 분 간격) 세 개의 연속 램프 distensions는 재생 가능한 멀티 유닛 방전 (그림 2)을 수득 원하는 실험 프로토콜을 수행합니다.
  2. 요추 내장의의 구 심성의 제조 (대장 구 심성 신경)
    참고 : 대장 구 심성 신경의 해부는 자세한 절개가 필요합니다. 전 'jejunal'프로토콜의 편차는 다음과 같습니다 :
    1. 복강에 얼음처럼 차가운 크렙스 솔루션을 부어 과도하게 인도적인 방법에 의해 동물을 안락사 앙와위에 배치, 정중선 개복술을 수행합니다. 참고 크렙스 조성물 118 mM의 염화나트륨, 4.75 mM의 KCl을, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 22의 NaHCO3, 1.2 mM의 황산, 11 mM의 D 글루코오스 및 2.5 mM의 CaCl2를 3 μM 인도 메타 신.
      참고 : 크렙스 솔루션의 변경 구성을 참고; 인도 메타 신은 너무에 추가프로스타글란딘에 의해 구 심성 신경 활성의 변화를 방지하기 위해 lution.
    2. 지방 조직, 방광 및 내부 생식기를 폐기하고, 부드럽게 복강 한쪽에 작은 창자를 이동. 복부에서 그대로 장간막 신경과 대장의 말단 부분의 연장 prelevation을 수행합니다.
      참고 : 조직의 더 준비를 돕기 위해이 해부에 포함될 수있는 중요한 랜드 마크는 복부 대동맥과 대정맥, 왼쪽 신장과 골반 바닥 근육을 포함한다.
      참고 :이 영역은 요추 내장의 신경을 포함로 해부하는 동안, 콜론과 복부 대동맥 사이의 연결 조직에 견인을 발휘 않도록주의하십시오.
    3. 챔버 기록 늘어선 실리콘 엘라스토머 내로 조직 세그먼트를 전송합니다. 출발점으로, 복부 대동맥에서 유래 좌 신장 혈관을 사용한다. 우수한 mesenteri 발생의 반구 방향으로 복부 대동맥을 따라복강 및 상 장간막 신경절과 함께 C 동맥. 마지막으로, 관심의 신경이 위치하고, 상기 대장 대동맥의 말단 부분 사이의 연결 조직에 도착.
    4. 복부 대동맥에서 발생하는 하부 장간막 동맥을 확인합니다. 요추 내장의 구 심성 신경은 하부 장간막 동맥의 기지에서 식별 할 수 있습니다; 그것은 동맥 (그림 3)에 병렬로 실행됩니다.
    5. 신경의 절개 후, 조심스럽게 주위의 결합 조직 피복을 벗겨 여러 미세 스레드에 신경을 애타게. 결장에서 안전 거리를 유지해야합니다.
    6. 흡입 전극, '실'이전에 설명하고 원하는 실험 프로토콜을 수행 할 때 지방 조직을 둘러싼 모세관에이 하나의 스레드 중 하나를 그립니다.
    7. 오르간 조 (예를 들어, 신장, 복부 혈관, 근육 조직)와,에 존재하는 불필요한 조직 폐기이러한 구 심성 신호를 방해 할 수있다이야.
      주 : 니페디핀 (1μM)의 의한 평활근 수축에 구 심성 신경 신호가 자발적 장내 이동에 의해 방해되는 경우에, 크렙스 용액에 첨가 될 수있다.
      주 3) intraluminally 관심있는 화합물을 용해시켜 1) serosally 일시적 혈류 중단 동안 또는 2)에 직접 기관 욕에 기록 챔버를 관류되는 크렙스로 목적 화합물을 용해 : 약물은 세 개의 다른 부위에 투여 할 수있다 주사기 드라이브에 크렙스 솔루션으로. 화합물의 누적 투여 량은 연속적으로 너무 빨리 투여 할 때 구 심성 신경의 탈감작가 발생할 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : 목적 내장 된 녹음 회의소 및 흡입 전극의 도식 개요 TECHNI의 자세한 개요. 흡입 전극과 장소에 기록 챔버와 칼 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Jejunal 구 심성 신경 활동의 체외 기록의 대표 추적베이스 라인에서 2 램프 distensions 최대까지 60 mmHg의 질문에 답변 jejunal 멀티 유닛 구 심성 신경 활동 (imp.sec -1) (상단 패널)의 전형적인 기록. (하단 패널) 및 신경 신호 (제 3 패널)에서 다른 단일 단위의 후속 식별 (wavemark 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 콜론 (A)의 신경 해부학) 대장에서 감각 정보는 LCN이 열등 장간막 동맥 (IMA)에 근접 실행하는 중추 신경계를 향해 허리 대장 신경 (LCN)를 통해 전달된다. 이 요추 결장 신경에서 섬유의 일부는 물론 intermesenteric 신경 (IMN)을 따라 요추 내장의 신경 (LSN)를 형성하는 것입니다. 하부 장간막 신경절 (IMG)은 복부 대동맥에서 IMA의 기원에 있습니다. 말단으로 IMG의 녹화 연구자 viscerofugal 구 심성 신경 활동. 나) 실험 장치의 개략도를 공부하고자해야 필수입니다. LCN의 구 심성 기록은 데이터 수집 시스템에 접속 된 흡인 전극에 의해 기관 모두에서 수행된다. 유입을 계속하면서 램프 팽만은 출구 포트의 폐쇄시에 수행 될 수있다크렙스 솔루션입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 데이터 수집

