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Neuroscience

In Vitro A gravação de mesentérica aferentes a atividade do nervo no mouse jejuno e segmentos do cólon

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

nervos aferentes não só transmitir informações sobre a fisiologia normal, mas também sinalizar homeostase perturbado e processos fisiopatológicos dos diferentes sistemas de órgãos da periferia para o sistema nervoso central. Como tal, o aumento da actividade ou "sensibilização" de nervos aferentes mesentéricos foi atribuído um papel importante na patofisiologia da hipersensibilidade visceral e síndromes de dor abdominal.

Actividade do nervo aferente mesentérica pode ser medida in vitro em um segmento intestinal isolado que é montado em um banho de órgãos, construído para e a partir do qual o nervo esplânenico é isolado, permitindo que os investigadores para avaliar directamente a actividade do nervo adjacente ao segmento gastrointestinal. A actividade pode ser gravado na linha de base em condições padronizadas, durante a distensão do segmento ou a seguir à adição de compostos farmacológicos ou entregues intraluminalmente serosally. Esta técnica permiteo pesquisador a estudar facilmente o efeito de drogas que alvejam o sistema nervoso periférico em amostras de controlo; Além disso, fornece informações cruciais sobre a forma como a atividade neuronal é alterada durante a doença. Deve-se notar, contudo, que medir a actividade de disparo neuronal aferente constitui apenas uma estação de retransmissão na neuronal complexa cascata de sinalização, e os investigadores devem ter em mente a não negligenciar a atividade neuronal em outros níveis (por exemplo, gânglios da raiz dorsal, medula espinhal ou central do sistema nervoso ), a fim de elucidar totalmente a fisiologia neuronal complexo na saúde e na doença.

aplicações vulgarmente utilizados incluem o estudo de actividade neuronal em resposta à administração de lipopolissacárido, e o estudo da actividade do nervo aferente em modelos animais de síndroma do intestino irritável. Numa abordagem mais translacional, o segmento isolado do rato intestinal pode ser expostas aos sobrenadantes do cólon de pacientes com SII. Além disso, uma modificaçãoEsta técnica tem sido demonstrado recentemente para ser aplicável em amostras de cólon humano.

Introduction

sinalização sensorial e percepção da dor é um processo complexo que resulta de uma interação complexa entre os nervos aferentes, neurônios da coluna vertebral, vias ascendentes e descendentes facilitadoras e inibidoras e várias regiões cerebrais diferentes. Como tal, as alterações em um ou mais desses níveis pode resultar na sinalização sensorial alterada e dor visceral em estados de doença. Para estudar todos estes diferentes aspectos da sinalização sensorial várias técnicas têm sido desenvolvidas que varia a partir de experiências individuais de células (por exemplo, imagem de cálcio em neurónios) para modelos animais completos (por exemplo, respostas comportamentais, tais como a resposta visceromotor). A técnica descrita neste artigo permite que os pesquisadores para avaliar especificamente a atividade do nervo aferentes in vitro a partir de um segmento isolado do intestino delgado ou cólon nos roedores. Em suma, um segmento isolado gastrointestinal (geralmente jejuno ou cólon) está montado numa câmara de registo incorporado finalidade perfundido com um K fisiológicosolução Rebs. O nervo esplâncnico é dissecado livre e ligado a um eléctrodo permitir o registo da actividade neuronal aferente dos nervos aferentes esplâncnicos ou pélvicas. Actividade do nervo pode ser gravada ou basalmente em resposta ao aumento das pressões intraluminais e / ou compostos farmacológicos que podem ser aplicadas quer directamente para a câmara de registo (serosally), ou através do perfusato intraluminal (por via mucosa) para avaliar o seu efeito sobre a descarga aferente 6/1 . De nota, nervos esplâncnicas também conter fibras eferentes e aferentes viscerofugal para além dos aferentes sensoriais. Uma das principais vantagens do ex vivo, a gravação do nervo esplânenico é o facto de os investigadores podem quantificar a actividade do nervo sem modulação ou de entrada a partir do sistema nervoso central, permitindo uma para estudar o efeito directo dos compostos aplicados localmente sobre a actividade do nervo. Além disso, a monitorização de sinais vitais, como é necessário, utilizando a abordagem in vivo (ver abaixo), é No mais relevante. In vitro gravação splanchnic está finalmente muito menos demorado do que sua contraparte in vivo.

actividade neuronal aferente em resposta a outros estímulos, tais como Stroking mucosa, de sondagem utilizando filamentos de von Frey ou distensão do segmento, pode ser estudado em uma configuração experimental modificado, no qual o tecido intestinal é fixado para baixo e aberto longitudinalmente (o que está em contraste com nossa configuração usando um segmento intacto), como foi descrito em uma edição anterior 7,8. Além disso, só recentemente, foi descrita uma técnica para estudar a activação do nervo aferente do cólon na própria parede do cólon por meio de imagem de cálcio, de novo usando um fixado para baixo, aberta no sentido longitudinal do segmento 9.

