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Neuroscience

In Vitro de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon

doi: 10.3791/54576 Published: October 25, 2016

Abstract

nervios aferentes no sólo transmiten información relativa a la fisiología normal, sino también la señal homeostasis perturbado y procesos fisiopatológicos de los diferentes sistemas de órganos de la periferia hacia el sistema nervioso central. Como tal, el aumento de la actividad o "sensibilización 'de los nervios aferentes mesentéricos se ha asignado un papel importante en la fisiopatología de la hipersensibilidad visceral y síndromes de dolor abdominal.

La actividad del nervio aferente mesentérica se puede medir in vitro en un segmento intestinal aislado que se monta en un baño de órganos propósito construido y de la que se aísla el nervio esplácnico, permitiendo a los investigadores para evaluar directamente la actividad del nervio adyacente al segmento gastrointestinal. La actividad puede ser registrado en la línea de base en condiciones estandarizadas, durante la distensión del segmento o después de la adición de compuestos farmacológicos entregados intraluminal o serosally. Esta técnica permiteel investigador para estudiar fácilmente el efecto de fármacos que se dirigen al sistema nervioso periférico en las muestras de control; Además, proporciona información crucial sobre cómo la actividad neuronal se altera durante la enfermedad. Cabe señalar sin embargo, que la medición de la actividad de la descarga neuronal aferente solo constituye una estación de relevo en el complejo neuronal cascada de señalización, y los investigadores deben tener en cuenta no pasar por alto la actividad neuronal en otros niveles (por ejemplo, los ganglios de la raíz dorsal, médula espinal o el sistema nervioso central; ) con el fin de dilucidar plenamente la fisiología neuronal compleja en la salud y la enfermedad.

aplicaciones utilizadas comúnmente incluyen el estudio de la actividad neuronal en respuesta a la administración de lipopolisacárido, y el estudio de la actividad del nervio aferente en modelos animales de síndrome del intestino irritable. En un enfoque más de traslación, el segmento intestinal de ratón aislado puede estar expuesto a sobrenadantes del colon de los pacientes con SII. Además, una modificaciónde esta técnica ha sido recientemente demostrado ser aplicable en especímenes de colon humano.

Introduction

la señalización sensorial y la percepción del dolor es un proceso complejo que resulta de una compleja interacción entre los nervios aferentes, neuronas espinales, ascendientes y descendientes vías facilitadoras e inhibidoras y varias regiones cerebrales diferentes. Como tal, los cambios en uno o más de estos niveles pueden resultar en la señalización sensorial alterada y dolor visceral en estados de enfermedad. Para el estudio de todos estos diferentes aspectos de la señalización sensorial múltiples se han desarrollado técnicas que van desde los experimentos de células individuales (por ejemplo, imágenes de calcio en las neuronas) para modelos animales enteros (por ejemplo, las respuestas de comportamiento, tales como la respuesta visceromotor). La técnica descrita en este documento permite a los investigadores para evaluar específicamente la actividad del nervio aferente in vitro a partir de un segmento aislado de intestino delgado o el colon en roedores. En resumen, un segmento gastrointestinal aislado (por lo general yeyuno o colon) está montado en una cámara de registro perfundida propósito construido con una K fisiológicosolución rebotes. El nervio esplácnico se diseca y se conecta a un electrodo permitir el registro de la actividad neuronal aferente en los nervios aferentes viscerales o pélvicos. La actividad del nervio puede ser grabada, basales o en respuesta a las crecientes presiones intraluminales y / o compuestos farmacológicos que se pueden aplicar ya sea directamente en la cámara de grabación (serosally), oa través de la perfusión intraluminal (la mucosa) para evaluar su efecto sobre la descarga aferente 1-6 . Es de destacar que los nervios esplácnicos también contienen fibras aferentes y eferentes viscerofugal, además de los aferentes sensoriales. Una de las principales ventajas de la grabación nervio esplácnico ex vivo es el hecho de que los investigadores pueden cuantificar la actividad del nervio sin modulación o de entrada desde el sistema nervioso central, que permite una para estudiar el efecto directo de los compuestos aplicados de forma local en la actividad nerviosa. Además, el seguimiento de los parámetros vitales, como es necesario utilizar el enfoque in vivo (ver más abajo), es no Ya no es importante. In vitro grabación esplácnica es finalmente mucho menos tiempo que su contraparte in vivo.

actividad neuronal aferente en respuesta a otros estímulos, como frotación de la mucosa, de sondeo usando filamentos de von Frey o estiramiento del segmento, se puede estudiar en una configuración experimental modificado en el que se fija el tejido intestinal y abrió longitudinalmente (que está en contraste con nuestra configuración utilizando un segmento intacto), como se ha descrito en un número anterior 7,8. Además, sólo recientemente, una técnica fue descrita para estudiar la activación del nervio aferente del colon en la pared del colon en sí a través de imágenes de calcio, de nuevo utilizando un inmovilizada, longitudinalmente abierto segmento 9.