  1. headstage에 연결된 흡입 전극을 통해 신경 활동을 기록합니다. 20 - 신호 (5000 Hz의 대역 통과 500)를 증폭 (10,000 이득) 및 필터링합니다.
    참고 : 50 Hz의 잡음 제거기는 50 Hz에서 전기적 간섭 잡음 신호를 제거하기 위해 실험 구성에 포함되어야한다. 신호는 디지털화 및 자동 분석 20 kHz에서 샘플링된다.

3. 분석 5,20

  1. 전반적인 신경 활동의 멀티 유닛 녹음은 다른 모양, 크기 및 폭의 활동 전위를 포함하는 서로 다른 신경에 해당하는 전체 신경에 대한 전반적인 충격의 수 / 두 번째로 구 심성 신경 방전을 신고 또는 추가 분석을 수행 할 전문 소프트웨어를 사용하여 단위각 구 심성 섬유 (그림 2).
  2. 단일 단위 사이의 차별을 허용하는 미리 정의 된 템플릿 개별 wavemarks을 맞 춥니 다. 한 적용한다 : 특정 파장 마크, 2>의 신호대 잡음비 스파이크 할당 전에.
    참고 : 최소 10과 비슷한 스파이크는 분석 소프트웨어에 의해 식별되는 경우 wavemark 분석하는 동안, 우리는 새로운 템플릿을 구성. 어떤 템플릿은 50 스파이크 1보다 희귀 한 모양을 위해 구성되지 않습니다. 스파이크는 그 포인트의 적어도 80 %가 템플릿 스파이크 동일 주성분 분석을 사용하여 템플릿 매칭된다. 템플릿 매칭 오퍼레이터 의존적이며, 항상 맹검 방식으로 같은 연구가 수행되어야한다.
  3. 고정 된 시점에서 팽창 (0 내지 20 mmHg의 관내 압력의 증가는 5mmHg의 동안 반응에서 (0 mmHg로의 관내 압력) 기준선의 운동량을 뺌으로써 (10)의 간격을 활동 전위 반응을 계산mmHg로) 이후 20 mmHg로에서. 10 초의 빈 크기를 이용하여 기준 심성 방전을 측정한다.
  4. 램프 팽창 (그림 4) 동안 자신의 방전 프로파일을 기반으로 섬유를 분류하는 하나의 단위 분석을 사용합니다. 또한, 단일 유닛 분석 장치의 모든 유형의 약물 또는 화합물에 반응하여 동일한 소성 변형 작업이 표시되는 바와 같이, 장치의 다른 유형의 chemosensitive 프로파일을 연구하는데 이용 될 수있다.
  5. 낮은 임계 섬유 ( 'LT', 낮은 팽창 압력에서 일반적으로 증가 발휘 방전), 높은 임계 섬유 ( 'HT', 가장 높은 팽창 압력에서 증가 방전을 발휘), 넓은 동적 범위 섬유 ( 'WDR'등의 섬유를 분류, 설명 전체 램프 팽창 동안 증가 발사) 또는 기계적으로 문자를 구분하지 심성 ( 'MIA', 일반적으로 distensions을 램프에 반응하지 않는 신경 섬유) 5; 20.
  6. 상기 p-으로 20 mmHg로의 신경 발사 응답을 표현그것은 낮은 팽창 압력이 소성의 정도를 반영로 팽창 (LT %)을하는 동안, 최대 소성 반응 ercentage.
    주 : 따라서, LT 섬유가 HT 반면 LT %의> 55 %에 의해 특징이 <15 %의 값으로 정의된다. WDR 단위의 값은 15 55 % (20)의 사이 범위. MIA는 distensions 영향을받지 않습니다 자연 심성 발사를 표시합니다.

