Protocol
全てのマウスを交配させ、特定の病原体を含まない条件下で維持し、すべてのマウスプロトコルは、施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われています。
緩衝液および試薬の調製
- 、55μM2-メルカプトエタノールを完全ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地（10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、ペニシリン（100 IU / ml）を/ストレプトマイシン（100μg/ ml）を準備します）。
- これとは別に、20倍の平衡塩類溶液（BSS）ストック1およびストック2を準備します。
- 20倍BSSストック1（1 Lの滅菌水で111 mMのブドウ糖、8.8 mMリン酸カリウム、26.7 mMのリン酸ナトリウム二塩基性）を準備し、最終容量調整前の20倍BSSストック1に40ミリリットルの0.5％フェノールレッドを追加します。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
- 20X BSSストック2（25.8 mMの塩化カルシウム二水和物、107 mMの塩化カリウム、2.73 MナトリウムCHを準備loride、19.6 mMの塩化マグネシウム六水和物、1 Lの滅菌水で16.6 mMの硫酸マグネシウム）。 4℃で保存する前に、0.2μmのフィルターを用いて滅菌濾過します。
- 400ミリリットル滅菌水それぞれに、別々に、50ミリリットルBSSストック1と50ミリリットルBSSストック2を希釈し、実験的な使用のために1X BSSを準備します。 、両方の希釈液を組み合わせてpHを7に調整し、20ミリリットルのFBS（2％）を追加します。 0.2μmのフィルターを用いて滅菌水と滅菌フィルターを使用して1 Lまでトップ。
注：濃厚BSSストックの混合が直接析出につながる可能性があるため、BSSストック溶液を別途準備する必要があります。
- 赤血球（RBC）溶解バッファー
- RBC溶解緩衝液を調製するために、使用前に1部株式トリス塩基（滅菌水中の130mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pHは7.65）に9部ストック塩化アンモニウム（滅菌水中の155 mMの塩化アンモニウム）を混合します。
注：4℃で塩化アンモニウムおよびトリスベースのストア滅菌ストック溶液。溶解bを準備しますRBCの効率的な溶解を確実にするために、新鮮なuffer。
- RBC溶解緩衝液を調製するために、使用前に1部株式トリス塩基（滅菌水中の130mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、pHは7.65）に9部ストック塩化アンモニウム（滅菌水中の155 mMの塩化アンモニウム）を混合します。
脾臓またはリンパ節からリンパ球懸濁液の2世代
注：マウスの安楽死の前に、実験に必要な全ての試薬および装置を準備して、高い細胞生存率を維持するために、できるだけ早くリンパ球の単一細胞懸濁液を生成することが重要です。
- 頸椎脱臼またはCO 2窒息により実験マウスを安楽死させます。
注：これ以降のステップで、すべての実験手順は、無菌的に行うべきです。 - 任意の切開を行う前に、70％エタノールにマウス全体を浸し。無菌的に8脾臓およびリンパ節を削除し、（ステップ1.2.3から）5ミリリットルの氷冷RPMI / FBS（2％FBSを含むRPMI）やBSS / FBSを含む別の15ミリリットルチューブに配置します。
注：BSSは、効率的なRBC溶解を防止するため、脾細胞懸濁液を調製するためのRPMIを使用しAFTE BSSに切り替えますRBC溶解をrは。 - 2ミリリットルの氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSを含むペトリ皿に無菌100μmのセルストレーナーメッシュの2枚の間に臓器（複数可）を置き、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液を生成するには。それは非常に細かい部分に引き裂かれるまで1mlシリンジのプランジャーを用いて、器官（複数可）をマッシュ。
- 15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、セルストレーナーを氷冷RPMI / FBSまたはBSS / FBSでメッシュ洗います。 、残りの細胞懸濁液を収集し、同じ15 mlチューブに追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。上清を取り除きます。