Una versión alternativa de esta técnica in vivo consiste de medir la activación neuronal cerca de la entrada del aferente en la médula espinal. En resumen, el animal sedado se coloca en la posición prona, exposing la médula espinal lumbosacra a la que el nervio aferente de los proyectos de interés por medio de la laminectomía, la construcción de una parafina lleno bien con la piel de la incisión y drapeado la rootlet dorsal sobre un electrodo de platino bipolar 10,11. Esta técnica permite además a los investigadores caracterizar las fibras en base a su velocidad de conducción, y distinguen las fibras C no mielinizadas de Aδ fibras finas mielinizadas. Además, raicillas dorsal contienen exclusivamente fibras aferentes sensoriales, en contraste con los aferentes y eferentes nervios esplácnicos mixtos mencionados anteriormente.

Grabación de descarga del nervio aferente in vitro a partir de segmentos intestinales aislados también se puede hacer uso de muestras humanas, como dos grupos de investigación publicados de forma independiente manuscritos primeros-en-hombre registro de la actividad del nervio aferente del colon en la resección especímenes humanos 12,13. La aplicación de esta técnica podría resultar en una mayor facilidad translatien los datos murinos al estado humano, y podría permitir a los investigadores a identificar fácilmente las drogas dirigidas a los nervios sensoriales sensibilizado. La importancia clínica de la caracterización de la actividad aferente del nervio, así como el descubrimiento de nuevos reactivos terapéuticos que se dirigen a la actividad del nervio aferente exorbitante, se ha discutido detalladamente por muchos expertos en el campo de 14 a 19.

La mencionada técnica in vitro complementa el más comúnmente conocidos en la medición in vivo de la actividad aferente del nervio. Durante la medición de la actividad neuronal in vivo, la actividad del nervio se puede medir directamente en el animal sedado durante el cual se identifica el segmento de interés y posteriormente intubado, y una parafina llenas de líquido también se construye utilizando la pared abdominal y la piel del roedor 20. a continuación, se identificó el nervio aferente de interés, se seccionaron y se coloca sobre un electrodo de platino bipolar, lo que permite MEDICIÓN actividad neuronalt. Esta técnica permite al investigador para modular la actividad del nervio aferente en vivir aunque los animales sedados; como tal, se puede estudiar la actividad neuronal en respuesta a las interferencias, tales como distensión luminal o la administración intravenosa de un compuesto.

La investigación traslacional se centra hoy en día principalmente en la aplicación de los sobrenadantes de origen humano (por ejemplo., A partir de biopsias de colon, células mononucleares de sangre periférica cultivadas, etc.) en yeyuno y / o del colon aferentes de ratón 21,22. Los investigadores pueden aplicar directamente sobrenadantes ya sea en el baño de órganos o en la solución intraluminal que perfunde el segmento de intestino, de modo que los efectos diferenciales de la serosa frente a la aplicación de la mucosa se pueden estudiar en la descarga del nervio aferente. Como tal, se demostró que supernatans biopsia de la mucosa del colon de pacientes con síndrome del intestino irritable pueden causar hipersensibilidad en los aferentes de colon de ratón, conejillo de indias neuronas submucosas y de la raíz dorsal de ratónneuronas ganglionares 21,23,24.

Por último, el registro de actividad neuronal no se limita a la mesentérica y / o las neuronas de la pelvis que inervan el tracto gastrointestinal. Otros han demostrado que las grabaciones de los nervios se pueden realizar en los aferentes suministro de la articulación de rodilla 25, mientras que otros han caracterizado la actividad aferente del nervio vejiga, así 26-28, y ha demostrado que los aferentes de la pelvis de la vejiga, así el tracto gastrointestinal convergen, resultando posiblemente en neuronal 29 diafonía.

Protocol

Todos los experimentos con animales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Ética Médica y el uso de animales de experimentación en la Universidad de Amberes (número de expediente 2012-42).

