Protocol
1. bearbetbar PANI Syntes
- Upplös anilin (1 ml, 11 mmol) helt i 60 ml kloroform i en 250 ml rundbottnad kolv. Rör om vid 600 rpm under 5 minuter och kyl till 0-5 ° C med is. Detta tar vanligtvis 15-20 minuter (Figur 2A).
- Lägg natriumdodecylbensensulfonat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) till anilinen lösning i en rundbottnad kolv under omröring vid 600 varv per minut.
- Lös ammoniumpersulfat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) i 20 ml vatten och tillsätt alltihop droppvis under 30 minuter för att undvika överhettning reaktionen.
- Utföra reaktionen vid 0-5 ° C under 24 h, och låt den anta rumstemperatur under ytterligare 24 timmar.
- Observera reaktionsblandningen vända initialt mjölkvit efter 15 minuter, då mörkbrun efter 2 timmar, och slutligen till mörkgrönt efter 24 timmar (Figur 2B-F).
- Filtrera det PANI-NaDBS lösning med en Buchner-tratt. Blanda med 80 ml kloroform och 120 ml vatten i såeparation tratt (figur 2G).
- Inkubera lösningen under 24 timmar vid rumstemperatur och samla den mörkgröna PANI från separationstratten, lämnar oreagerade NaDBS och APS i den vattenhaltiga supernatanten.
2. PANI-sond Blandning och UV-bestrålning
- Utspädd PANI lösning 10x med kloroform-vatten (1: 3 vol / vol) och blanda 200 pl av utspätt PANI med 6,4 | j, mol av sond DNA-oligonukleotider genom försiktig skakning under 15 minuter i ett mikrofugrör.
- Bestråla PANI-DNA-lösningen med 1200 μJ / cm 2 av UV i ett tvärbindningsmedel under 2 min. Det är kritiskt att UV-exponering är begränsad till den angivna mängden. Lång exponering för UV äventyrar fluorescensförändring i PANI, sannolikt på grund av kovalent tvärbindning av PANI och DNA.
- Pellets komplexen genom centrifugering vid 17.000 xg under 6 min, och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Pellet igen och återsuspendera i PBS.
3. Hybridization av PANI-sond
- Tillsätt 8 pl 100 pM kompletterande DNA-oligonukleotider eller målnukleinsyror till 200 pl PANI-sondkomplex.
- Utföra hybridisering genom att gunga lösningsblandningen under 15 min vid 40 ° C.
- Pellets pani komplex genom centrifugering vid 17.000 xg under 6 min. Tvätta med PBS och återsuspendera i vatten.
4. Emission Steady State fluorescensmätning
- Lägg PANI från olika behandlingar i en 96 brunnar mikro och mäta fluorescensemissionen i 270-850 nm genom excitation vid 250 nm. En emissionstopp för PANI bör observeras runt 500 nm.
5. fluorescensmikroskopi Mätning av hybridiserade Duplex
- Släppa coat PANI på en borsilikat glas täckglas och torka vid 40 ° C under 48 h.
- Lägg till sond (8 pl 100 M) på en torkad PANI film och bestråla den med UV-ljus (1200 μJ / cm2
- Tvätta PANI-sonden film med PBS och torka vid 40 ° C under 48 h.
- Utföra hybridisering under 15 minuter genom att tillsätta målnukleinsyror. Detta kan vara ett biologiskt prov eller en kontroll måloligonukleotid (8 | il av 100 | iM). Följa med en PBS-tvätt.
- Skaffa fluorescerande bilder på 40X förstoring, med en 500 nm långpassfilter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A fångar reaktionsinställnings vid början av polymerisationsprocessen, dvs innan APS tillsats. Micellbildning är det första steget i reaktionsprocessen-PANI-syntes sker vid den micellära gränssnitt. Figur 2B visar en mjölkaktig lösning efter 5 min. 30 min efter APS tillsättes reaktions vänder sig till en svagt brun färg. Figur 2C visar färgförändringen i samband med bildandet av oligomerer. Figur 2D visar en mörkbrun färg efter 4 h, vilket indikerar en hög koncentration av kortkedjig PANI, i överensstämmelse med en mycket långsam reaktion. Slutligen efter 48 timmar kan observeras en mörkgrön lösning med hög molekylvikt PANI som sprids i kloroform-vatten (Figur 2E). Figur 2F visar en väl spridd, homogen PANI lösning i separertratten utan fasseparation.
