Protocol
1. bearbejdes PANI Synthesis
- Opløs anilin (1 ml, 11 mmol) fuldstændigt i 60 ml chloroform i en 250 ml rundbundet kolbe. Der omrøres ved 600 rpm i 5 min og afkøles til 0-5 ° C med is. Dette tager normalt 15-20 min (figur 2A).
- Tilføj natriumdodecylbenzensulfonat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) til anilinen opløsning i en rundbundet kolbe under omrøring ved 600 rpm.
- Opløs ammoniumpersulfat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) i 20 ml vand, og der tilsættes det hele dråbevis i løbet af 30 minutter for at undgå overophedning af reaktionen.
- Gennemføre reaktionen ved 0-5 ° C i 24 timer, og lad den nå stuetemperatur i yderligere 24 timer.
- Observere reaktionsblandingen indledningsvis slå mælkehvid efter 15 min, derefter mørkebrun efter 2 timer, og endelig til mørkegrøn efter 24 timer (figur 2B-F).
- Foretage PANI-NaDBS opløsning med en Buchner-tragt. Bland med 80 ml chloroform og 120 ml vand i såeparation tragt (fig 2G).
- Inkubér opløsningen i 24 timer ved stuetemperatur og indsamle de mørkegrønne PANI fra skilletragt, hvorefter uomsatte NaDBS og APS i den vandige supernatant.
2. PANI-sonde Blanding og UV-bestråling
- Fortynd PANI opløsning 10x med chloroform-vand (1: 3 v / v) og blandes 200 pi fortyndet PANI med 6,4 pmol probe DNA-oligonukleotider ved forsigtig vipning i 15 minutter i et mikrocentrifugerør.
- Bestråle PANI-DNA-opløsning med 1.200 μJ / cm2 UV i en tværbinder i 2 min. Det er afgørende, at UV-eksponering er begrænset til den angivne mængde. Forlænget eksponering for UV kompromitterer fluorescens ændring i PANI, sandsynligvis på grund af kovalent krydsbinding af PANI og DNA.
- Pellet komplekser ved centrifugering ved 17.000 x g i 6 min, og vaskes med phosphatpufret saltvand (PBS). Pellet igen, og re-suspendere i PBS.
3. Hybridization af PANI-sonde
- Tilsæt 8 pi 100 uM komplementær DNA-oligonukleotider eller målnukleinsyrer til 200 pi PANI-probekomplekser.
- Udføre hybridisering ved rocking opløsning blandingen i 15 minutter ved 40 ° C.
- Pelletere PANI komplekser ved centrifugering ved 17.000 x g i 6 min. Vask med PBS og re-suspendere i vand.
4. Emission Steady State Fluorescens Måling
- Tilføj PANI fra forskellige behandlinger i en 96 brønds mikroplade og måle emission fluorescens i 270-850 nm området ved excitation ved 250 nm. En top for PANI emission skal observeres omkring 500 nm.
5. Fluorescens mikroskopi Måling af hybridiseret Duplex
- Drop coat PANI på en borosilikatglas dækglas og tør ved 40 ° C i 48 timer.
- Tilføj sonde (8 pi 100 uM) på en tørret PANI film og bestråle det med UV-lys (1.200 μJ / cm2
- Vask PANI-probe film med PBS og tørres ved 40 ° C i 48 timer.
- Udføre hybridisering i 15 minutter ved tilsætning af målnucleinsyrer. Dette kunne være en biologisk prøve eller en kontrol mål-oligonukleotidet (8 pi 100 uM). Følg med en PBS vask.
- Få de fluorescerende billeder på 40X forstørrelse, med en 500 nm lang pass filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A indfanger reaktionen setup ved starten af polymeriseringsprocessen, dvs. før APS tilsætning. Micelledannelse er det indledende trin i reaktionsprocessen-PANI syntese forekommer ved den micellære interface. Figur 2B viser en mælkeagtig opløsning efter 5 min. 30 min efter APS tilsættes reaktionsblandingen bliver til en svagt brun farve. Figur 2C viser farveændringen forbundet med dannelsen af oligomerer. Figur 2D viser en mørk brun farve efter 4 timer, hvilket indikerer en høj koncentration af kortkædet PANI, i overensstemmelse med en meget langsom reaktion. Endelig efter 48 timer kan der observeres en mørkegrøn opløsning med høj molekylvægt PANI der er dispergeret i chloroform-vand (figur 2E). Figur 2F viser en godt dispergeret, homogen PANI opløsning i skilletragten uden faseseparation.