注：後続のステップでRBC溶解緩衝液または培地を添加する前に、指でチューブをフリックすることによりペレット化した細胞を再懸濁します。 - 細胞懸濁液の遠心分離中に室温（RT）RBC溶解バッファーを準備し（ステップ1.3を参照してください。）。細胞をペレット化し、上清を除去した後、すべての10 8個の細胞1mlのRBC溶解緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。 IncuBATE 3-4分間室温で溶解反応。
- 14ミリリットルの氷冷BSS / FBSを停止RBC溶解し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。
B及びT細胞の3精製
- B細胞の精製
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。 300μlのBSS / FBSで最大10 8脾臓細胞を再懸濁し、50μlの抗CD43に磁性マイクロビーズ9,10を追加します。 、死んだ細胞を除去30μlのアネキシンV磁気ビーズを追加します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
- T細胞の精製
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。再懸濁し、標的細胞集団に応じて非T細胞枯渇抗体カクテルで10 8細胞CD19、B220、GR-1、TCR-γδ、CD49b、CD11cの、のCD11b、TER119およびCD4またはCD8に対する（ビオチン化抗体まで/ FBS 4,5200μlのBSSに200：）精製され、1に希釈しました。中の細胞懸濁液をインキュベート15分間、4℃の冷蔵庫。
- インキュベーション後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする10ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、30μlのストレプトアビジンマイクロビーズおよび15μlのアネキシンV磁気ビーズを165μlのBSS / FBS中で細胞を再懸濁します。 30分間、4℃の冷蔵庫中の細胞懸濁液をインキュベートします。
注：、あっても磁性マイクロビーズで標識することを確認し、15分間マイクロビーズを用いて細胞をインキュベートし、その後、15ミリリットルチューブをタッピングにより穏やかに細胞懸濁液を混合し、ステップ3.1.1の間に、別の15分間インキュベートします。または3.2.2。
- 細胞精製のための分離カラムの調製
- 細胞のマイクロビーズ標識の中に未使用の分離カラムを準備する（ステップ3.1.1。または3.2.2。）。 RTへ（FBSなし）プリ暖かいBSSと無菌的にカラムを洗浄し、平衡化するために2ミリリットルを使用しています。 BSSで平衡化した後、洗浄し、カラムを乾燥させてはなりません。
注：私たちはLS cを使用しますolumn代わりに推奨されるLDの列の、その再利用性に（ステップ3.4を参照してください。）。 - 磁気ビーズで標識した後、細胞を洗浄し、4℃で5分間、453×gでスピンダウンする14ミリリットルBSS / FBSを追加します。上清を除去し、1-3で細胞ミリリットルRT BSSを再サスペンド。
- 精製のプロセスの間に流量を減らすために、カラムの先端に滅菌21 Gの針を取り付けます。平衡化したカラムに細胞懸濁液をロードし、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。
注：ロード中にカラムに気泡を導入することは避けてください。 - 1ミリリットルBSS / FBSで一回カラムを洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。再び通る流れでカラムをリロードします。同じ15ミリリットルチューブ内の第二の負荷後のフロースルーを収集します。
- 1ミリリットルBSS / FBSでカラムを3回洗浄し、精製された標的細胞を含有するフロースルーを集めます。その後、目に5ミリリットルBSS / FBSを追加電子カラムと、プランジャーと、新しい15ミリリットルチューブにカラムから磁気標識された細胞を洗い流します。
- 精製されたBまたはT細胞4,5の表面抗原に結合する抗体を用いたフローサイトメトリーによって収集された細胞の純度を確認してください。
- 細胞のマイクロビーズ標識の中に未使用の分離カラムを準備する（ステップ3.1.1。または3.2.2。）。 RTへ（FBSなし）プリ暖かいBSSと無菌的にカラムを洗浄し、平衡化するために2ミリリットルを使用しています。 BSSで平衡化した後、洗浄し、カラムを乾燥させてはなりません。
- 分離カラムを使用して再
注：LSカラムは、浄化効率に影響を与えることなく、4回まで再利用することができます。- プランジャーを使用して上から水を5mlの蒸留で5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回カラムを3回洗浄します。
- 5ミリリットル70％エタノールでカラムを洗浄し、カラムに錆の蓄積を防ぐために空気タップを使用して広範囲にカラムを乾燥。