1. Preparación del tejido del yeyuno y colon aferentes Nervios

  1. Preparación del nervio aferente yeyunal
    1. Practicar la eutanasia de roedores del roedor adolescente o adulto que ha sido aprobado antes del experimento por el Comité Ético local (por ejemplo., Sedación terminal seguido por punción cardiaca, la dislocación cervical, etc.).
      NOTA: Se utilizó la dislocación cervical a sacrificar los animales resultantes tanto en experimentos sin necesidad de anestesia o más atención postquirúrgica que los tejidos se procesan adicionalmente in vitro.
      NOTA: Edad se ha demostrado para atenuar aferentes mesentérica funciones mechanosensory 30, por lo tanto, aconsejan los investigadores a adherirse a un grupo de edad determinado por la duración deun solo experimento.
    2. Colocar el animal de laboratorio sacrificado en la posición supina y realizar una incisión en la línea media abdominal a través de la capa de piel y músculo abdominal utilizando un bisturí, que se extiende desde el proceso xifoides hasta el hueso púbico.
    3. Bañar la cavidad abdominal con solución de Krebs fría con el fin de evitar que los tejidos intraabdominales de la desecación (Krebs composición: NaCl mM 120,03, KCl 6,22 mM, 1,57 mM NaH 2 PO 4, 15,43 mM de NaHCO3, 1,21 mM MgSO 4, 11,52 mM D-glucosa y 1,52 mM CaCl 2).
    4. Rápidamente extirpar todo el yeyuno usando unas tijeras afiladas mediante la escisión de aproximadamente 20 cm del intestino delgado comenzando inmediatamente distal del ángulo duodeno-yeyunal, teniendo cuidado de no dañar las estructuras circundantes y mantener el mesenterio del intestino, que contiene los vasos sanguíneos del yeyuno y los nervios aferentes, intacta.
      NOTA: Para la mera disección yeyunal en la cavidad abdominal, uno no necesita utilizarun microscopio estereoscópico, ya que esto puede ser fácilmente visualizado con el ojo desnudo.
    5. Coloque el yeyuno extirpados en solución de Krebs enfriado con hielo y mantener en hielo, mientras que la oxigenación de la solución de Krebs continuamente con carbógeno (95% O 2, 5% de CO 2).
    6. Cortar el yeyuno con unas tijeras afiladas en bucles largos de aproximadamente 3 cm. Observar el haz mesentérica que contiene los vasos y nervio esplácnico algún lugar cerca del centro del bucle respectivo.
    7. Vaciar cada segmento con solución de Krebs utilizando un catéter contundente para eliminar contenido luminal y el quimo ya que contienen enzimas digestivas que acelerarán el deterioro de la muestra de tejido in vitro.
      NOTA: Tener cuidado de no dañar el lumen del bucle durante el lavado, como la destrucción de las vellosidades dará lugar a la liberación de mediadores que pueden alterar la actividad del nervio aferente.
    8. Identificar el segmento para medir la actividad de los nervios aferentes (por ejemplo, la primera SEGM yeyunalnt distal del ligamento de Treitz o el ángulo duodenoyeyunal), y el lugar esto en una cámara de registro construido especialmente recubierto con una capa de elastómero de silicona.
      NOTA: El comienzo del yeyuno se define anatómicamente como la parte del intestino delgado en el que el ligamento de Treitz cruza el intestino delgado, también llamado el ángulo duodenoyeyunal.
      NOTA: Cubrir el fondo de la cámara de registro con una capa de elastómero de silicona delgada con suficiente antelación antes del inicio del experimento. La preparación de esta capa de elastómero se debe realizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante 1.
    9. Perfundir la cámara constantemente con cálido, carbogenated solución de Krebs a una velocidad de 10 ml / min y mantener la temperatura de Krebs en la constante de cámara de registro a 34 ° C.
    10. Montar el segmento yeyunal en el baño de órganos para que el extremo bucal está conectado al controlador de jeringa proporcionando flujo luminal y el extremo aboral se conecta a la salida. ligeramente stvomitar el segmento, pero tenga cuidado de no ejercer una tensión excesiva. Fije ambos extremos firmemente con 4/0 ligaduras de seda a los puertos de entradas y salidas.
    11. Una el conductor jeringa al extremo oral, y perfundir el segmento yeyunal intraluminal con una solución de Krebs (no oxigenado, la temperatura ambiente) a una velocidad de 10 ml / hr.
    12. Pin el mesenterio del plano segmento intestinal montada contra la capa inferior de elastómero de silicona, usando pasadores de insectos. Estirar el mesenterio a cabo con el fin de optimizar la visualización del haz mesentérica; no ejerza presión sobre el paquete o el yeyuno.
    13. Realizar una prueba de rampa distensión (véase más adelante) mediante el cierre de la puerta de salida hasta que la presión intraluminal del segmento intestinal alcanza 60 mmHg, a fin de verificar que no hay solución Krebs intraluminal tiene fugas desde el segmento montado. Observar un aumento uniforme de la presión intraluminal y sin interrupciones.
    14. Observar pequeñas contracciones del segmento (wav peristálticaES) durante la fase inicial de la distensión. Si es necesario, bloquear la actividad peristáltica mediante la adición de 1 M de los de tipo L nifedipina bloqueador del canal de calcio a la solución de Krebs.
      NOTA: La adición de 1 M de atropina para la solución de Krebs, además de nifedipina, paralizará por completo el segmento intestinal. Sin embargo no tenemos experiencia personal con el uso y el efecto de la atropina sobre la grabación del nervio aferente.
    15. Bajo un microscopio estereoscópico, suavemente empezar a despegarse del tejido adiposo del mesenterio tirando suavemente con dos pequeñas pinzas, teniendo cuidado de no dañar los vasos y el nervio aferente que yacen enterrados en el tejido graso.
    16. Comience a una distancia alejada del yeyuno, y exponer los dos vasos sanguíneos en el haz mesentérica.
    17. Observar el nervio aferente yeyunal entre ambos vasos como un hilo delgado, blanco encapsulada en el tejido adiposo. Sólo diseccionar más proximal hacia el yeyuno desprendiendo suavemente el tejido graso de distancia usando pinzas cuando lasidentificación inicial de los dos vasos mesentéricos y / o en el nervio aferente es difícil.