그림 4
그림 4 :. 그들의 Mechanosensitive 프로필에 기초하여 다른 수입 성의 섬유 단위의 도식 표현 단위는 팽창시 최대 발사 응답에 비해 20 mmHg로의 팽창 압력에서 자신의 발사 속도의 비율 (LT %)을 기반으로 분류된다. 낮은 임계 섬유 (왼쪽 패널) 주로 55 % 이상 LT %의 결과, 낮은 팽창 압력에서 증가 된 신경 활동을 표시합니다. 높은 임계 단위 (오른쪽 위반대로 패널) 만 유해 압력에서 (% LT <15) 속도를 소성 증가를 표시. 기계적 둔감 섬유 (하단 우측 패널)의 팽창 압력의 증가에 반응하지 않는 반면, 넓은 동적 범위 섬유 (하부 좌측 패널) 전체 팽창 동안 신경 활성의 점진적인 증가 (15과 55 사이의 범위 %의 LT)을 표시. LT % (심성이 20 mmHg로 / 최대 심성 발사에서 소성) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Representative Results

Jejunal 심성 신경 활성을 기준으로 측정 한 응답 OF-1 생쥐 9 8 주 된 수컷의 팽창을 진입로. 물과 일반 우를 활용할 무제한 액세스 할 수있는 동물은 표준화 된 조건 그룹 (50 %, 12 시간 명암주기 - - 22 ° C, 습도 40 케이지 당 6 동물 20)을 수용했다. 마우스의 Jejunal 세그먼트 (자발적인 활동을 11.47 ± 3.31 꼬마 도깨비 / 초를 의미) 0 mmHg로의 관내 압력 기준에서 불규칙한 자연 구 심성 신경 방전을 표시.

jejunal 구 심성 신경의 활동이 60 mmHg로까지 램프 distensions을 수행시 증가했다. 일반적 관내 압력의 증가는 다음의 구 심성 신경의 활동 증가가 관내 압력이 20 mmHg로 도달하기까지까지 소성 활성 초기의 급속한 증가로 구성 이상성 응답 (도 5)에 의해 특징되어 whicH는 주로 낮은 임계 섬유의 증가 연소율에 기인 할 수있다. 이 후, 소성 활성 번째 증가가 주로 높은 임계 섬유의 활성화를 나타내는 전방으로 40 mmHg로 관찰 할 수있는 후 고원 단계로 이어진다.

이들 파형에 기초하여, 단일 유닛은 각각 복수의 단위 기록에서 구별 될 수 있으며, 상기 네 개의 카테고리 중 하나로 분류 하였다. 9 마우스, 우리는 WDR 및 HT 섬유 (그림 6) 다음에 가장 널리 사람을, 인 LT 단위로, 40 다른 단위 (4.44 ± 1.01 단위 / jejunal 구 심성 신경을) 차별. 팽만을 램프에 응답하여 상기 다른 장치의 사격 동작은도 7에서 관찰 될 수있다.

그림 5
그림 5 : g> 장간막 구 심성 신경 방전 (imp.sec - 1). 전체 신경에 대한 램프 팽창 동안 야생형 생쥐의 램프 팽창하는 동안 야생 형 마우스의 장간막 멀티 유닛 구 심성 신경 방전 (꼬마 도깨비 / 초 -1). 값은 9 마우스를 SEM ± 평균 심성 방전을 나타내고, n은. imp.sec -1 :. 초당 충동 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 9 야생 형 마우스에서 Jejunal 구 심성 신경에서 확인 된 40 단위의 단일 단위 유통 HT : 높은 임계 섬유, LT : 낮은 임계 섬유, MIA : 기계적으로 문자를 구분 섬유, WDR : 넓은 동적 범위 섬유."_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
도 7 :. 야생형 마우스의 서브 유닛의 종류에 대한 압력 - 반응 곡선 단일 유닛 심성 신경 방전 (imp.sec -1) 램프 중, 야생형 마우스에서, 식별 될 수있는 네 개의 다른 유닛들로부터 distensions. 낮은 임계 섬유 (LT, 왼쪽 그림은) 만 표시가 유해 관내 압력 동안 소성 증가 높은 임계 섬유 (HT, 왼쪽 그림) 동안, distensions 동안 소성 활동 초기 급속한 증가에 의해 특징입니다. 넓은 동적 범위 섬유 (WDR, 오른쪽 그림) 관내 압력의 증가에 응답하지 않는 전체 팽창 동안 소성 활동이 꾸준히 증가하고 메카를 구분 구 심성 섬유 (MIA, 오른쪽 그림)을 보여줍니다. 값 담당자SEM imp.sec -1 ± 평균 심성 방전을 원망 :. 초당 충동 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 논문의 프로토콜은 우리 그룹과 다른 3,4,7,8,12,20,21,31에 의해 사용되는 설치류에 장간막 구 심성 신경의 활동을 연구하기 위해 재현 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 조직의 신속한 분리, 흡착 전극에 신경 가닥의 흡입 모세관으로 주변 지방 조직을 흡인하여 기관 조에서 유리 모세관의 적절한 '밀봉'를 포함한다. 유리 모세관의 개구가 정확하게 결정되어야한다 : 너무 넓은 개구 지방 조직과 모세 혈관의 '밀봉'을 저해하는 반면 너무 작은 구멍 중복 결과, 전극에 신경 가닥의 흡입을 복잡하게 분석 (낮은 신호대 녹음)을 저해 할 것이다 백그라운드 노이즈. 안정적인 단일 유닛 구분을 허용하기 위해, 내장의 구 심성 신경은을 감소시키기 위해 여러 가닥으로 분할되어야기록에 단위의 수입니다. 각 기록 단위 5 - 일반적으로, 우리는 (4)의 최대 값을 갖도록 목표 제안했다. 연구팀은 따라서 관심의 섬유에 따라 조리개 및 적용되는 실험 동물을 조정해야한다.

또 다른 중요한 점은 실험 장치의 충분한 접지를 포함한다. 흡입 전극 기록 챔버 적절히 접지 및 기록 장치를 포함하여 다른 모든 장비 반면 주사기 드라이버 등등 케이지 외부에 설치되어야하며, 신경 활성의 분석을 방해 전기장 간섭 최소화하기 위해 패러데이 케이지 적용되어야 .

소장 또는 대장에 근접 구 심성 신경의 활동을 기록함으로써, 하나의 구 심성 신호 전달 체인의 첫 번째 부분을 분리하고 쉽게 중앙 네르 간섭없이 단독 심성 수준에서 발생할 기여도 및 변형을 연구 할OU를 시스템. 이 기술의 한계 중 하나는 체외 설치 만 복소 신경 신호 전달 캐스케이드 하나의 중계국을 포함 시험관 관측 항상 생체 설정 어려움 외삽 될 수 없다는 사실이다. 따라서, 더 넓은 그림 같은 지느러미 루트 신경, 중추 신경계 (예를 들어, 기능적 뇌 영상)과 하강 (억제) 원심성 경로 다른 모든 스테이션을 포함해야합니다.

하나가 더 이상 위장 표본을 제공하는 실험 동물의 복지를 모니터링하는 없으므로이 방법의 또 다른 장점은 비교적 간단 기술적 과정을 구성한다. 한편 신경 활성의 생체 외 측정 심성 신경 방전의 전신적 투여 약물의 영향을 해명하기에 적합하지 않지만 연구자들은 이론적 전신 약물 O 투여하여 장애물을 극복 할 수있다구 심성 신경 활성의 생체 외 시험 관내 기록 하였다 동물에게 F 관심. 그러나, 하나 기록 챔버 내의 임의의 약물이 본 절개 이후 녹음 중에 욕 재관류에 의한 희석 될 수 있다는 사실에 배려해야한다. 마지막으로, 시험관 내에서 유전자 조작 동물을 사용하여 내장 신경 녹음을 수행하는 연구자가 완전히 구 심성 섬유에 표현 된 다른 채널과 수용체의 역할을 규명 할 수 있었다.

연구원은 또한 장간막 구 심성과 골반 구 심성의 식별 및 분리가 분명 기본적인 해부학과 기술 교육의 지식이 필요합니다 명심해야이 기술을 구현하는 시도, 연구자는 신경 세포의 전기 생리학의 기본 원리를 알게되어야한다.

체외 설정은 또한 연구자가 쉽게 가능한 약물 타르를 식별 할 수 있습니다도착, 여러 질병 과정에 신경 활동뿐만 아니라 변경 감각 신호의 생리 학적 역할에 대한 통찰력을 제공합니다.

jejunal 심성 측정의 경우, 하나의 동물 조직의 몇몇 세그먼트들은 동시에 생체 설정하여 다소 어려운 특징을 조사 할 수있다. 연구진은 그러나 조심스럽게 지역적 차이 수 바이어스 결과로, 다른 세그먼트에서 얻은 결과를 해석해야한다. 그러므로 우리는 지속적으로 같은 사이트 (말단 트라 인츠의 인대 또는 duodenojejunal 굴곡에서 예를 들어, 첫 번째 세그먼트)에서 구 심성 신경 활동을 측정하는 것이 좋습니다.

이 기술의 전형적인 현재와 미래의 응용 프로그램이 내장 과민성 통증을 특징으로 병리 동안 장간막 구 심성의 과민성을 변경할 수 있습니다 약리 화합물의 심사를 포함한다. 이미 이전의 목표를 언급셀레늄 화합물은 뇌 장용성 극한 신경계에서부터 복잡한 신경계 따라 어딘가에 발생 될 수있다; 특성화 또한 극한 장용성 신경 후근 신경절 칼슘 이미징을 포함 광범위한 화상에 기여 심성 신경의 활성을 조절, 예로서, 생체 내에서 내장 과민증 표시기 기능적 뇌 영상으로서 내장 운동 응답의 측정 다른 사람의 사이에서.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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References

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마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 <em>생체 외 녹음에서</em>
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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