Uma versão alternativa desta técnica in vivo consiste fora de medir a ativação neuronal próximo a entrada do aferentes para a medula espinhal. Em suma, o animal sedado é colocado em decúbito ventral, exposing o cordão espinal lombossacral ao qual o nervo aferente de projectos de interesse por meio de laminectomia, construindo um bem usando a pele da incisão e o drapejar radículas dorsal sobre um eléctrodo de platina bipolar 10,11 encheu-parafina. Esta técnica permite, além disso, os investigadores para caracterizar as fibras com base na sua velocidade de condução, e distinguir as fibras C não mielinizadas de Aδ-fibras finamente mielinizadas. Além disso, as radículas dorsais que contêm apenas fibras aferentes sensoriais, em contraste com os nervos aferentes e eferentes esplâncnicas mistos mencionados anteriormente.

Gravação de descarga de nervos aferentes in vitro a partir de segmentos intestinais isolados também pode ser feito usando amostras humanas, como dois grupos de pesquisa publicados de forma independente primeiros-in-man manuscritos gravação atividade do nervo aferentes cólica de ressecção humana espécimes 12,13. A implementação desta técnica poderia resultar em um mais prontamente translatina dos dados murino para o estado humano, e pode permitir que os investigadores a identificar facilmente as drogas que alvejam o nervo sensorial sensibilizados. A importância clínica de caracterizar a actividade do nervo aferente, bem como a descoberta de novos reagentes terapêuticos que têm como alvo a actividade do nervo aferente exorbitante, foi elaborada discutido por muitos especialistas no domínio 14-19.

A técnica in vitro acima mencionado complementa o mais comumente conhecido na medição in vivo da actividade do nervo aferente. Durante a medição in vivo da actividade neuronal, a actividade do nervo pode ser medida directamente no animal sedado durante o qual o segmento de interesse é identificada e subsequentemente entubados, e uma parafina líquida bem-cheia é construído usando a parede abdominal e a pele do roedor 20. O nervo aferente de interesse é então identificado, seccionadas e colocadas sobre um eléctrodo de platina bipolar, permitindo measuremen actividade neuronalt. Esta técnica permite que o pesquisador para modular a atividade do nervo aferentes em viver ainda que os animais sedados; como tal, pode-se estudar a actividade neuronal responder às interferências, tais como distensão luminal ou a administração intravenosa de um composto.

Investigação translacional centra-se nos dias de hoje, principalmente sobre a aplicação dos sobrenadantes de origem humana (ex., A partir de biópsias de cólon, células mononucleares do sangue periférico cultivadas, etc.) em aferentes rato jejunais e / ou do cólon 21,22. Os pesquisadores podem aplicar diretamente sobrenadantes quer para o banho de órgão ou na solução intraluminal que perfunde o segmento do intestino, de modo que os efeitos diferenciais da serosa versus aplicação da mucosa pode ser estudada na descarga de nervo aferentes. Como tal, foi demonstrado que supernatans de biópsia da mucosa do cólon de pacientes com a síndrome do intestino irritável podem causar hipersensibilidade do cólon no ratinho aferentes, cobaia neurónios submucosas e raiz dorsal de ratoneurônios do gânglio 21,23,24.

Finalmente, a actividade neuronal gravação não está restrito ao mesentérica e / ou neurónios que enervam pélvicos no tracto gastrointestinal. Outros demonstraram que as gravações de nervo pode ser realizada em aferentes fornecimento de articulação do joelho 25, ao passo que outros têm caracterizado actividade do nervo aferente da bexiga bem como 26-28, e demonstraram que os aferentes pélvicos da bexiga bem como do tracto gastrointestinal convergem, resultando possivelmente em neuronal crosstalk 29.

Protocol

Todos os experimentos com animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica e o uso de Animais Experimentais da Universidade de Antuérpia (número do arquivo 2012-42).

1. Preparação do tecido do jejuno e cólon aferentes Nervos

  1. Preparação do nervo aferente jejunal
    1. Executar a eutanásia roedor do roedor adolescente ou adulto, que tenha sido aprovado antes da experiência pelo Comité Ético local (por exemplo., Sedação terminal seguido por punção cardíaca, deslocamento cervical, etc).
      NOTA: Nós usamos deslocamento cervical a sacrificar os animais resultando assim em experimentos sem a necessidade de mais anestesia ou cuidados pós-cirúrgicos, como tecidos são transformados in vitro.
      NOTA: A idade tem sido mostrado para atenuar aferentes mesentérica funções mecanosensorial 30, nós, portanto, aconselham os pesquisadores a aderir a um grupo etário específico para a duração dauma única experiência.
    2. Colocar o animal de laboratório sacrificado na posição supina e realizar uma incisão na linha média abdominal através da camada de pele e músculo abdominal utilizando um bisturi, que se estende do processo xifóide até o osso púbico.
    3. Banhar a cavidade abdominal com solução de Krebs a frio, a fim de impedir que os tecidos intra-abdominais de secar (composição de Krebs: NaCl 120,03 mM, KCl 6,22 mM, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15,43 mM de NaHCO3, MgSO4 1,21 mM, 11,52 mM de D-glicose e 1,52 mM de CaCl2).
    4. Rapidamente extirpar todo o jejuno usando uma tesoura afiada através da excisão de cerca de 20 cm do intestino delgado começando imediatamente para distal da flexura duodenojejunal, tomando cuidado para não danificar estruturas vizinhas e manter mesentério do intestino, que contém vasos sanguíneos jejunais e nervos aferentes, intacta.
      NOTA: Para a mera dissecção jejunal na cavidade abdominal, não é preciso usarum estereomicroscópio, tal como esta pode ser facilmente visualizado com a olho nu.
    5. Colocar o jejuno excisados em solução de Krebs gelada e manter em gelo, enquanto oxigenar a solução de Krebs continuamente com carbogénio (95% O2, 5% de CO 2).
    6. Corte o jejuno com uma tesoura afiada nas alças longas aproximadamente 3 cm. Observe o pacote mesentérica contendo os vasos e nervos esplâncnico em algum lugar perto do centro do respectivo loop.
    7. Lavar cada segmento com solução de Krebs usando um cateter sem corte para remover conteúdo luminal e quimo como estes contêm enzimas digestivas que irá acelerar a deterioração da amostra de tecido in vitro.
      NOTA: Tome cuidado para não danificar o lúmen do circuito durante a lavagem, como a destruição das vilosidades resultará na liberação de mediadores que podem alterar a atividade do nervo aferente.
    8. Identificar o segmento para medir a actividade do nervo aferente (por exemplo, o primeiro SEGME jejunalnt para distal do ligamento de Treitz ou a flexão duodenojejunal), e colocar isso em uma câmara de gravação construído propositadamente revestido com uma camada de elastômero de silicone.
      NOTA: O início do jejuno está anatomicamente definido como a parte do intestino delgado, onde o ligamento de Treitz atravessa o intestino delgado, também chamado de flexura duodenojejunal.
      NOTA: Cubra o fundo da câmara de registo com uma camada fina de elastómero de silicone com bastante antecedência antes do início da experiência. A preparação desta camada de elastómero deve ser realizada de acordo com as instruções do fabricante 1.
    9. Perfundir a câmara constantemente com quente, carbogenated solução de Krebs a uma taxa de 10 ml / min e manter a temperatura a de Krebs 'na câmara de gravação constante a 34 ° C.
    10. Montar o segmento de jejuno no banho de órgãos de modo a que a extremidade bucal é ligada ao controlador de seringa proporcionando fluxo luminal e a extremidade aboral conecta à saída. ligeiramente stvomitar o segmento, mas tome cuidado para não exercer tensão excessiva. Fixe ambas as extremidades firmemente usando 4/0 ligaduras de seda para os portos de aumentos e reduções.
    11. Anexar o controlador de seringa na extremidade bucal, e perfundir o segmento de jejuno intraluminalmente com solução de Krebs (, temperatura ambiente não oxigenada) a uma taxa de 10 ml / h.
    12. Pin o mesentério do segmento intestinal plana montada contra a camada inferior de elastômero de silicone, usando os pinos de insetos. Esticar o mesentério para fora, a fim de optimizar a visualização do feixe mesentérica; não exercer pressão sobre o pacote ou o jejuno.
    13. Executar uma distensão rampa de teste (vide infra), fechando a porta de saída até que a pressão intraluminal do segmento intestinal atinge 60 mmHg, a fim de verificar que nenhuma solução de Krebs intraluminal é vazamento do segmento montado. Observar um aumento suave da pressão intraluminal sem interrupções.
    14. Observe pequenas contracções do segmento (wav peristálticaes) durante a fase inicial de distensão. Se necessário, bloquear a actividade peristáltica por adição de 1 ^ M do tipo L, nifedipina bloqueador do canal de cálcio à solução de Krebs.
      NOTA: A adição de 1 M de atropina para a solução Krebs, além de nifedipina, irá paralisar completamente o segmento intestinal. Nós, entretanto, não têm experiência pessoal com o uso e efeito da atropina sobre a gravação do nervo aferente.
    15. Sob um microscópio estereoscópico, comece suavemente para descolar o tecido adiposo do mesentério puxando-o suavemente com duas pequenas pinças, tomando cuidado para não danificar os vasos e nervos aferentes que estão enterrados no tecido adiposo.
    16. Comece a uma distância remota do jejuno, e expor ambos os vasos sanguíneos no feixe mesentérica.
