Protocol
1. process PANI Synthesis
- Oppløs anilin (1 ml, 11 mmol) helt i 60 ml kloroform i en 250 ml rundbunnet kolbe. Omrør ved 600 rpm i 5 minutter og avkjøl til 0-5 ° C med is. Dette tar vanligvis 15-20 min (figur 2A).
- Legg natriumdodecylbenzensulfonat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) til anilinet oppløsning i en rundkolbe under omrøring ved 600 rpm.
- Løs opp ammoniumpersulfat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) i 20 ml vann og tilsett alt det dråpevis over 30 min for å unngå overoppheting reaksjonen.
- Utføre reaksjonen ved 0-5 ° C i 24 timer, og la det nå romtemperatur i ytterligere 24 timer.
- Observer at reaksjonsblandingen opprinnelig slår melkeaktig hvit etter 15 min, deretter mørk brun etter 2 timer, og til slutt til mørk grønn etter 24 timer (figur 2B-F).
- Filtrer PANI-NaDBS løsning med en Buchner trakt. Bland med 80 ml kloroform og 120 ml vann i såeparation trakt (figur 2G).
- Inkuber løsningen i 24 timer ved værelsestemperatur og samle den mørke grønne PANI fra skilletrakten, og etterlater uomsatte NaDBS og APS i den vandige supernatanten.
2. PANI-probe Blanding og UV-bestråling
- Fortynn PANI løsning 10x med kloroform-vann (1: 3 v / v) og blande 200 ul av fortynnet PANI med 6,4 pmol av probe-DNA-oligonukleotider ved forsiktig risting i 15 min i en mikrofuge-rør.
- Bestråle PANI-DNA-oppløsning med 1200 μJ / cm 2 av UV i en tverrbinder i 2 min. Det er viktig at UV-eksponering er begrenset til det angitte beløpet. Forlenget eksponering for UV-fluorescens, kompromitterer endringen i PANI, sannsynligvis på grunn av kovalent tverrbinding av PANI og DNA.
- Pellet kompleksene ved sentrifugering ved 17 000 x g i 6 minutter, og vaskes med fosfatbufret saltvann (PBS). Pellets igjen, og re-suspendere i PBS.
3. Hybridization av PANI-sonde
- Legg 8 ul av 100 uM komplementære DNA-oligonukleotider eller målnukleinsyrer til 200 ul av PANI-probe-komplekser.
- Utføre hybridisering av gynge løsning blanding i 15 min ved 40 ° C.
- Pellet PANI komplekser ved sentrifugering ved 17 000 xg i 6 min. Vask med PBS og re-suspendere i vann.
4. Utslipp Steady State Fluorescence Måling
- Legg PANI fra forskjellige behandlinger inn i en 96-brønners mikroplate og måle fluorescens emisjon i det 270-850 nm etter eksitasjon ved 250 nm. En emisjonstopp for PANI bør observeres rundt 500 nm.
5. Fluorescensmikroskopi Måling av hybridisert Duplex
- Drop coat PANI på en borsilikatglass dekk og tørr ved 40 ° C i 48 timer.
- Legg til en sonde (8 ul av 100 pM) på en tørket film PANI og bestråle det med UV-lys (1200 μJ / cm2
- Vask PANI-film sonde med PBS og tørk ved 40 ° C i 48 timer.
- Utfør hybridisering i 15 min ved å legge målnukleinsyrer. Dette kan være en biologisk prøve eller en kontroll mål oligonukleotid (8 ul av 100 pM). Følg med PBS vask.
- Skaff fluorescerende bildene på 40X forstørrelse, med en 500 nm lang pass filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A fanger reaksjonen oppsettet ved begynnelsen av polymerisasjonsprosessen, dvs. før tilsetning APS. Micelle-dannelsen er det første trinnet i reaksjonsprosess-PANI syntese skjer på micellar-grensesnittet. Figur 2B viser en melkeaktig oppløsning etter 5 min. 30 minutter etter APS tilsettes reaksjonsblandingen går over til en svakt brun farge. Figur 2C viser den fargeendring i forbindelse med dannelsen av oligomerer. Figur 2D viser en mørk brun farge etter 4 timer, noe som indikerer en høy konsentrasjon av kortkjedet PANI, i samsvar med en meget langsom reaksjon. Til slutt, etter 48 timer kan observeres en mørkegrønn oppløsning med høy molekylvekt PANI som er dispergert i kloroform-vann (figur 2E). Figur 2F viser en godt dispergert, homogen PANI løsning i skilletrakten med ingen faseseparasjon.
(figur 2) eller på overflaten av slipp-belagt film (figur 3). Basal fluorescens av PANI-filmer er relativt lav (figur 3A). Probe-DNA ble tilsatt i løpet av filmen, og fikk tørke ved romtemperatur. Når de forventede DNA-PANI komplekse former, kan en intens økning i fluorescens bli observert (Figur 3B). Elektroninnstrømning fra den negativt ladet DNA fører til høyere elektrontetthet i PANI-molekyler, slik at fluorescensen øker. Etter hybridisering indusert dissosiasjon av probe-mål-dupleks, returnerer PANI fluorescens til basal intensitet (figur 3C). Dissosiasjon er forårsaket av forandringer i DNA-ryggraden ved hybridisering som kompromiss PANI-probe interaksjon. Sensing nukleinsyrer med denne teknologien kan også utføres direkte i emulsjonen (figur 3D). En fordel med å bruke emulsjonen -basert system er kompatibelt med plate leser instrumenter. Dette muliggjør en svært presis måling av PANI fluorescens, og unngår problemer forårsaket av uregelmessigheter i film belegg. En PANI-baserte sensor i emulsjon format er meget spesifikk. Innføringen av en enkelt mismatch (mm) i målet oligo ikke klarer å gjenopprette basal PANI fluorescens (Figur 3D).
Figur 1. Vedlegg sonder mediert av UV eksponering øker PANI fluorescens. Hybridisering av målnukleinsyrer resultater i distansering fra Pani, og hjemfall av polymer til basal fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Figur 2. Syntese av prosesser PANI. (A) start av polymerisasjonsreaksjonen. (B) Etter 5 minutter når APS tilsettes langsomt. (C) 30 minutter etter tilsetning APS. (D) Etter en time. (E) Etter 4 timer. (F) Grønn produktet etter 48 timers reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Anvendelse av PANI Fluorescens å påvise nukleinsyre hybridisering. (A) PANI film skapt gjennom rulle belegg på borsilikatglass, etterfulgt av tørking i 48 timer ved 40 ° C. (B) PANI fluorescens etter probe immobilisering. (C)Etter hybridisering av target DNA med PANI-immobiliserte prober. (D) Fluorescens ved 500 nm av PANI emulsjon før og etter hybridisering med komplementære eller enkel mismatch (mm) mål oligonukleotider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En PANI-baserte sensor av nukleinsyrer krever oppløseliggjøring av polymeren i vann, for å samvirke med DNA og RNA. Dispersjonen av PANI i vann oppnås ved hjelp av overflateaktive midler som danner miceller som tidligere rapportert 8. I tillegg til de NaDBS er brukt her på andre anioniske overflateaktive midler som dodecyl-ester av 4-sulfophthalic syre, kan ikke-ioniske overflateaktive midler som nonylfenoletoksylat, eller kationiske overflateaktive midler som cetyltrimetyl-ammonium bromid også brukes til syntese av prosesser PANI 9,10. Syntesen som er beskrevet her begynner med en fast andel av de anioniske overflateaktive NaDBS tilsettes til monomeren anilin ved et 2: 1 molart forhold. Det overflateaktive middel NaDBS har en høy hydrofil-lipofil balanse (HLB) som tillater polymerisering av anilin monomer emulgert i kloroform-vann ved å etablere likevekt mellom de micellære polymere oljedråper og vann. Oksydasjonsmidlet APS ble deretter tilsatt ved et 1: 1,5 molforhold å generere miceller av grpå grunn av PANI, hvor den indre kjernen virker som et kjernedannende middel. Dette fører til hodet til hale feste av monomerer, samtidig holde PANI i dynamisk likevekt med omgivelsene løsemiddel 11,12. Reaksjonen foregår på en kontrollert måte inntil høymolekylære polymerer blir dannet 13. Denne protokollen vil generere partikler som spenner fra 50 nm til 1500 nm 3. Kritisk for å etablere en reaksjon hvor PANI vokser langsomt, men forblir løselig er langsom tilsetning av den oksyderende APS, lav temperatur, og fravær av sterke protonsyrer. Noen optimaliseringen av reaktant-mengdeforhold kan det være nødvendig å generere godt dispergert PANI. PANI syntetiseres ved hjelp av denne fremgangsmåte er stabile i mer enn ett år som en emulsjon. Overdreven fortynning bør unngås, da den HLB-balansen i dispersjonen kan bli forstyrret, forårsaker PANI å felle ut. Høyhastighets blanding kan bidra til å holde PANI i løsningen. Perfekt løselighet er ikke ønskelig, da det vil være til hinder for pellets formingpå, noe som er et viktig kriterium for hybridiserings-prosedyrer i en emulsjonsbasert sensor.
