Protocol
1. Обрабатываемая ПАНИ Синтез
- Растворите анилин (1 мл, 11 ммоль), полностью в 60 мл хлороформа в 250 мл круглодонную колбу,. Смесь перемешивают при 600 оборотах в минуту в течение 5 мин и охлаждают до температуры 0-5 ° С со льдом. Это обычно занимает 15-20 мин (рис 2A).
- Добавить додецил бензолсульфонат натрия (NaDBS) (7,44 г, 21 ммоль) к раствору анилина в круглодонную колбу при перемешивании при 600 оборотах в минуту.
- Растворите персульфата аммония (APS) (3,072 г, 13,5 ммоль) в 20 мл воды и добавить все это по каплям в течение 30 минут, чтобы избежать перегрева реакции.
- Проводят реакцию при температуре 0-5 ° С в течение 24 ч, и позволяют ему достичь комнатной температуры в течение еще 24 ч.
- Отметим , реакционную смесь сначала повернуть молокообразного через 15 мин, а затем темно - коричневого цвета после 2 часов, и , наконец , до темно - зеленого через 24 часа (рис 2B-F).
- Фильтр решение ПАНИ-NaDBS с воронке Бюхнера. Смешайте 80 мл хлороформа и 120 мл воды в качествеeparation воронка (рис 2G).
- Выдержите раствор в течение 24 ч при комнатной температуре и собирают темно-зеленую полианилина делительной воронке, в результате чего не вступившие в реакцию NaDBS и APS в водной супернатанта.
2. ПАНИ-зонд Смешение и УФ-облучения
- Развести нилина раствор 10х смесью хлороформ-вода (1: 3 об / об) и перемешивают 200 мкл разведенной полиани- 6,4 мкмоль олигонуклеотиды ДНК-зонд, путем осторожного качания в течение 15 мин в микроцентрифуге трубки.
- Облучать раствор ПАНИ-ДНК с 1200 мкДж / см 2 УФ в сшивателя в течение 2 мин. Очень важно, что УФ-облучение ограничивается указанным количеством. Длительное воздействие УФ компрометирует изменения флуоресценции в PANI, вероятно из-за ковалентной сшивки полианилина и ДНК.
- Гранул комплексы центрифугированием при 17000 х г в течение 6 мин и промывают фосфатным буферным солевым раствором (PBS). Гранул снова, и повторно приостанавливать в PBS.
3. Hybridization ПАНИ-зонда
- Добавить 8 мкл 100 мкМ олигонуклеотидов, комплементарных ДНК или нуклеиновых кислот-мишеней к 200 мкл полианили--зондовых комплексов.
- Выполните гибридизацию покачиванием смесь раствора в течение 15 мин при температуре 40 ° С.
- Гранул ПАНИ комплексы путем центрифугирования при 17000 мкг в течение 6 мин. Мытье с PBS и повторно приостанавливать в воде.
4. Излучение Устойчивая Измерение флуоресцентного состояния
- Добавить Пани из разных процедур в микропланшет 96 скважины и измерения флуоресценции излучения в диапазоне 270-850 нм при возбуждении при 250 нм. Пик излучения для ПАНИ должны наблюдаться около 500 нм.
5. флуоресцентной микроскопией Измерение гибридизовали Duplex
- Капельный слой полианилина на боросиликатное стекло покровное и высушивают при 40 ° C в течение 48 часов.
- Добавить зонд (8 мкл 100 мкМ) в сухом PANI пленке и облучать его с УФ - светом (1200 мкДж / см 2
- Промыть ПАНИ-Probe пленку с PBS и сушат при 40 ° C в течение 48 часов.
- Выполните гибридизацию в течение 15 мин путем добавления нуклеиновых кислот-мишеней. Это может быть биологический образец или мишень управления олигонуклеотид (8 мкл 100 мкМ). Следуйте с промывкой PBS.