(figur 2) eller på overfladen af drop-coatede film (figur 3). Det basale fluorescens af PANI film er relativt lav (figur 3A). Probe DNA tilsættes i løbet af filmen, og fik lov til at tørre ved stuetemperatur. Når de forventede DNA-PANI komplekse former, kan der observeres en intens stigning i fluorescens (figur 3B). Electron tilstrømning fra det negativt ladede DNA forårsager højere elektrontæthed i PANI-molekyler, der forårsager fluorescens forøgelse. Efter hybridisering dissociation af proben-target dupleks, PANI fluorescens vender tilbage til basale intensitet (figur 3C). Dissociation er forårsaget af ændringer i DNA-rygraden ved hybridisering dette kompromis PANI-probe interaktion. Sensing nucleinsyrer med denne teknologi kan også udføres direkte i emulsion (figur 3D). En fordel ved at anvende emulsionen -baseret system er kompatibilitet med plade læser instrumenter. Dette tillader en meget præcis måling af PANI fluorescens, og undgår vanskeligheder som følge af uregelmæssigheder i film belægning. En PANI-baserede sensor i emulsion format er meget specifik. Indførelsen af et enkelt mismatch (mm) i målet oligo undlader at genskabe basale PANI fluorescens (figur 3D).
Figur 1. Fastgørelse af sonder medieret af UV eksponering øger PANI fluorescens. Hybridisering af målnucleinsyrer resultater i løsrivelse fra PANI, og reversion af polymeren til basale fluorescens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Iles / ftp_upload / 54.590 / 54590fig2.jpg "/>
Figur 2. Syntese af bearbejdelig PANI. (A) Start på polymerisationsreaktion. (B) Efter 5 minutter når tilsættes langsomt APS. (C) 30 min efter APS tilsætning. (D) Efter 1 time. (E) Efter 4 timer. (F) Grøn produktet efter 48 timers reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Anvendelse af PANI Fluorescens at detektere nucleinsyrehybridisering. (A) PANI film skabt gennem drop-belægning på borosilikatglas, efterfulgt af tørring i 48 timer ved 40 ° C. (B) PANI fluorescens efter probe immobilisering. (C)Efter hybridisering af mål-DNA med PANI-immobiliserede prober. (D) Fluorescens ved 500 nm af PANI emulsion før og efter hybridisering med enten komplementære eller single mismatch (mm) mål oligonukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En PANI-baserede sensor af nukleinsyrer kræver solubilisering af polymeren i vandet for at interagere med DNA og RNA. Dispersionen af PANI i vand gennemføres ved anvendelse overfladeaktive og danner miceller som tidligere rapporteret 8. Ud over de NaDBS her anvendte andre anioniske overfladeaktive midler såsom dodecyl ester af 4-sulfophthalsyre, kan ikke-ioniske overfladeaktive såsom nonylphenolethoxylat eller kationiske overfladeaktive såsom cetyltrimethylammoniumbromid også anvendes til syntese af bearbejdelig PANI 9,10. Den her beskrevne syntese begynder med en fast andel af de anioniske overfladeaktive NaDBS tilsat til monomeropløsningen anilin ved et 2: 1 molforhold. Det overfladeaktive NaDBS har en høj hydrofil-lipofil balance (HLB), der tillader polymerisation af anilinmonomeren emulgeret i chloroform-vand ved at etablere ligevægt mellem den micellære polymere oliedråber og vand. Oxidant APS tilsættes derefter ved en 1: 1,5 molforhold at generere miceller af GRgrund PANI, hvor den indre kerne virker som et kimdannelsesmiddel. Dette fører til hoved til hale fastgørelse af monomerer, samtidig holder PANI i dynamisk ligevægt med den omgivende solvens 11,12. Reaktionen forløber på en kontrolleret måde, indtil højmolekylære polymerer dannes 13. Denne protokol vil generere partikler, der spænder fra 50 nm til 1500 nm 3. Væsentlig for etableringen en reaktion, hvor PANI vokser langsomt men forbliver opløselig er langsom tilsætning af oxidanten APS, lav temperatur, og fraværet af stærke protonsyrer. Nogle optimering af reaktant proportioner kan være nødvendigt at generere godt spredt PANI. PANI syntetiseret ved denne metode er stabil i mere end et år som en emulsion. Overdreven fortynding bør undgås, da HLB balance af dispersionen blive afbrudt, hvilket PANI at udfældes. Højhastighedsblanding kan bidrage til at holde PANI i opløsning. Perfekt opløselighed er ikke ønskeligt, da det ville udelukke pellet formatipå, hvilket er et vigtigt kriterium for hybridiseringsprocedurer i en emulsion baseret sensor.