    18. Diseccionar el nervio mesentérica yeyunal del segmento libre a una distancia de varios milímetros, mediante la eliminación de la adherencia de tejido adiposo en el nervio.
    19. Seccionar el nervio con unas tijeras afiladas tejido. Si es necesario, retire la grasa y tejido conectivo restante, así como la vaina epineuronal tirando suavemente con las pequeñas pinzas.
    20. El uso de un micromanipulador, bajar la punta del electrodo de succión, conectado a una jeringa con el émbolo, en el baño de órganos; entonces, mediante la manipulación del émbolo, aspirar suavemente un poco de solución de Krebs de baño de órganos de forma que la punta del electrodo se sumerge en la solución de Krebs (Figura 1). Asegúrese de que la solución de Krebs cubre el electrodo de alambre en el interior del electrodo de succión.
      NOTA: Preparar el capilar de succión de vidrio de borosilicato que contiene el electrodo de alambre antes del inicio del experimento nosing un extractor de pipeta.
    21. Coloque la punta del electrodo de succión inmediatamente al lado de la hebra del nervio aferente seccionado y sacar la hebra del nervio seccionado en el capilar en toda su longitud.
    22. Maniobra de la punta del electrodo hacia una parte del tejido adiposo y aspirar esto en el capilar de vidrio mientras firmemente aspiración con el émbolo, con lo que mecánicamente "sellado" el nervio en el capilar de los contenidos del baño de órganos.
    23. Verificar la grabación de la actividad del nervio aferente utilizando el sistema de adquisición de datos, por ejemplo, mediante la realización de un aumento de la distensión inducida rampa en aferente cocción (vide infra). Después del aislamiento del nervio en el electrodo de succión, estabilizar la preparación durante 15 min con el fin de obtener una actividad del nervio aferente espontánea estado estacionario antes de realizar los experimentos reales.
    24. Para llevar a cabo rampa de distensión, distender el segmento intestinal mediante el cierre de la puerta de salida, lo que lleva a gradaumento ual de la presión en el segmento intestinal (hasta 60 mm de Hg). Sólo debe realizar el protocolo experimental deseado cuando tres distensiones de rampa consecutivos (con un intervalo de 15 min) producen una descarga de múltiples unidades reproducible (Figura 2).
  2. Preparación de las vías aferentes lumbares esplácnica (nervio aferente del colon)
    NOTA: La disección de los nervios aferentes del colon requiere una disección más detallada. Las desviaciones del protocolo anterior 'yeyunal' se enumeran a continuación:
    1. La eutanasia a los animales por medio de un método humano, colocarlo en la posición supina, realizar una laparotomía media y excesivamente verter solución de Krebs enfriado con hielo en la cavidad abdominal. NOTA: Krebs composición: NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, 22 de NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM D-glucosa y CaCl 2 2,5 mM, 3 mM indometacina.
      NOTA: Tenga en cuenta la composición alterada de la solución de Krebs; indometacina se añade a la tanlución con el fin de prevenir las alteraciones de la actividad del nervio aferente por las prostaglandinas.
    2. Desechar el tejido adiposo, la vejiga y los genitales internos, y cambiar suavemente el intestino delgado a un lado en la cavidad abdominal. Realizar una prelevation ampliada de la parte distal del colon con nervios mesentéricos intactas desde el abdomen.
      NOTA: puntos de referencia importantes que pueden ser incluidos en esta disección para ayudar a las operaciones de preparación del tejido incluye la aorta abdominal y la vena cava, el riñón izquierdo y la musculatura del suelo pélvico.
      NOTA: Durante la disección, tener cuidado de no ejercer una tracción sobre el tejido de conexión entre dos puntos y la aorta abdominal, ya que esta región contiene los nervios esplácnicos lumbares.
    3. Transferir el segmento de tejido en el elastómero de silicona forrada cámara de registro. Utilice la arteria renal izquierda, que se origina de la aorta abdominal, como punto de partida. Siga la aorta abdominal en la dirección aboral, el encuentro de los superiores mesenteric arteria junto con la celíaca y ganglio mesentérico superior. Por último, llegar al tejido de conexión entre la parte distal del colon y la aorta, en el que se encuentra el nervio de interés.
    4. Identificar la arteria mesentérica inferior procedente de la aorta abdominal. El nervio esplácnico lumbar aferente puede ser identificado en la base de la arteria mesentérica inferior; que corre paralela a la arteria (Figura 3).
    5. Después de la transección del nervio, despegue lentamente la vaina de tejido conectivo que rodea y se burlan del nervio en varios hilos finos. Asegúrese de mantener una distancia segura de los dos puntos.
    6. Dibuje uno de estos hilos individuales en el electrodo de succión, "sello" del capilar y la zona de tejido adiposo como se describe y llevar a cabo el protocolo experimental deseada previamente.
    7. Descarte cualquier tejido superfluo que está presente en el baño de órganos (por ejemplo, los riñones, los vasos abdominales, el tejido muscular), unas éstos pueden perturbar la señal aferente.
      NOTA: Nifedipina (con 1 m) se puede añadir a la solución de Krebs en caso de que la señal nerviosa aferente es perturbada por el movimiento intestinal espontánea debido a las contracciones de las células musculares lisas.
      NOTA: Los medicamentos pueden ser administrados en tres sitios diferentes: 1) serosally disolviendo el compuesto deseado en el Krebs que perfunde la cámara de grabación, 2) directamente en el baño de órganos mientras se detiene temporalmente la perfusión o 3) intraluminal disolviendo el compuesto de interés en la solución de Krebs en la unidad de jeringa. La desensibilización del nervio aferente puede ocurrir cuando las dosis acumulativas de un compuesto se administran demasiado rápido consecutivamente.