- Получить флуоресцентные изображения при 40-кратном увеличении, с фильтром длиной пропускания 500 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фигура 2А захватывает установку реакции в начале процесса полимеризации, то есть до того APS. Образование мицелл является первым шагом в реакции синтеза происходит процесс-ПАНИ в мицеллярной интерфейсе. Рисунок 2B показывает молочного цвета раствора после 5 мин. 30 мин после того, как АПС добавляется реакция превращается в слегка коричневого цвета. На рис 2С показывает изменение цвета , связанное с образованием олигомеров. На рис 2D показывает , темно - коричневый цвет после 4 ч, что указывает на высокую концентрацию коротких цепей полианилина, в соответствии с очень медленная реакция. И, наконец , после 48 ч можно наблюдать темно - зеленый раствор высокомолекулярного ПАНИ молекулярной , который диспергируют в смеси хлороформ-вода (Рисунок 2E). На рисунке 2F показывает , хорошо диспергированной, гомогенный раствор полианилин в делительную воронку без разделения фаз.
(рисунок 2) , или на поверхности капель покрытых пленок (рисунок 3). Базальной флуоресценции пленок ПАНИ является относительно низким (рис 3А). ДНК-зонд добавляется над пленкой, и дают высохнуть при комнатной температуре. Когда ожидаемые ДНК-ПАНИ сложные формы, интенсивное увеличение флуоресценции можно наблюдать (рис 3B). Электронный приток из отрицательно заряженной ДНК приводит к более высокой плотности электронов в молекулах ПАНИ, вызывая увеличение флуоресценции. После гибридизации индуцированной диссоциации зонд-мишень дуплекса, ПАНИ флуоресценции возвращается к базальной интенсивности (рис 3C). Разобщение вызвано изменениями в основной цепи ДНК при гибридизации, что компромисс ПАНИ-зонд взаимодействия. Чувствительные нуклеиновых кислот с этой технологией также может быть выполнена непосредственно в эмульсии (рисунок 3D). Преимущество использования эмульсии основанное система совместимости с пластиной чтения инструментов. Это позволяет с высокой точностью измерения ПАНИ флуоресценции, а также позволяет избежать трудностей, вызванных нарушениями в пленочном покрытии. Датчик ПАНИ основе в формате эмульсии весьма специфичен. Введение единого рассогласования (мм) в целевом олиго не удается восстановить базальную нилина флуоресценции (рис 3D).
Рисунок 1. Вложение зондов , опосредованных с помощью УФ - облучения увеличивает нилина флуоресценции. Гибридизация мишеней нуклеиновых кислот приводит к отрыву от ПАНИ, и реверсия полимера к базальной флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Синтез обрабатываемую полианилина. (А) Начало реакции полимеризации. (В) Через 5 мин при АПС медленно добавляют. (С) 30 мин после того, как АПС дополнение. (D) После 1 часа. (Е) Через 4 часа. (F) Зеленый продукт после 48 ч реакции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Использование полианили- флюоресценции для обнаружения гибридизацию нуклеиновых кислот. (А) нилина фильм , созданный с помощью капельного покрытия на боросиликатного стекла с последующей сушкой в течение 48 ч при 40 ° С. (В) полианилина флуоресценции после того, как зонд иммобилизации. (С)После гибридизации ДНК-мишени с PANI-иммобилизованных зондов. (D) флуоресценция при 500 нм ПАНИ эмульсии до и после гибридизации с или дополняющими друг друга или одного рассогласования (мм) мишени олигонуклеотидами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Датчик нуклеиновых кислот на основе полианилина требует солюбилизации полимера в воде, с тем, чтобы взаимодействовать с ДНК и РНК. Дисперсия полианилина в воде осуществляется с использованием поверхностно -активных веществ, образующих мицеллы , как сообщалось ранее 8. В дополнение к NaDBS , используемые здесь , другие поверхностно -активные вещества , такие как анионные додецилсульфата эфира 4-сульфофталевой кислоты, поверхностно -активные вещества , такие как неионогенные нонилфенолэтоксилата этоксилата, или поверхностно -активные вещества , такие как катионные бромид cetyltrimethyl аммония также могут быть использованы для синтеза обрабатываемую полианилина 9,10. Синтез, описанный здесь начинается с фиксированной доли NaDBS анионных поверхностно-активных веществ, добавляемых в мономерной анилина при 2: мольном соотношении 1. В NaDBS поверхностно-активное вещество имеет высокий гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ), что позволяет полимеризацию анилинового мономера, эмульгированного в смеси хлороформ-вода путем установления равновесия между мицеллярных полимерных капель масла и воды. Окислитель АПС Затем добавляют при молярном соотношении 1: 1,5 для генерации мицеллы грвследствие полианилина, где внутреннее ядро выступает в качестве агента зародышеобразования. Это приводит к голова к хвосту присоединения мономеров, в то же время сохраняя Пани в динамическом равновесии с окружающим растворителем 11,12. Реакция протекает контролируемым образом до полимеров с высокой молекулярной массой образуются 13. Этот протокол будет генерировать частицы , которые варьируются от 50 нм до 1500 нм 3. Решающее значение для установления реакции, где полианилина растет медленно пока остается растворимым является медленным добавлением окислителя APS, низкой температуры, а также при отсутствии сильных протонные кислоты. Некоторые оптимизации пропорций реагентов могут быть необходимы для создания хорошо диспергированную полианилина. Полианилина синтезированный этим способом, является стабильным в течение более чем одного года, в виде эмульсии. Чрезмерное разведение следует избегать, так как ГЛБ баланс дисперсии может быть нарушена, в результате чего полианилина для осаждения. Высокая скорость перемешивания может помочь сохранить Пани в растворе. Идеальная растворимость не желательно, так как это исключает пеллетах Formatiна, что является важным критерием для процедур гибридизации в датчик эмульсионной основе.
