Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
nervos aferentes não só transmitir informações sobre a fisiologia normal, mas também sinalizar homeostase perturbado e processos fisiopatológicos dos diferentes sistemas de órgãos da periferia para o sistema nervoso central. Como tal, o aumento da actividade ou "sensibilização" de nervos aferentes mesentéricos foi atribuído um papel importante na patofisiologia da hipersensibilidade visceral e síndromes de dor abdominal.
Actividade do nervo aferente mesentérica pode ser medida in vitro em um segmento intestinal isolado que é montado em um banho de órgãos, construído para e a partir do qual o nervo esplânenico é isolado, permitindo que os investigadores para avaliar directamente a actividade do nervo adjacente ao segmento gastrointestinal. A actividade pode ser gravado na linha de base em condições padronizadas, durante a distensão do segmento ou a seguir à adição de compostos farmacológicos ou entregues intraluminalmente serosally. Esta técnica permiteo pesquisador a estudar facilmente o efeito de drogas que alvejam o sistema nervoso periférico em amostras de controlo; Além disso, fornece informações cruciais sobre a forma como a atividade neuronal é alterada durante a doença. Deve-se notar, contudo, que medir a actividade de disparo neuronal aferente constitui apenas uma estação de retransmissão na neuronal complexa cascata de sinalização, e os investigadores devem ter em mente a não negligenciar a atividade neuronal em outros níveis (por exemplo, gânglios da raiz dorsal, medula espinhal ou central do sistema nervoso ), a fim de elucidar totalmente a fisiologia neuronal complexo na saúde e na doença.
aplicações vulgarmente utilizados incluem o estudo de actividade neuronal em resposta à administração de lipopolissacárido, e o estudo da actividade do nervo aferente em modelos animais de síndroma do intestino irritável. Numa abordagem mais translacional, o segmento isolado do rato intestinal pode ser expostas aos sobrenadantes do cólon de pacientes com SII. Além disso, uma modificaçãoEsta técnica tem sido demonstrado recentemente para ser aplicável em amostras de cólon humano.
sinalização sensorial e percepção da dor é um processo complexo que resulta de uma interação complexa entre os nervos aferentes, neurônios da coluna vertebral, vias ascendentes e descendentes facilitadoras e inibidoras e várias regiões cerebrais diferentes. Como tal, as alterações em um ou mais desses níveis pode resultar na sinalização sensorial alterada e dor visceral em estados de doença. Para estudar todos estes diferentes aspectos da sinalização sensorial várias técnicas têm sido desenvolvidas que varia a partir de experiências individuais de células (por exemplo, imagem de cálcio em neurónios) para modelos animais completos (por exemplo, respostas comportamentais, tais como a resposta visceromotor). A técnica descrita neste artigo permite que os pesquisadores para avaliar especificamente a atividade do nervo aferentes in vitro a partir de um segmento isolado do intestino delgado ou cólon nos roedores. Em suma, um segmento isolado gastrointestinal (geralmente jejuno ou cólon) está montado numa câmara de registo incorporado finalidade perfundido com um K fisiológicosolução Rebs. O nervo esplâncnico é dissecado livre e ligado a um eléctrodo permitir o registo da actividade neuronal aferente dos nervos aferentes esplâncnicos ou pélvicas. Actividade do nervo pode ser gravada ou basalmente em resposta ao aumento das pressões intraluminais e / ou compostos farmacológicos que podem ser aplicadas quer directamente para a câmara de registo (serosally), ou através do perfusato intraluminal (por via mucosa) para avaliar o seu efeito sobre a descarga aferente 6/1 . De nota, nervos esplâncnicas também conter fibras eferentes e aferentes viscerofugal para além dos aferentes sensoriais. Uma das principais vantagens do ex vivo, a gravação do nervo esplânenico é o facto de os investigadores podem quantificar a actividade do nervo sem modulação ou de entrada a partir do sistema nervoso central, permitindo uma para estudar o efeito directo dos compostos aplicados localmente sobre a actividade do nervo. Além disso, a monitorização de sinais vitais, como é necessário, utilizando a abordagem in vivo (ver abaixo), é No mais relevante. In vitro gravação splanchnic está finalmente muito menos demorado do que sua contraparte in vivo.
actividade neuronal aferente em resposta a outros estímulos, tais como Stroking mucosa, de sondagem utilizando filamentos de von Frey ou distensão do segmento, pode ser estudado em uma configuração experimental modificado, no qual o tecido intestinal é fixado para baixo e aberto longitudinalmente (o que está em contraste com nossa configuração usando um segmento intacto), como foi descrito em uma edição anterior 7,8. Além disso, só recentemente, foi descrita uma técnica para estudar a activação do nervo aferente do cólon na própria parede do cólon por meio de imagem de cálcio, de novo usando um fixado para baixo, aberta no sentido longitudinal do segmento 9.