    17. Observe o nervo jejunal aferentes entre ambos os navios como um fio fino, branco encapsulado no tecido adiposo. Apenas dissecar mais proximal para o jejuno por descascar delicadamente o tecido de gordura de distância, usando uma pinça quando osidentificação inicial de ambos os vasos mesentéricos e / ou do nervo aferente é difícil.
    18. Dissecar o nervo mesentérica jejunal do segmento livre a uma distância de vários milímetros, através da remoção do tecido adiposo aderente ao nervo.
    19. Transecto do nervo usando uma tesoura de tecido afiadas. Se necessário, retire o tecido gordo e conjuntivo restante, bem como da bainha epineuronal puxando-o suavemente com as pequenas pinças.
    20. Utilizando um micromanipulador, diminuir a ponta do eléctrodo de sucção, ligada a uma seringa com um êmbolo, no banho de órgãos; então, através da manipulação do êmbolo, aspirar cuidadosamente alguma solução de Krebs a partir do banho de órgãos de modo a que a ponta do eléctrodo é submerso na solução de Krebs (Figura 1). Assegure-se que a solução de Krebs cobre o eléctrodo de fio no interior do eléctrodo de sucção.
      NOTA: Prepara-se o capilar de vidro de borossilicato de sucção que contém o eléctrodo de fio antes do início da experiência nósing um extrator pipeta.
    21. Posicionar a ponta do eléctrodo de sucção imediatamente ao lado do cordão do nervo aferente seccionado e desenhar a cadeia nervo seccionado para o capilar ao longo de todo o seu comprimento.
    22. Manobra da ponta do eléctrodo no sentido algum tecido adiposo e este aspirar para o capilar de vidro, ao mesmo tempo aspirando firmemente com o êmbolo, assim, mecanicamente "vedação" do nervo no capilar a partir do conteúdo do banho de órgãos.
    23. Verificar o registo da actividade do nervo aferente utilizando o sistema de aquisição de dados, por exemplo, através da realização de um aumento induzido por distensão rampa em aferente disparo (vide infra). Após o isolamento do nervo para o eléctrodo de sucção, estabilizar a preparação durante 15 min a fim de se obter uma actividade do nervo aferente espontânea estado estável antes de realizar as experiências reais.
    24. Para executar rampa distensão, distender o segmento intestinal, fechando a porta de saída, que conduz a gradUAL aumento da pressão no segmento intestinal (até 60 mmHg). Realizar apenas o protocolo experimental desejado quando três distensões rampa consecutivos (com um intervalo de 15 min) deu uma descarga multi-unidade reprodutível (Figura 2).
  2. Preparação do aferentes splanchnic lombar (nervo aferentes do cólon)
    NOTA: A dissecção dos nervos aferentes cólon exige uma dissecção mais detalhado. Os desvios do protocolo antigo "jejuno" estão listados abaixo:
    1. Eutanásia do animal por meio de um método humano, colocá-lo na posição supina, realizar uma laparotomia mediana e excessivamente despeje solução de Krebs gelada na cavidade abdominal. NOTA: Krebs composição: NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM de MgSO4, mM de D-glucose 11 mM e CaCl 2 2,5, 3 uM de indometacina.
      NOTA: Observe a composição alterada da solução de Krebs; indometacina é adicionado ao assimlução, a fim de evitar alterações da atividade do nervo aferentes pelas prostaglandinas.
    2. Descartar o tecido adiposo, bexiga e genitais internos, e suavemente deslocar o intestino delgado de um lado na cavidade abdominal. Executar uma prelevation estendida da parte distal do cólon com os nervos mesentéricos intactas do abdômen.
      NOTA: marcos importantes que podem ser incluídos nesta dissecção para auxiliar ainda mais a preparação do tecido incluem a aorta abdominal e veia cava, o rim esquerdo e a musculatura do pavimento pélvico.
      NOTA: Durante a dissecção, tomar cuidado para não exercer tracção sobre o tecido de ligação entre dois pontos e da aorta abdominal, já que esta região contém os nervos esplâncnicos lombares.
    3. Transferir o segmento de tecido no elastômero de silicone forrada a gravação da câmara. Use a artéria renal esquerda, que se origina da aorta abdominal, como ponto de partida. Siga o aorta abdominal na direção aboral, encontrar os mesenteri superioresc juntamente com a artéria celíaca e gânglio mesentérica superior. Finalmente, chega ao tecido de ligação entre a parte distai do cólon e da aorta, no qual o nervo está localizado de interesse.
    4. Identificar a artéria mesentérica inferior proveniente da aorta abdominal. O nervo lombar esplânenico aferente pode ser identificada na base da artéria mesentérica inferior; que corre paralela à artéria (Figura 3).
    5. Após a transecção do nervo, descascar delicadamente fora da bainha de tecido conjuntivo circundante e provocar o nervo em vários fios finos. Certifique-se manter uma distância segura do cólon.
    6. Desenhar um destes segmentos individuais para o eléctrodo de sucção, "selar" o capilar com áreas de tecido adiposo como descrito anteriormente e realizar o protocolo experimental desejado.
    7. Descartar qualquer tecido supérfluo que está presente no banho de órgãos (por exemplo, rins, vasos abdominais, tecido muscular), umas estes podem perturbar o sinal aferente.
      NOTA: Nifedipina (1 | iM) pode ser adicionado à solução de Krebs no caso de o sinal do nervo aferente é perturbada pelo movimento intestinal espontânea devido a contracções células do músculo liso.
      NOTA: As drogas podem ser administradas em três locais diferentes: 1) serosally por dissolução do composto desejado na Krebs que perfunde a câmara de registo, 2) directamente no banho de órgãos, enquanto parando temporariamente a perfusão ou 3) intraluminalmente por dissolução do composto de interesse na solução de Krebs na unidade de seringa. Dessensibilização do nervo aferente pode ocorrer quando as dosagens cumulativas de um composto são administrados consecutivamente muito rápido.

figura 1
Figura 1: Visão esquemática da câmara de gravação e Eletrodo de Sucção construiu-Purpose visão geral detalhada do techni. configuração de cal com o eletrodo de sucção ea câmara de gravação no local. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: O rastreio Representante da gravação In Vitro de jejuno aferentes a atividade do nervo gravação normal da atividade do nervo aferentes multi-unidade de jejuno (imp.sec -1) (painel superior) no início do estudo e em resposta a 2 distensões rampa até 60 mmHg. (painel inferior), ea posterior identificação (análise wavemark) de diferentes-unidades individuais no sinal nervoso (terceiro painel). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3:. Neuroanatomia do Colon A) A informação sensorial a partir do cólon é transmitida através dos nervos do cólon lombares (LCN) em relação ao sistema nervoso central, com a LCN correndo em estreita proximidade com a artéria mesentérica inferior (IMA). Uma porção das fibras a partir deste nervo lombar do cólon vai naturalmente ao longo do nervo intermesenteric (IMN) para formar os nervos esplâncnicas lombares (LSN). O gânglio mesentérico inferior (IMG) está localizado na origem da IMA a partir da aorta abdominal. Gravação distalmente da IMG é obrigatória deve pesquisadores desejam estudar a atividade do nervo aferentes viscerofugal. B) Uma visão esquemática da montagem experimental. gravação aferente do LCN é realizada num órgão tanto por meio de um eléctrodo de sucção ligado ao sistema de aquisição de dados. Rampa distensão pode ser realizada após o encerramento da porta de saída, continuando a entrada deSolução de Krebs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Aquisição de Dados

  1. Registrar a atividade do nervo através de um eletrodo de sucção conectado a um headstage. Amplificar (ganhar 10k) e filtrar o sinal (de banda de 500 - 5.000 Hz) 20.
    NOTA: A 50/60 Hz Noise Eliminator devem ser incluídos na configuração experimental, a fim de remover sinais de ruídos de interferência elétrica 50/60 Hz. O sinal digitalizado é automaticamente e amostrado a 20 kHz para análise.