Figura 1
Figura 1: Descripción esquemática de la Construido específicamente cámara de registro y electrodos de aspiración Descripción detallada de la téc. configuración de cal con el electrodo de succión y la cámara de grabación en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Rastreo Representante de la grabación in vitro de la actividad nerviosa aferente yeyunal de grabación normal de la actividad del nervio aferente de varias unidades yeyunal (imp.sec -1) (panel superior) al inicio del estudio y en respuesta a la rampa 2 distensiones hasta 60 mmHg. (panel inferior), y la posterior identificación (análisis WaveMark) de diferentes individuales-nudos en la señal nerviosa (tercer panel). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3:. Neuroanatomía del Colon A) La información sensorial desde el colon es transportado a través de los nervios del colon lumbar (LCN) hacia el sistema nervioso central, con el LCN corriendo en las proximidades de la arteria mesentérica inferior (IMA). Una parte de las fibras de este nervio lumbar colon supuesto lo largo del nervio intermesenteric (IMN) para formar los nervios esplácnicos lumbares (LSN). El ganglio mesentérico inferior (IMG) se encuentra en el origen de la IMA de la aorta abdominal. Grabación distal de la guía de implementación es obligatoria debe desear investigadores para estudiar la actividad del nervio aferente viscerofugal. B) Una descripción esquemática de la disposición experimental. grabación aferente de la LCN se realiza en un órgano tanto por medio de un electrodo de succión conectado al sistema de adquisición de datos. distensión de rampa se puede realizar tras el cierre del orificio de salida, mientras que la continuación del flujo de entrada deSolución de Krebs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Adquisición de Datos

  1. Registrar la actividad de los nervios a través de un electrodo de succión conectada a un cabezal de la platina. Amplificar (ganar 10k) y filtrar la señal (paso de banda de 500 - 5.000 Hz) 20.
    NOTA: Un eliminador 50/60 Hz de ruido deben incluirse en el montaje experimental con el fin de eliminar las señales de ruido de interferencia eléctrica 50/60 Hz. La señal es digitalizada automáticamente y muestreada a 20 kHz para el análisis.