Uma versão alternativa desta técnica in vivo consiste fora de medir a ativação neuronal próximo a entrada do aferentes para a medula espinhal. Em suma, o animal sedado é colocado em decúbito ventral, exposing o cordão espinal lombossacral ao qual o nervo aferente de projectos de interesse por meio de laminectomia, construindo um bem usando a pele da incisão e o drapejar radículas dorsal sobre um eléctrodo de platina bipolar 10,11 encheu-parafina. Esta técnica permite, além disso, os investigadores para caracterizar as fibras com base na sua velocidade de condução, e distinguir as fibras C não mielinizadas de Aδ-fibras finamente mielinizadas. Além disso, as radículas dorsais que contêm apenas fibras aferentes sensoriais, em contraste com os nervos aferentes e eferentes esplâncnicas mistos mencionados anteriormente.
Gravação de descarga de nervos aferentes in vitro a partir de segmentos intestinais isolados também pode ser feito usando amostras humanas, como dois grupos de pesquisa publicados de forma independente primeiros-in-man manuscritos gravação atividade do nervo aferentes cólica de ressecção humana espécimes 12,13. A implementação desta técnica poderia resultar em um mais prontamente translatina dos dados murino para o estado humano, e pode permitir que os investigadores a identificar facilmente as drogas que alvejam o nervo sensorial sensibilizados. A importância clínica de caracterizar a actividade do nervo aferente, bem como a descoberta de novos reagentes terapêuticos que têm como alvo a actividade do nervo aferente exorbitante, foi elaborada discutido por muitos especialistas no domínio 14-19.
A técnica in vitro acima mencionado complementa o mais comumente conhecido na medição in vivo da actividade do nervo aferente. Durante a medição in vivo da actividade neuronal, a actividade do nervo pode ser medida directamente no animal sedado durante o qual o segmento de interesse é identificada e subsequentemente entubados, e uma parafina líquida bem-cheia é construído usando a parede abdominal e a pele do roedor 20. O nervo aferente de interesse é então identificado, seccionadas e colocadas sobre um eléctrodo de platina bipolar, permitindo measuremen actividade neuronalt. Esta técnica permite que o pesquisador para modular a atividade do nervo aferentes em viver ainda que os animais sedados; como tal, pode-se estudar a actividade neuronal responder às interferências, tais como distensão luminal ou a administração intravenosa de um composto.
Investigação translacional centra-se nos dias de hoje, principalmente sobre a aplicação dos sobrenadantes de origem humana (ex., A partir de biópsias de cólon, células mononucleares do sangue periférico cultivadas, etc.) em aferentes rato jejunais e / ou do cólon 21,22. Os pesquisadores podem aplicar diretamente sobrenadantes quer para o banho de órgão ou na solução intraluminal que perfunde o segmento do intestino, de modo que os efeitos diferenciais da serosa versus aplicação da mucosa pode ser estudada na descarga de nervo aferentes. Como tal, foi demonstrado que supernatans de biópsia da mucosa do cólon de pacientes com a síndrome do intestino irritável podem causar hipersensibilidade do cólon no ratinho aferentes, cobaia neurónios submucosas e raiz dorsal de ratoneurônios do gânglio 21,23,24.
Finalmente, a actividade neuronal gravação não está restrito ao mesentérica e / ou neurónios que enervam pélvicos no tracto gastrointestinal. Outros demonstraram que as gravações de nervo pode ser realizada em aferentes fornecimento de articulação do joelho 25, ao passo que outros têm caracterizado actividade do nervo aferente da bexiga bem como 26-28, e demonstraram que os aferentes pélvicos da bexiga bem como do tracto gastrointestinal convergem, resultando possivelmente em neuronal crosstalk 29.
O protocolo neste documento descreve uma técnica de laboratório reprodutível para estudar a atividade do nervo aferentes mesentérica em roedores como o usado por nosso grupo e outros 3,4,7,8,12,20,21,31. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem o isolamento rápido do tecido, a aspiração da cadeia do nervo para o eléctrodo de sucção e o "selagem" adequada do capilar de vidro a partir do banho de órgãos, aspirando o tecido adiposo circundante para o capilar. A abertura do capila…
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |