Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.
nervios aferentes no sólo transmiten información relativa a la fisiología normal, sino también la señal homeostasis perturbado y procesos fisiopatológicos de los diferentes sistemas de órganos de la periferia hacia el sistema nervioso central. Como tal, el aumento de la actividad o "sensibilización 'de los nervios aferentes mesentéricos se ha asignado un papel importante en la fisiopatología de la hipersensibilidad visceral y síndromes de dolor abdominal.
La actividad del nervio aferente mesentérica se puede medir in vitro en un segmento intestinal aislado que se monta en un baño de órganos propósito construido y de la que se aísla el nervio esplácnico, permitiendo a los investigadores para evaluar directamente la actividad del nervio adyacente al segmento gastrointestinal. La actividad puede ser registrado en la línea de base en condiciones estandarizadas, durante la distensión del segmento o después de la adición de compuestos farmacológicos entregados intraluminal o serosally. Esta técnica permiteel investigador para estudiar fácilmente el efecto de fármacos que se dirigen al sistema nervioso periférico en las muestras de control; Además, proporciona información crucial sobre cómo la actividad neuronal se altera durante la enfermedad. Cabe señalar sin embargo, que la medición de la actividad de la descarga neuronal aferente solo constituye una estación de relevo en el complejo neuronal cascada de señalización, y los investigadores deben tener en cuenta no pasar por alto la actividad neuronal en otros niveles (por ejemplo, los ganglios de la raíz dorsal, médula espinal o el sistema nervioso central; ) con el fin de dilucidar plenamente la fisiología neuronal compleja en la salud y la enfermedad.
aplicaciones utilizadas comúnmente incluyen el estudio de la actividad neuronal en respuesta a la administración de lipopolisacárido, y el estudio de la actividad del nervio aferente en modelos animales de síndrome del intestino irritable. En un enfoque más de traslación, el segmento intestinal de ratón aislado puede estar expuesto a sobrenadantes del colon de los pacientes con SII. Además, una modificaciónde esta técnica ha sido recientemente demostrado ser aplicable en especímenes de colon humano.
la señalización sensorial y la percepción del dolor es un proceso complejo que resulta de una compleja interacción entre los nervios aferentes, neuronas espinales, ascendientes y descendientes vías facilitadoras e inhibidoras y varias regiones cerebrales diferentes. Como tal, los cambios en uno o más de estos niveles pueden resultar en la señalización sensorial alterada y dolor visceral en estados de enfermedad. Para el estudio de todos estos diferentes aspectos de la señalización sensorial múltiples se han desarrollado técnicas que van desde los experimentos de células individuales (por ejemplo, imágenes de calcio en las neuronas) para modelos animales enteros (por ejemplo, las respuestas de comportamiento, tales como la respuesta visceromotor). La técnica descrita en este documento permite a los investigadores para evaluar específicamente la actividad del nervio aferente in vitro a partir de un segmento aislado de intestino delgado o el colon en roedores. En resumen, un segmento gastrointestinal aislado (por lo general yeyuno o colon) está montado en una cámara de registro perfundida propósito construido con una K fisiológicosolución rebotes. El nervio esplácnico se diseca y se conecta a un electrodo permitir el registro de la actividad neuronal aferente en los nervios aferentes viscerales o pélvicos. La actividad del nervio puede ser grabada, basales o en respuesta a las crecientes presiones intraluminales y / o compuestos farmacológicos que se pueden aplicar ya sea directamente en la cámara de grabación (serosally), oa través de la perfusión intraluminal (la mucosa) para evaluar su efecto sobre la descarga aferente 1-6 . Es de destacar que los nervios esplácnicos también contienen fibras aferentes y eferentes viscerofugal, además de los aferentes sensoriales. Una de las principales ventajas de la grabación nervio esplácnico ex vivo es el hecho de que los investigadores pueden cuantificar la actividad del nervio sin modulación o de entrada desde el sistema nervioso central, que permite una para estudiar el efecto directo de los compuestos aplicados de forma local en la actividad nerviosa. Además, el seguimiento de los parámetros vitales, como es necesario utilizar el enfoque in vivo (ver más abajo), es no Ya no es importante. In vitro grabación esplácnica es finalmente mucho menos tiempo que su contraparte in vivo.
actividad neuronal aferente en respuesta a otros estímulos, como frotación de la mucosa, de sondeo usando filamentos de von Frey o estiramiento del segmento, se puede estudiar en una configuración experimental modificado en el que se fija el tejido intestinal y abrió longitudinalmente (que está en contraste con nuestra configuración utilizando un segmento intacto), como se ha descrito en un número anterior 7,8. Además, sólo recientemente, una técnica fue descrita para estudiar la activación del nervio aferente del colon en la pared del colon en sí a través de imágenes de calcio, de nuevo utilizando un inmovilizada, longitudinalmente abierto segmento 9.
Una versión alternativa de esta técnica in vivo consiste de medir la activación neuronal cerca de la entrada del aferente en la médula espinal. En resumen, el animal sedado se coloca en la posición prona, exposing la médula espinal lumbosacra a la que el nervio aferente de los proyectos de interés por medio de la laminectomía, la construcción de una parafina lleno bien con la piel de la incisión y drapeado la rootlet dorsal sobre un electrodo de platino bipolar 10,11. Esta técnica permite además a los investigadores caracterizar las fibras en base a su velocidad de conducción, y distinguen las fibras C no mielinizadas de Aδ fibras finas mielinizadas. Además, raicillas dorsal contienen exclusivamente fibras aferentes sensoriales, en contraste con los aferentes y eferentes nervios esplácnicos mixtos mencionados anteriormente.
Grabación de descarga del nervio aferente in vitro a partir de segmentos intestinales aislados también se puede hacer uso de muestras humanas, como dos grupos de investigación publicados de forma independiente manuscritos primeros-en-hombre registro de la actividad del nervio aferente del colon en la resección especímenes humanos 12,13. La aplicación de esta técnica podría resultar en una mayor facilidad translatien los datos murinos al estado humano, y podría permitir a los investigadores a identificar fácilmente las drogas dirigidas a los nervios sensoriales sensibilizado. La importancia clínica de la caracterización de la actividad aferente del nervio, así como el descubrimiento de nuevos reactivos terapéuticos que se dirigen a la actividad del nervio aferente exorbitante, se ha discutido detalladamente por muchos expertos en el campo de 14 a 19.
La mencionada técnica in vitro complementa el más comúnmente conocidos en la medición in vivo de la actividad aferente del nervio. Durante la medición de la actividad neuronal in vivo, la actividad del nervio se puede medir directamente en el animal sedado durante el cual se identifica el segmento de interés y posteriormente intubado, y una parafina llenas de líquido también se construye utilizando la pared abdominal y la piel del roedor 20. a continuación, se identificó el nervio aferente de interés, se seccionaron y se coloca sobre un electrodo de platino bipolar, lo que permite MEDICIÓN actividad neuronalt. Esta técnica permite al investigador para modular la actividad del nervio aferente en vivir aunque los animales sedados; como tal, se puede estudiar la actividad neuronal en respuesta a las interferencias, tales como distensión luminal o la administración intravenosa de un compuesto.
La investigación traslacional se centra hoy en día principalmente en la aplicación de los sobrenadantes de origen humano (por ejemplo., A partir de biopsias de colon, células mononucleares de sangre periférica cultivadas, etc.) en yeyuno y / o del colon aferentes de ratón 21,22. Los investigadores pueden aplicar directamente sobrenadantes ya sea en el baño de órganos o en la solución intraluminal que perfunde el segmento de intestino, de modo que los efectos diferenciales de la serosa frente a la aplicación de la mucosa se pueden estudiar en la descarga del nervio aferente. Como tal, se demostró que supernatans biopsia de la mucosa del colon de pacientes con síndrome del intestino irritable pueden causar hipersensibilidad en los aferentes de colon de ratón, conejillo de indias neuronas submucosas y de la raíz dorsal de ratónneuronas ganglionares 21,23,24.
Por último, el registro de actividad neuronal no se limita a la mesentérica y / o las neuronas de la pelvis que inervan el tracto gastrointestinal. Otros han demostrado que las grabaciones de los nervios se pueden realizar en los aferentes suministro de la articulación de rodilla 25, mientras que otros han caracterizado la actividad aferente del nervio vejiga, así 26-28, y ha demostrado que los aferentes de la pelvis de la vejiga, así el tracto gastrointestinal convergen, resultando posiblemente en neuronal 29 diafonía.
El protocolo en este documento se describe una técnica de laboratorio reproducible para estudiar la actividad del nervio aferente mesentérica en roedores y usadas por nuestro grupo y otros 3,4,7,8,12,20,21,31. Los pasos críticos en el protocolo incluyen el aislamiento rápido del tejido, la aspiración de la hebra de nervio en el electrodo de succión y el "sellado" adecuada del capilar de vidrio desde el baño de órganos mediante la aspiración de tejido adiposo que rodea en el capilar. La aber…
The authors have nothing to disclose.
SN performed the experiments described above, performed the data analysis and drafted the manuscript. AD and JDM implemented the technique at our research facilities and aided in the data analysis. HC aided in performing the experiments. WJ, CK and DG assisted in implementing the afferent measurement technique in our lab, the data analysis and interpretation of the results. SF, JDM and BDW designed the study. All authors critically read and approved the final manuscript. SN is an aspirant of the Fund for Scientific Research (FWO), Flanders (11G7415N). This work was supported financially by the FWO (G028615N and G034113N).
sodium chloride (NaCl) | VWR Chemicals | 27,810,295 | compound Krebs solution |
potassium chloride (KCl) | Acros organics | 196770010 | compound Krebs solution |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | VWR Chemicals | 1,063,461,000 | compound Krebs solution |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1,063,291,000 | compound Krebs solution |
magnesium sulfate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | compound Krebs solution |
calcium chloride (CaCl2) | Merck | 23,811,000 | compound Krebs solution |
D-glucose | VWR Chemicals | 1011175P | compound Krebs solution |
Distilled water | compound Krebs solution | ||
PVC tubing | Scientific Laboratory Supplies | The intestinal segment should be mounted over PVC tubing | |
Silicone tubing | Scientific Laboratory Supplies | The rest of the tubing, ideally silicone-based – more easily dislodging of debris in the tubing | |
Silk thread | Pearsall Limited | 10B15S220 | Attachment of the segment over the PVC tubing |
Syringe driver | Harvard Apparatus | 55-2222 | Intraluminal infusion of Krebs |
Binocular – including 10x magnification in oculair | Zeiss STEMI 2000 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | 507214 | Heating of the organ chamber |
Custom made organ bath with Sylgard covered bottom | |||
Spike2 software | Recording and analysis of the data | ||
Insect pins, 500 pieces, stainless steel, diameter 0.2 mm | Austerlitz insect pins minutiens | Dissection of the afferent nerve | |
Tweezer Dumont #5 inox 11cm | World Precision Instrument | 500341 | Dissection of the afferent nerve |
Scissors, spring, 14 cm | World Precision Instrument | 15905 | Dissection of the afferent nerve |
DB digitimer | NL 108T2/10 | pressure transducer | |
Micromanipulator | Narishige | M-3333 | 3D manipulation of the suction electrode |
Micromanipulator | X-4 rotating block | 3D manipulation of the suction electrode | |
Micromanipulator | GJ-8 magnetic stand | 3D manipulation of the suction electrode | |
LightSource | Euromex Microscopes Holland EK-1 | Optimal visualization for the dissection of the afferent nerve | |
CED 1401 Recording Apparatus | Recording of afferent nerve activity | ||
Humbug 50/60Hz Noise Eliminator | Quest Scientific Instruments | Elimination of background noise | |
Infusion Pump | Gibson Minipuls 2 | Infusion of the organ chamber in which the segment is mounted | |
Microelectrode Holder Half Cells 1.5 mm | World Precision Instrument | MEH2SW | Suction electrode for isolation of the afferent fiber |
Borosilicate Glass Capillaries, 300 pc; 1.5/0.84 OD/ID | World Precision Instrument | 1B150-4 | Capillary for the isolation of the afferent nerve |