Etter å generere dispergert PANI, blir DNA-probe-oligonukleotider bundet til polymermatriksen ved elektrostatisk interaksjon. Interaksjon av PANI imingrupper og fosfatene av ryggraden av DNA oppstå spontant. Uspesifiserte PANI-nukleinsyre interaksjoner komplisere analytt sensing i komplekse biologiske prøver 14. For å oppnå forbindelse mellom PANI og probe-DNA som kan skilles fra spontane vekselvirkninger, er de komplekse bestråles med UV. Opprettelsen av polare grupper indusert av UV-utløst charge lokalisering øker fuktbarheten av polymeroverflaten 15. Optimal eksponering er omtrent 2 min, og kan bekreftes hvis PANI fluorescens ved 500 nm er hevet omtrent 5X (figur 3). Overeksponering av komplekset til UV kan føre til kryssbinding mellom PANI og DNA, som i motsetning til elektrostatiske interaksjoner, does ikke føre til en heving av PANI fluorescens.
Prosessen med å generere sensorer er enkel og rask. Polymeriseringsreaksjonen er fullført etter 48 timer fulgt av 24 timer for å skille fra ikke omsatt oksydasjonsmiddel og NaDBS. Synthesis må utføres sjelden som mengden av lager PANI produsert av protokollen i denne artikkelen er meget stor i forhold til den mengde som benyttes i en sensor. PANI emulsjon ved høye konsentrasjoner er stabil; Imidlertid kan en hvilken som helst fortynning som oppstår i løpet av sonden feste føre til utfelling av PANI, noe som påvirker sensorytelse. Den umiddelbare bruk av PANI-probe-komplekser til å oppdage mål vil unngå dette problemet. Sammen kan opprettelse av komplekser og hybridiseringen gjøres på under en time. PANI-probe filmer er mer stabile og kan brukes etter langvarig lagring. En begrensning av denne sensorteknologi er at det ikke er svært mottagelig for multiplekses. Hver deteksjons arrangement må utføres i et separat rør. filmer kangi en bedre format for multipleksing som forskjellige prober kan bli oppdaget på forskjellige regioner av en film. En prøve kan påføres over flekk array, og fluorescensen ved hver flekk brukes til å vurdere ekspresjon av et annet gen.
Påvisningsmekanismen som er beskrevet her gir flere fordeler i forhold til andre systemer. Rapporter om påvise nukleinsyrer gjennom en dissosiasjon mekanisme som involverer PANI stole på fluoroforer knyttet til sondere DNA oligos 5. Andre strategier bruke kovalent binding av sonder, som ikke klarer å skille enkeltbase par forskjeller i målnukleinsyrer 16-17. Utelatelsen av merking eller andre sekundære former for deteksjon i denne teknologien skaper muligheter til å bruke andre egenskaper av elektro aktiv Pani. Sensoren responsen således kunne utvides til måling av elektrokjemiske egenskaper endres ved feste-løsgjøring dynamikken i sensoren. Labs som tar i bruk denne teknikken vil finne sEnsor system for å være kostnadseffektive i tillegg til rask og grei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