3. Análisis de 5,20

  1. Reporte la descarga aferente del nervio como el número total de impulsos / segundo para todo el nervio o utilizar software especializado para llevar a cabo un análisis más detallado, como grabaciones de unidades múltiples de la actividad del nervio en general contienen los potenciales de acción de diferente forma, amplitud y anchura, que corresponde a diferentes nervio unidadesen cada fibra aferente (Figura 2).
  2. Coincidir wavemarks individuales a las plantillas predefinidas, lo que permite la discriminación entre unidades únicas. Antes de la asignación de un pico a una determinada marca de onda, una relación señal a ruido de> 2: 1 debe ser forzada.
    NOTA: Durante el análisis WaveMark, se construye una nueva plantilla cuando al menos 10 picos similares se identifican mediante el software de análisis. Sin plantilla se construye para las formas más raras de 1 de cada 50 picos. Un pico se corresponde con una plantilla usando el principio de análisis de componentes cuando al menos 80% de sus puntos son idénticas al pico de plantilla. comparación de plantillas es dependiente del operador, y siempre debe ser realizada por el mismo investigador en una forma ciega.
  3. Calcular el potencial de acción respuestas restando la actividad espontánea en la línea base (presión intraluminal de 0 mmHg) a partir de la respuesta durante la distensión en puntos de tiempo fijos (5 mmHg de incremento de 0 a 20 mmHg de la presión intraluminal, incrementos de 10mmHg de 20 mmHg en adelante). Medir la descarga aferente línea de base utilizando un tamaño de bin de 10 seg.
  4. Utilice el análisis de una sola unidad para clasificar las fibras en base a su perfil de descarga durante la rampa de distensión (Figura 4). Además, el análisis de una sola unidad se puede utilizar para estudiar el perfil sensible a la quimioterapia de diferentes tipos de unidades, como no todos los tipos de unidades mostrarán la misma actividad de tiro alterada en respuesta a un fármaco o compuesto.
  5. Clasificar las fibras como fibras de bajo umbral ( «LT», por lo general ejercen aumento de la secreción a las presiones de distensión inferiores), fibras de alto umbral ( 'HT', ejercen una mayor secreción en las más altas presiones de distensión), fibras de amplio rango dinámico ( "IDM", demostrar aumento de tiro durante toda la rampa de distensión) o aferente mecánicamente insensible ( 'MIA', las fibras nerviosas que normalmente no responden a la rampa distensiones) 5; 20.
  6. Expresar la respuesta de disparo del nervio a 20 mmHg como el porcentaje de la respuesta máxima de disparo durante la distensión (LT%), ya que refleja el grado de cocción a baja presión de distensión.
    NOTA: Por lo tanto, las fibras de LT se caracterizan por una LT%> 55%, mientras que HT se definen por un valor de <15%. Los valores para las unidades de WDR oscilan entre 15 y 55% (20). Una muestra de tiro MIA aferente espontánea que se ve afectado por distensiones.

Figura 4
Figura 4:. Representación esquemática de las diferentes unidades de fibra aferente función de su perfil mechanosensitive Las unidades se clasifican en base al porcentaje (LT%) de su tasa de disparo a 20 mm Hg de presión de distensión en comparación con la respuesta máxima de disparo durante la distensión. fibras de bajo umbral (panel superior izquierdo) predominantemente muestran una actividad nerviosa aumentado a bajas presiones de distensión, lo que resulta en una LT% de más de 55%. unidades de umbral alto (superior derechapanel) por el contrario sólo muestran un aumento de la tasa de disparar a presiones nocivas (LT% <15). fibras de amplio rango dinámico (panel inferior izquierdo) muestran un aumento gradual de la actividad nerviosa durante toda la distensión (LT% que oscila entre 15 y 55), mientras que las fibras mecánicamente insensibles (panel inferior derecho) no responden a las crecientes presiones de distensión. LT%: (aferente disparando a 20 mmHg cocción aferente / máxima) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

la actividad del nervio aferente yeyunal se midió al inicio del estudio y en respuesta a la distensión en la rampa 9 de ocho semanas de edad de sexo masculino DE-1 ratones. Los animales fueron alojados en grupos en condiciones estandarizadas (6 animales por jaula, 20 - 22 ° C, humedad 40 - 50%, 12 ciclo luz-oscuridad h) con acceso ilimitado al agua del grifo y Chow regular. segmentos de yeyuno de ratones muestran la descarga del nervio aferente espontánea irregular al inicio del estudio a una presión intraluminal de 0 mmHg (media actividad espontánea 11,47 ± 3,31 imp / seg).

La actividad de los nervios aferentes yeyunal aumentó tras realizar distensiones rampa hasta 60 mmHg. Típicamente, el aumento en la actividad del nervio aferente siguiendo el aumento de la presión intraluminal se caracteriza por una respuesta bifásica (Figura 5), que consiste en un rápido aumento inicial de la actividad de disparo hasta la presión intraluminal llega a 20 mmHg, which puede atribuirse principalmente al aumento de la tasa de disparo de las fibras de bajo umbral. Esto es seguido por una fase de meseta, después de lo cual un segundo aumento de la actividad de disparo se puede observar a partir de 40 mmHg en adelante, que representa la activación de las fibras de umbral predominantemente altos.

Sobre la base de sus formas de onda, unidades únicas se pueden discriminar en cada grabación de múltiples unidades y se clasifican en una de las mencionadas cuatro categorías. En 9 ratones, se discriminados 40 unidades diferentes (4.44 ± 1.01 unidades / yeyunal nerviosas aferentes), con las unidades de LT siendo los más prevalentes, seguido de WDR y fibras HT (Figura 6). La actividad de tiro de las diferentes unidades en respuesta a la rampa distensión se puede observar en la Figura 7.