3. Análise 5,20

  1. Relatar a descarga de nervo aferentes como o número total de impulsos / segundo para todo o nervo ou usar softwares especializados para realizar uma análise mais aprofundada, como gravações multi-unidade de actividade do nervo geral contêm potenciais de forma diferente, amplitude e largura de ação, correspondente ao nervo diferente unidadesem cada fibra aferente (Figura 2).
  2. Combinar wavemarks individuais para modelos pré-definidos, permitindo discriminação entre-unidades individuais. Antes de atribuição de um pico a uma determinada onda marca, uma relação sinal-ruído de> 2: 1 deve ser executada.
    NOTA: Durante a análise wavemark, construímos um novo modelo quando pelo menos 10 picos semelhantes são identificados pelo software de análise. Nenhum modelo é construído para formas mais raras de 1 em cada 50 pontos. Um pico é comparado com um modelo utilizando análise de componentes principais quando pelo menos 80% dos seus pontos são idênticos aos do modelo de pico. casamento de modelos é dependente do operador, e deve ser sempre realizada pelo mesmo pesquisador de forma cega.
  3. Calcular as respostas potenciais de acção subtraindo-se a actividade espontânea na linha de base (pressão intraluminal de 0 mmHg) a partir da resposta durante a distensão em pontos fixos de tempo (5 mmHg de incremento a partir de 0 a 20 mm Hg de pressão intraluminal, incrementos de 10mmHg de 20 mmHg em diante). Medida de descarga aferentes linha de base usando um tamanho de bin de 10 seg.
  4. Use a análise single-unit para classificar fibras com base em seu perfil de descarga durante a distensão rampa (Figura 4). Além disso, a análise de unidade única pode ser utilizada para estudar o perfil quimiossensíveis de diferentes tipos de unidades, uma vez que nem todos os tipos de unidades irá exibir a mesma actividade de disparo alterada em resposta a uma droga ou composto.
  5. Classificar fibras como fibras de baixo limiar ( "LT", normalmente exercem o aumento da secreção nas pressões de distensão inferiores), fibras de alto limiar ( «HT», exercem o aumento da secreção nos mais altos pressões de distensão), fibras ampla faixa dinâmica ( "WDR", demonstram aumento da queima durante toda a rampa distensão) ou aferente mecanicamente insensível ( 'Mia', fibras nervosas que normalmente não respondem à rampa distensões) 5; 20.
  6. Expresse a resposta impulsos nervosos em 20 mmHg como o percentagem da resposta máxima de queima durante a distensão (LT%), uma vez que reflete o grau de cozedura a baixa pressão de distensão.
    NOTA: Por conseguinte, as fibras de LT são caracterizados por uma LT%> 55%, ao passo que HT são definidos por um valor de <15%. Os valores para as unidades WDR variam entre 15 e 55% (20). A MIA mostra queima aferentes espontânea que não é afetado por distensões.

Figura 4
Figura 4:. Representação esquemática das Unidades aferente Fibra diferente com base no seu perfil Mechanosensitive Unidades são classificados com base no percentual (LT%) da sua taxa de disparo a 20 mmHg de pressão distensão comparado com a resposta máxima de queima durante a distensão. fibras de baixo limiar (painel superior esquerdo) predominantemente exibir uma actividade aumentada do nervo a baixas pressões de distensão, resultando numa LT%, superior a 55%. unidades de alto limiar (superior direitopainel), pelo contrário só exibem um aumento na taxa de disparo a pressões nocivos (LT% <15). Largas fibras Faixa Dinâmica (painel inferior esquerdo) exibir um aumento gradual na atividade nervosa durante toda a distensão (% LT variando entre 15 e 55), enquanto que as fibras mecanicamente insensíveis (painel inferior direito) não respondem a pressões crescentes de distensão. LT%: (aferentes disparando a 20 mmHg / queima aferentes máxima) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

atividade do nervo aferentes jejuno foi medida no início do estudo e em resposta a rampa distensão em 9 de oito semanas de idade do sexo masculino OF-1 ratos. Os animais foram alojados em grupos em condições padronizadas (6 animais por gaiola, 20-22 ° C, umidade 40 - 50%, 12 h ciclo claro-escuro), com acesso ilimitado à água da torneira e comida regular. segmentos jejunais de ratos exibido descarga de aferentes espontânea irregular do nervo na linha de base a uma pressão intraluminal de 0 mmHg (média atividade espontânea 11,47 ± 3,31 imp / seg).