После генерации рассредоточены полианилина, ДНК-зонд олигонуклеотиды прикрепляются к полимерной матрице с помощью электростатического взаимодействия. Взаимодействие ПАНИ иминных групп и фосфаты остова ДНК происходят спонтанно. Неспецифические ПАНИ-нуклеиновые взаимодействия кислоты усложняют аналита зондирования в сложных биологических образцах 14. Для того, чтобы достичь связи между полианилина и зондом ДНК, которую можно отличить от спонтанных взаимодействий, комплекс облучают УФ. Создание полярных фрагментов , индуцируемых локализации заряда УФ - инициируемым увеличивает смачиваемость поверхности полимера 15. Оптимальная экспозиция составляет приблизительно 2 мин, и могут быть подтверждены , если ПАНИ флуоресценции при 500 нм возводится примерно 5X (рисунок 3). Передержки комплекса ультрафиолетовым излучением может привести к сшивающего между ПАНИ и ДНК, которые в отличие от электростатических взаимодействий, ланиы не вызывает повышение ПАНИ флуоресценции.
Процесс создания датчиков легко и быстро. Реакцию полимеризации завершается через 48 часов, а затем 24 часов, чтобы отделить от непрореагировавшего окислителя и NaDBS. Синтез необходимо будет осуществляться нечасто, как количество акций полианилина, полученного в соответствии с протоколом в этой статье очень велико по сравнению с количеством используемого в датчике. Полианилина эмульсия при высоких концентрациях является стабильным; Однако, любое разведение, которое происходит во время прикрепления зонда может привести к выпадению ПАНИ, ставя под угрозу рабочие характеристики датчика. Непосредственное применение ПАНИ-зондов комплексов для обнаружения цели позволит избежать этой проблемы. Вместе, создание комплексов и гибридизации может быть сделано в течение часа. ПАНИ-Probe пленки более стабильны и могут быть использованы после длительного хранения. Ограничение этого датчика технологии является то, что он не обладает высокой поддаются мультиплексированию. Каждое событие обнаружения должно проводиться в отдельной пробирке. Пленки могутобеспечить лучший формат для мультиплексирования в качестве различных зондов могут быть замечены на различных областях пленки. Образец может быть нанесен на массив пятна, и флуоресценцию на каждом месте, используется для оценки экспрессии другого гена.
Механизм обнаружения, описанный здесь дает несколько преимуществ по сравнению с другими системами. Отчеты обнаружения нуклеиновых кислот посредством механизма диссоциации с участием пани полагаются на флуорофоров , прикрепленных к ДНК - зонда олигонуклеотиды 5. Другие стратегии используют ковалентное присоединение зондов, которые не в состоянии отличить одиночные различия пар оснований в нуклеиновых кислот - мишеней 16-17. Упущение маркировки или других второстепенных способов обнаружения в этой технологии создает возможности для использования других свойств электро-активных ПАНИ. Реакция датчика таким образом, может быть продлен до измерения электрохимических свойств измененными присоединением отрыва динамики датчика. Labs, которые принимают этот метод будет найти SСистема Энсор быть экономически эффективными в дополнение к быстрым и простым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