(Figur 2) eller på ytan av drop-belagda filmer (Figur 3). Den basala fluorescens pani filmer är relativt låg (Figur 3A). Sond-DNA tillsätts över filmen, och fick torka vid rumstemperatur. När de förväntade DNA-PANI komplexa former, kan observeras (Figur 3B) en intensiv ökning av fluorescens. Elektron tillströmning från den negativt laddade DNA orsakar högre elektrondensitet i pani molekyler, vilket gör att fluorescensökning. Efter hybridisering dissociation av probe-mål duplex, återgår PANI fluorescens till basala intensitet (figur 3C). Dissociation orsakas av förändringar i DNA-ryggraden vid hybridisering att kompromiss PANI-probe interaktion. Sensing nukleinsyror med denna teknik kan även utföras direkt i emulsionen (Figur 3D). En fördel med att använda emulsionen baserade systemet är kompatibilitet med plattläsaren instrument. Detta möjliggör en mycket exakt mätning av PANI fluorescens, och undviker svårigheter till följd av oegentligheter i filmbeläggningen. En PANI-baserad sensor i emulsions format är mycket specifika. Införandet av en enda felpassning (mm) i målet oligo inte återställa basala PANI fluorescens (Figur 3D).
Figur 1. Montering av prober som medieras av UV-exponering ökar PANI fluorescens. Hybridisering av målnukleinsyror resulterar i lösgörande från PANI, och återgång av polymeren till basal fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
iles / ftp_upload / 54590 / 54590fig2.jpg "/>
Figur 2. Syntes av behandlingsbara PANI. (A) Start av polymerisationsreaktionen. (B) Efter 5 min när APS tillsättes långsamt. (C) 30 min efter tillsats APS. (D) Efter en timme. (E) Efter 4 timmar. (F) Grön produkt efter 48 h av reaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Användning av PANI Fluorescens att detektera nukleinsyrahybridisering. (A) PANI filmen skapas genom drop-beläggning på borosilikatglas, följt av torkning under 48 h vid 40 ° C. (B) PANI fluorescens efter sond immobilisering. (C)Efter hybridisering av mål-DNA med PANI-immobiliserade prober. (D) fluorescens vid 500 nm av PANI emulsionen före och efter hybridisering med antingen kompletterande eller enda felpassning (mm) mål oligonukleotider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En PANI-baserad sensor av nukleinsyror kräver solubilisering av polymeren i vatten för att interagera med DNA och RNA. Spridningen av PANI i vatten åstadkoms med hjälp av tensider, bilda miceller som tidigare rapporterats 8. Förutom de NaDBS som används här andra anjoniska ytaktiva ämnen såsom dodecyl ester av 4-sulfoftalsyra, kunde nonjoniska tensider såsom nonylfenoletoxylat, eller katjoniska ytaktiva medel såsom cetyltrimetylammoniumbromid även användas för syntes av bearbetningsbar PANI 9,10. Syntesen beskrivs här börjar med en fast andel av de anjoniska ytaktiva NaDBS tillsatta till monomeren anilin vid ett 2: 1 molförhållande. De ytaktiva NaDBS har en hög hydrofil-lipofil balans (HLB) som möjliggör polymerisation av anilinmonomer emulgerad i kloroform-vatten genom att upprätta jämvikt mellan de micellära polymera oljedroppar och vatten. Oxidationsmedlet APS tillsättes därefter med en 1: 1,5 molförhållande för att generera miceller av grgrund PANI, där den inre kärnan fungerar som ett kärnbildningsmedel. Detta leder till huvudet till svans fastsättning av monomerer, samtidigt hålla PANI i dynamisk jämvikt med den omgivande lösningsmedel 11,12. Reaktionen fortskrider på ett kontrollerat sätt tills högmolekylära polymerer är bildade 13. Detta protokoll kommer att generera partiklar som sträcker sig från 50 nm till 1500 nm 3. Kritiskt för upprättande av en reaktion där PANI växer långsamt ännu förblir löslig är den långsamma tillsatsen av oxidationsmedlet APS, låg temperatur, och frånvaron av starka protonsyror. Viss optimering av reagerande proportioner kan vara nödvändigt att ta fram väl spridda PANI. PANI syntetiseras genom denna metod är stabil under mer än ett år som en emulsion. Överdriven utspädning bör undvikas eftersom HLB balans av dispersionen kan störas, vilket PANI att fälla. Höghastighetsblandning kan bidra till att hålla PANI i lösning. Perfekt löslighet är inte önskvärt, eftersom det skulle utesluta pellets formatividare, vilket är ett viktigt kriterium för hybridiseringsförfaranden i en emulsionsbaserad sensor.
Efter att ha genererat spridda PANI är DNA-prob oligos bunden till polymermatrisen genom elektrostatisk växelverkan. Interaktion mellan pani imingrupper och fosfater av ryggraden i DNA ske spontant. Icke-specifika pani-nukleinsyra interaktioner komplicera analyt avkänning i komplexa biologiska prover 14. Att uppnå associering mellan PANI och sond-DNA som kan särskiljas från spontana interaktioner, är komplexet bestrålades med UV. Skapandet av polära delar som induceras av UV-utlöst laddningslokalisering ökar vätbarheten av polymerytan 15. Optimal exponering är ca 2 min, och kan bekräftas om PANI fluorescens vid 500 nm är förhöjd ungefär 5X (Figur 3). Överexponering av komplexet för UV kan leda till tvärbindning mellan PANI och DNA, som till skillnad från elektrostatiska interaktioner, does inte orsaka en förhöjning av PANI fluorescens.
Processen att skapa sensorer är enkel och snabb. Polymerisationsreaktionen är fullbordad efter 48 timmar, följt av 24 timmar att separera från oreagerad oxidant och NaDBS. Syntes måste utföras sällan som den mängd lager PANI produceras av protokollet i den här artikeln är mycket stor i förhållande till den mängd som används i en sensor. PANI emulsion vid höga koncentrationer är stabil; dock kan eventuell utspädning som uppstår under sond fastsättning leda till utfällning av PANI, kompromissa sensorprestanda. Omedelbar användning av PANI-sondkomplex för att upptäcka mål kommer att undvika det här problemet. Tillsammans kan skapa komplex och hybridisering ske på mindre än en timme. PANI-sond filmer är mer stabila och kan användas efter långtidslagring. En begränsning hos denna sensor teknik är att det inte är mycket mottaglig för multiplexering. Varje händelse detektering måste utföras i ett separat rör. filmer kange en bättre format för multiplexering som olika prober kunde fläckvis på olika regioner av en film. Ett prov kunde appliceras över fläcken array, och fluorescensen vid varje fläck används för att utvärdera uttrycket av en annan gen.
Mekanismen detektering beskrivs här erbjuder flera fördelar jämfört med andra system. Rapporter om att upptäcka nukleinsyror genom en dissociation mekanism som involverar PANI lita på fluoroforer bundna att sondera DNA-oligos 5. Andra strategier använder kovalent bindning av prober, som inte särskilja enstaka basparsskillnader målnukleinsyror 16-17. Utelämnandet av märkning eller andra sekundära lägen för detektion i denna teknik skapar möjligheter att använda andra egenskaper hos elektroaktiva PANI. Sensorn svaret alltså skulle kunna utvidgas till mätning av elektrokemiska egenskaper ändras genom fäst-lösgörande dynamiken i sensorn. Labs som antar denna teknik hittar sEnsor systemet vara kostnadseffektiva förutom snabb och okomplicerad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aniline | Fisher Scientific | A7401-500 | ACS, liquid, refrigerated |
| Ammonium peroxydisulfate | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, crystalline |
| Sodium dodecylbenzene sulfonate | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solid |
| Chloroform | Fisher Scientific | MCX 10601 | Liquid |
| DNA primers | MWG operon | n/a | custom DNA sequence ~20 bps |
| Microplate | USA Scientific | 1402-9800 | 96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform |
| Microplate Adhesive Film | USA Scientific | 2920-0000 | Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI coated on UV irradiated cover glass |
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 | Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min |
| Hybridization Oven | VWR | 01014705 T | Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min |
| Glass Apparatus | Fisher Scientific | Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel | |
| Microscope | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6 |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 |
References
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
- Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
- Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498 (2013).
- Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
- Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
- Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569 (2011).
- Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
- John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
- El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
- Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
- Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
- Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
- Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
- Kadashchuk, A., et al.
- Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
- Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).