A atividade do nervo aferentes jejunal aumentada após a realização de distensões rampa até 60 mmHg. Tipicamente, o aumento da actividade do nervo aferente seguindo o aumento da pressão intraluminal, é caracterizada por uma resposta bifásica (Figura 5), que consiste num rápido aumento inicial na actividade de disparo para cima até que a pressão intraluminal atinge 20 mmHg, whicH pode ser atribuída principalmente ao aumento da taxa de disparo de fibras de baixo limiar. Isto é então seguido por uma fase de plateau, após o que um segundo aumento da actividade de disparo pode ser observada a partir de 40 mmHg em diante, que representa a activação de fibras predominantemente limiar elevado.

Com base em suas formas de onda,-unidades individuais podem ser discriminados em cada gravação multi-unit e classificados em uma das acima mencionadas quatro categorias. Em 9 ratinhos, que discriminados 40 unidades diferentes (4,44 ± 1,01 unidades / nervosas aferentes jejunal), com as unidades de LT sendo os mais prevalentes, seguido por WDR e fibras HT (Figura 6). A actividade de disparo dos diferentes unidades em resposta a rampa de distensão pode ser observado na Figura 7.

Figura 5
Figura 5: g> mesentérica aferentes Discharge Nerve (imp.sec - 1). em camundongos selvagens durante a rampa Distensão mesentérica de descarga multi-unidade de nervo aferentes (imp / seg -1) em ratinhos de tipo selvagem durante distensão rampa para todo o nervo. Os valores representam descarga aferentes média ± SEM, n = 9 ratos. imp.sec -1:. impulsos por segundo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:. Individual Distribution Unit de 40 unidades identificadas nos nervos jejuno aferentes a partir de 9 ratos do tipo selvagem HT: Fibra alto limiar, LT: fibra de baixo limiar, MIA: Fibra mecanicamente insensível, WDR: Fibra ampla faixa dinâmica._blank "> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7:. Curvas de pressão-resposta para os diferentes tipos de subunidades em camundongos selvagens A descarga de nervos aferentes single-unit (imp.sec -1) a partir das quatro unidades diferentes que podem ser identificados, em ratinhos de tipo selvagem durante rampa distensões. A fibra de baixo limiar (LT, figura superior esquerdo) é caracterizada por um aumento inicial rápido na atividade de queima durante a distensões, enquanto as fibras de alto limiar (HT, figura inferior esquerdo) só visor aumento disparando durante pressões intraluminais nocivos. Largas fibras Dynamic Range (WDR, figura superior direito) mostram um aumento constante da atividade de queima durante toda a distensão, e fibras aferentes mecano-insensitive (MIA, figura inferior direito) não responder às crescentes pressões intraluminais. valores repressentem de descarga aferentes média ± sem imp.sec -1:. impulsos por segundo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo neste documento descreve uma técnica de laboratório reprodutível para estudar a atividade do nervo aferentes mesentérica em roedores como o usado por nosso grupo e outros 3,4,7,8,12,20,21,31. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem o isolamento rápido do tecido, a aspiração da cadeia do nervo para o eléctrodo de sucção e o "selagem" adequada do capilar de vidro a partir do banho de órgãos, aspirando o tecido adiposo circundante para o capilar. A abertura do capilar de vidro, deve ser determinada precisamente: uma abertura que é muito pequeno irá complicar a aspiração da cadeia do nervo para o eléctrodo, enquanto que uma muito grande abertura irá dificultar o "vedação" do capilar com o tecido adiposo, resultando em redundante ruído de fundo que irá dificultar a análise (gravações de baixo sinal-ruído). Para permitir a classificação fiável single-unit, aferentes esplâncnicas deve ser dividida em diversas vertentes, a fim de reduzir onúmero de unidades na gravação. Normalmente, sugerimos com o objetivo de ter um máximo de 4 - 5 unidades em cada gravação. Por conseguinte, os investigadores devem ajustar a abertura com base na fibra de interesse, e o animal de laboratório que é aplicada.

Outro ponto crítico abrange a fundamentação suficiente da configuração experimental. O eletrodo de sucção e câmara de gravação devem ser devidamente fundamentada e coberto por uma gaiola de Faraday, a fim de minimizar a interferência campos elétricos que impedem a análise da atividade neuronal, enquanto que todos os outros equipamentos, incluindo os aparelhos de gravação, motorista seringa et cetera deve ser instalado fora da gaiola .

Ao registar a actividade do nervo aferente em estreita proximidade com o jejuno ou cólon, pode-se isolar a primeira parte da cadeia de transdução de sinal facilmente aferente e estudar a contribuição e alterações que ocorrem no nível aferente único sem interferência do centro de nervsistema ous. Uma das limitações desta técnica é o fato de que em observações in vitro podem nem sempre ser fácil extrapolados para o cenário in vivo, como a configuração in vitro incorpora uma estação retransmissora na cascata de sinalização do nervo complexa. Como tal, um quadro mais amplo deve ser feita incorporando todas as outras estações, como os gânglios da raiz dorsal, sistema nervoso central (por exemplo, imagiologia cerebral funcional) e descendente (inibitórios) vias eferentes.

Outra vantagem deste método constitui o procedimento técnico bastante simples, como um já não tem de monitorar o bem-estar do animal de laboratório que fornece a amostra gastrointestinais. Por outro lado, é a medição in vitro da actividade neuronal imprópria para elucidar o efeito de uma droga administrada sistemicamente na descarga do nervo aferente, mas os investigadores podem teoricamente superar este obstáculo por meio da administração sistémica da droga óf interesse para o animal, seguido pela gravação ex vivo in vitro da actividade do nervo aferente. No entanto, deve-se estar atento para o fato de que qualquer droga presente na câmara de gravação será diluído devido à perfusão banho durante a dissecção e gravações posteriores. Finalmente, realizando in vitro gravações nervosas esplâncnicas usando animais geneticamente modificados poderia permitir que os investigadores a elucidar plenamente o papel de diferentes canais e receptores expressos em fibras aferentes.

Pesquisadores tentar implementar esta técnica também deve ter em mente que a identificação e isolamento do aferentes mesentérica e aferentes pélvicos, obviamente, requer o conhecimento de anatomia básica e formação técnica, e os pesquisadores devem estar familiarizados com os princípios básicos da eletrofisiologia neuronal.

A configuração in vitro, além disso, permite aos investigadores identificar facilmente possível tar farmacológicorecebe, e fornece informações sobre o papel fisiológico da actividade neuronal, bem como a sinalização sensorial alterado em vários processos de doença.

Em caso de medições aferentes jejunais, vários segmentos de tecido de um único animal pode ser estudado simultaneamente, uma característica que é bastante difícil usando uma configuração in vivo. Pesquisadores no entanto deve cautelosamente interpretar os resultados obtidos a partir de diferentes segmentos, como as diferenças regionais poderiam distorcer os resultados. Portanto nós recomendamos para medir constantemente a atividade do nervo aferentes a partir do mesmo local (por exemplo, primeiro segmento distalmente a partir do ligamento de Treitz ou a flexão duodenojejunal).

aplicações actuais e futuras típicos desta técnica compreendem o rastreio de compostos farmacológicos que podem alterar a sensibilização de aferentes mesentéricos durante patologias que são caracterizadas por hipersensibilidade visceral e dor. Como já foi mencionado antes, o objectivo docompostos SE pode ser encontrado em algum lugar ao longo do sistema nervoso intrincada que vão desde o sistema nervoso entérico intrínseca ao cérebro; como tal, a caracterização e modulação da actividade do nervo aferente contribui para o quadro mais amplo que abrange também a imagem de cálcio do sistema nervoso entérico intrínsecas e aos gânglios das raízes dorsais, a medição da resposta visceromotor como um indicador da hipersensibilidade visceral in vivo, e imagem funcional do cérebro, entre outros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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References

  1. Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24, (10), 956-e465 (2012).
  2. Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98, (1), 123-133 (2013).
  3. Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586, (18), 4517-4530 (2008).
  4. Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17, (1), 89-101 (2005).
  5. Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27, (12), 1709-1720 (2015).
  6. Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27, (Suppl 2), 22 (2015).
  7. Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, (1), 166-178 (2004).
  8. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
  9. Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179 (2013).
  10. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G245-G253 (2008).
  11. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, (6), 2046-2060 (1994).
  12. Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60, (2), 281-282 (2011).
  13. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60, (2), 204-208 (2011).
  14. Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (5), 286-296 (2013).
  15. Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11, (6), 575-581 (2011).
  16. De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16, (44), 5523-5535 (2010).
  17. Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, (7), 923-929 (2008).
  18. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586, (21), 5247-5258 (2008).
  19. Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698, (1-3), 404-412 (2013).
  20. Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20, (2), 149-158 (2008).
  21. Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62, (10), 1456-1465 (2013).
  22. Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
  23. Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99, (10), 1299-1311 (2014).
  24. Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. (2016).
  25. Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56, (1), 351-359 (2007).
  26. Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128, (3), 235-243 (2007).
  27. Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58, (1), 22-28 (2010).
  28. Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190, (3), 1123-1130 (2013).
  29. Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190, (2), 765-771 (2013).
  30. Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. (2015).
  31. Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108, (10), 1634-1643 (2013).
<em>In Vitro</em> A gravação de mesentérica aferentes a atividade do nervo no mouse jejuno e segmentos do cólon
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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