Figura 5
Figura 5: g> mesentérica de descarga aferente del nervio (imp.sec - 1). en ratones de tipo salvaje en la deceleración Distensión mesentérica multi-unidad de descarga del nervio aferente (imp / seg-1) en ratones de tipo silvestre durante rampa para toda la distensión del nervio. Los valores representan la descarga aferente media ± SEM, n = 9 ratones. imp.sec -1:. impulsos por segundo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. Una sola unidad de distribución de 40 unidades identificadas en los nervios aferentes yeyunal de 9 ratones de tipo salvaje HT: fibra de alto umbral, LT: baja en fibra umbral, MIA: Fibra mecánicamente insensible, WDR: fibra de amplio rango dinámico._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7:. Las curvas de presión-respuesta para los diferentes tipos de subunidades en ratones de tipo salvaje La descarga del nervio aferente de una sola unidad (imp.sec -1) de las cuatro unidades diferentes que se pueden identificar, en ratones de tipo salvaje en la deceleración distensiones. Una fibra de umbral bajo (LT, figura superior izquierda) se caracteriza por un rápido aumento inicial de la actividad de tiro durante distensiones, mientras que las fibras de alto umbral (HT, más baja figura de la izquierda) sólo se muestran aumentó durante la cocción presiones intraluminales nocivos. fibras de amplio rango dinámico (WDR, figura superior derecha) muestran un aumento constante en la actividad de tiro durante toda la distensión, y las fibras aferentes mecano-sensible (MIA, cifra inferior derecha) no responden a las crecientes presiones intraluminales. valores representanteresentir de descarga aferente media ± sem imp.sec -1:. impulsos por segundo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo en este documento se describe una técnica de laboratorio reproducible para estudiar la actividad del nervio aferente mesentérica en roedores y usadas por nuestro grupo y otros 3,4,7,8,12,20,21,31. Los pasos críticos en el protocolo incluyen el aislamiento rápido del tejido, la aspiración de la hebra de nervio en el electrodo de succión y el "sellado" adecuada del capilar de vidrio desde el baño de órganos mediante la aspiración de tejido adiposo que rodea en el capilar. La abertura del capilar de vidrio se debe determinar con precisión: una abertura que es demasiado pequeño complicará la aspiración de la hebra de nervio en el electrodo, mientras que un demasiado amplia abertura impedirá el "sellado" del capilar con el tejido adiposo, dando por resultado redundante ruido de fondo que obstaculizará el análisis (grabaciones de baja relación señal-ruido). Para permitir la clasificación de una sola unidad fiable, los aferentes esplácnicos deben dividirse en diferentes hebras con el fin de reducir elnúmero de unidades en la grabación. Por lo general, sugerimos el objetivo de tener un máximo de 4 - 5 unidades en cada grabación. Por lo tanto, los investigadores deben ajustar la apertura sobre la base de la fibra de interés, y el animal de laboratorio que se aplica.

Otro punto crítico abarca la puesta a tierra suficiente de la configuración experimental. El electrodo de succión y la cámara de registro deben estar conectados a tierra adecuada y cubiertas por una jaula de Faraday con el fin de reducir al mínimo interferir campos eléctricos que impiden el análisis de la actividad neuronal, mientras que el resto del equipo incluyendo los aparatos de impresión, conductor jeringa etc. debe ser instalado fuera de la jaula .

Mediante el registro de la actividad del nervio aferente en estrecha proximidad con el yeyuno o colon, se puede aislar la primera parte de la cadena de transducción de señales aferentes y estudiar fácilmente la contribución y las alteraciones que se producen a nivel aferente única sin la interferencia de la central de Nervsistema de unidades organizativas. Una de las limitaciones de esta técnica es el hecho de que en las observaciones in vitro no siempre se puede extrapolarse sin esfuerzo a la puesta en vivo, como la configuración in vitro sólo incorpora una estación de relevo en el complejo de señalización nerviosa cascada. Como tal, una visión más amplia se debe hacer en la incorporación de todas las demás estaciones, tales como los ganglios de la raíz dorsal, sistema nervioso central (por ejemplo, imágenes funcionales del cerebro) y descendente (inhibitorias) vías eferentes.

Otra ventaja de este método constituye el procedimiento técnico más simple, como uno ya no tiene que supervisar el bienestar del animal de laboratorio que proporciona la muestra gastrointestinales. Por otro lado es la medición in vitro de la actividad neuronal no es adecuado para dilucidar el efecto de un fármaco administrado por vía sistémica en la descarga aferente del nervio, pero los investigadores puede superar este obstáculo teóricamente mediante la administración sistémica del medicamento of interés para el animal, seguido de la grabación ex vivo in vitro de la actividad del nervio aferente. Sin embargo, uno debe estar atento al hecho de que cualquier fármaco presente en la cámara de grabación se diluye debido al baño de perfusión durante la disección y grabaciones posteriores. Por último, la realización de grabaciones in vitro nervio esplácnico utilizando animales genéticamente modificados podría permitir a los investigadores para dilucidar plenamente el papel de los diferentes canales y receptores expresados en las fibras aferentes.

Los investigadores de intentar implementar esta técnica también debe tener en cuenta que la identificación y el aislamiento de las vías aferentes mesentérica y aferentes pélvicos requiere, obviamente, el conocimiento de la anatomía básica y capacitación técnica, y los investigadores debe estar familiarizado con los principios básicos de electrofisiología neuronal.

El ajuste in vitro, además, permite a los investigadores identificar fácilmente posible alquitrán farmacológicacoge, y proporciona una visión sobre el papel fisiológico de la actividad neuronal, así como la señalización sensorial alterado en varios procesos de enfermedad.

En el caso de mediciones aferentes yeyunales, varios segmentos de tejido de un solo animal se pueden estudiar simultáneamente, una característica que es bastante difícil el uso de una configuración in vivo. Sin embargo los investigadores deben interpretar con cautela los resultados obtenidos a partir de diferentes segmentos, como las diferencias regionales pudieran sesgar los resultados. Por lo tanto, le recomendamos para medir constantemente la actividad del nervio aferente desde el mismo sitio (por ejemplo, primer segmento distal del ligamento de Treitz o el ángulo duodeno-yeyunal).

aplicaciones actuales y futuras típicos de esta técnica comprenden la selección de compuestos farmacológicos que pueden alterar la sensibilización de los aferentes mesentéricos durante patologías que se caracterizan por la hipersensibilidad visceral y dolor. Como ya se ha mencionado antes, el objetivo de lacompuestos SE puede encontrarse en algún lugar a lo largo del sistema nervioso intrincada que van desde el sistema nervioso intrínseco entérico para el cerebro; como tal, la caracterización y la modulación de la actividad del nervio aferente contribuye a la imagen más amplia que también abarca la formación de imágenes de calcio de los nervios entéricos intrínsecas y de la raíz dorsal de los ganglios, la medición de la respuesta visceromotor como un indicador de la hipersensibilidad visceral in vivo, y formación de imágenes funcionales del cerebro, entre otros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium chloride (NaCl) VWR Chemicals 27,810,295 compound Krebs solution
potassium chloride (KCl) Acros organics 196770010 compound Krebs solution
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) VWR Chemicals 1,063,461,000 compound Krebs solution
sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1,063,291,000 compound Krebs solution
magnesium sulfate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 compound Krebs solution
calcium chloride (CaCl2) Merck 23,811,000 compound Krebs solution
D-glucose VWR Chemicals 1011175P compound Krebs solution
Distilled water compound Krebs solution
PVC tubing Scientific Laboratory Supplies The intestinal segment should be mounted over PVC tubing
Silicone tubing Scientific Laboratory Supplies The rest of the tubing, ideally silicone-based - more easily dislodging of debris in the tubing
Silk thread Pearsall Limited 10B15S220 Attachment of the segment over the PVC tubing
Syringe driver Harvard Apparatus 55-2222 Intraluminal infusion of Krebs
Binocular - including 10X magnification in oculair Zeiss STEMI 2000 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus 507214 Heating of the organ chamber
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom
Spike2 software Recording and analysis of the data
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm Austerlitz insect pins minutiens Dissection of the afferent nerve
Tweezer Dumont #5 inox 11 cm World Precision Instrument 500341 Dissection of the afferent nerve
Scissors, spring, 14 cm World Precision Instrument 15905 Dissection of the afferent nerve
DB digitimer  NL 108T2/10 pressure transducer
Micromanipulator Narishige M-3333 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator X-4 rotating block 3D manipulation of the suction electrode
Micromanipulator GJ-8 magnetic stand 3D manipulation of the suction electrode
LightSource Euromex Microscopes Holland EK-1 Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve
CED 1401 Recording Apparatus Recording of afferent nerve activity
Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Instruments Elimination of background noise
Infusion Pump Gibson Minipuls 2 Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm World Precision Instrument MEH2SW Suction electrode for isolation of the afferent fiber
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID World Precision Instrument 1B150-4 Capillary for the isolation of the afferent nerve

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<em>In Vitro</em> de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon
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Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).More

Nullens, S., Deiteren, A., Jiang, W., Keating, C., Ceuleers, H., Francque, S., Grundy, D., De Man, J. G., De Winter, B. Y. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (116), e54576, doi:10.3791/54576 (2016).

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