Efter at generere dispergeret PANI, er DNA-sonder oligoer bundet til polymermatrixen via elektrostatisk interaktion. Interaktion af PANI imingrupper og phosphater af rygraden i DNA forekomme spontant. Ikke-specifikke PANI-nukleinsyre interaktioner komplicere analyt sensing i komplekse biologiske prøver 14. For at opnå forbindelse mellem PANI og probe DNA, som kan skelnes fra spontane interaktioner komplekset bestråles med UV. Oprettelsen af polære dele induceret af ladningslokalisering UV-udløst forøger befugteligheden af polymeroverfladen 15. Optimal eksponering er ca 2 min, og kan bekræftes, hvis PANI fluorescens ved 500 nm er forhøjet ca. 5X (figur 3). Overeksponering af komplekset for UV kan føre til tværbinding mellem PANI og DNA, som i modsætning til elektrostatiske interaktioner, does ikke forårsage en højde af PANI fluorescens.
Processen med at generere sensorer er let og hurtig. Polymerisationsreaktionen er afsluttet efter 48 timer efterfulgt af 24 timer at adskille fra uomsat oxidant og NaDBS. Synthesis vil skulle foretages sjældent som mængden af bestanden PANI produceret af protokollen i denne artikel er meget stor i forhold til det beløb, der anvendes i en sensor. PANI emulsion ved høje koncentrationer er stabil; dog kan enhver fortynding, der opstår under probe fastgørelse føre til udfældning af PANI, kompromittere sensor performance. Den umiddelbare brug af PANI-probekomplekser at opdage mål vil undgå dette problem. Sammen kan skabelse af komplekser og hybridisering gøres på under en time. PANI-probe film er mere stabile og kan anvendes efter langtidsopbevaring. En begrænsning ved denne sensor teknologi er, at det ikke er meget modtagelig for multipleksing. Hver detektering hændelse skal udføres i et separat rør. filmene kangive et bedre format til multiplexing som forskellige prober kunne spottet på forskellige regioner i en film. En prøve kunne anvendes over stedet array, og fluorescensen ved hver plet anvendes til at evaluere ekspression af et andet gen.
Påvisningen her beskrevne tilvejebringer adskillige fordele i forhold til andre systemer. Rapporter om påvisning af nukleinsyrer gennem en dissociation mekanisme, der involverer PANI stole på fluoroforer knyttet til probe DNA oligoer 5. Andre strategier bruger kovalent binding af sonder, som ikke skelne enkelt basis-pair forskelle i målnucleinsyrer 16-17. Udeladelsen af mærkning eller andre sekundære former for detektion i denne teknologi skaber muligheder for at bruge andre egenskaber af elektro-aktiv PANI. Sensoren respons således kunne udvides til måling af elektrokemiske egenskaber ændret ved fastgørelsespunkterne-detachement dynamik sensoren. Labs, der indfører denne teknik vil finde sEnsor systemet at være omkostningseffektive foruden hurtig og enkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