- 個別の精製実験のために使用されるLSカラムを準備するには、シリンジアダプタを使用して、5ミリリットル、70％エタノールで下から上カラムを洗浄。次に、5ミリリットル一度列の先頭からPBSに続いて5ミリリットル滅菌PBSで2回ボトムアップからカラムを洗浄。 2を追加します。ミリリットルRT BSSは、カラムを平衡化した後、標識された細胞でカラムをロードするに進みます。
4. CFSE標識および刺激
注：精製細胞は、in vitroでの様々なおよびインビボ機能アッセイにかけることができます。ここでは、APCは5のT細胞刺激能を決定するために、精製されたT細胞を使用します。
- 37°Cの前CFSEをロードする前暖かい標識溶液（PBS中0.1％FBS）。
注：PBS中のFBSの低い割合を使用すると、CFSEのロード中に細胞死を減少させ、遠心分離中の細胞損失を最小限に抑えることができます。しかし、あまりにも多くのFBSはCFSEのロードを妨げる可能性があります。 - 標識溶液で2回精製した細胞を洗浄し、15mlチューブ中の予め温めた標識溶液中で2×10 7細胞/ mlで再懸濁しました。
- 予め温めておいた標識溶液中で：（5 mMのCFSEストック溶液の500倍希釈）10μMのCFSE溶液を調製します。 CFSEソリューションべきたて最適なラベリングを達成するたびに調製すること。
- CFSEで細胞をロードするには、15 mlチューブで1部10μMのCFSE溶液に1部の細胞懸濁液を追加し、37℃で10分間、暗所でインキュベートします。 5μMのCFSEの最終濃度は、1×10 7細胞/ mlを標識するために使用されます。
- CFSEのロード中に細胞の均質な混合物を確実にするためにチューブを2分ごとに反転します。
- 反応を停止するには、氷のように冷たい完全RPMI培地の複数のボリュームを追加し、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。成功したCFSEのロード時に、細胞ペレットを、黄色がかった表示されます。
- ウォッシュCFSEは氷のように冷たい完全RPMI培地で細胞を1より多くの時間をロードされ、in vitroでの培養のためにまたはインビボ刺激に使用する前に、4℃で5分間、453×gでスピンダウン。
5. in vitro刺激
- 使用直前に2倍の刺激のストック溶液（2×刺激原液）を調製10となるよう2X刺激原液0μlを96ウェルプレート中のウェルあたり200μlの最終容積に細胞100μlを添加することができます。
- （B細胞またはT細胞のためのCD3およびCD28のためにIgMまたはCD40）の刺激でコーティングされたプレートが必要な場合は、4℃で一晩PBSで刺激し、プレコート培養プレートを希釈します。代替的に、培養プレートは、実験の当日に1時間37℃でコーティングすることができます。 （プレートは任意の時点で乾燥させないでください）PBSで2回コーティングしたプレートを洗浄します。
| B細胞について | |
| 刺激 | 最終濃度 |
| F（ab '）2ヤギ抗マウスIgM | 0.6から2.4 / mlの |
| 抗マウスCD40モノクローナル抗体 | 0.5 / mlの |
| 組み換え体マウスIL-4 | 25 U / mlの |
| リポ多糖類 | 0.1 / mlの |
| E.から（LPS） 大腸菌血清型055：B5 | |
| T細胞のための | |
| 刺激 | 最終濃度 |
| 抗CD3（プレートコーティングされました） | 2-10 / mlの |
| （50μL/ウェルコーティング用） | |
| 抗CD28（プレートコーティングされました） | 2 / mlの |
| 組換えIL-2 | 40 U / mlの |
| PDBu（ホルボールエステル） | 5-50 ng / mlで |
| A23187（カルシウムイオノフォア） | 250 ng / mlで |
表1： インビトロ培養中のリンパ球を刺激するために使用される刺激の濃度。
- CFSE標識B細胞の場合は、3×10 5細胞/ウェルで96ウェルの72時間平底プレート三連で完全RPMI培地と培養3×10 6細胞/ mlに再懸濁します。
- CFSE標識T細胞を、0.5~3×10 5細胞で三重で完全RPMI培地及び培養中の0.5-3×10 6細胞/ mlに再懸濁/ウェルで48または72時間、96ウェル丸底プレート。
6. インビボ刺激
- in vivoでの刺激、各MHC適合レシピエントマウスに養子移入（200μlのPBS中の静脈内（IV））マウスあたり4×10 6 CFSE標識T細胞について。
注：このプロトコルでは、CFSE標識T細胞は、養子意志家など脾臓およびリンパ節などのリンパ器官へのこれらの細胞のように尾静脈または眼窩後注射を使用して転送することができます。 - 1日後に抗原とレシピエントマウスに挑戦。
注意：OVA特異的T細胞受容体（TCR） - トランスジェニックT細胞を養子レシピエントマウスに移したため、この例では、我々は、抗原としてオボアルブミン（OVAタンパク質を50μg/マウス）を使用します。滅菌PBSでOVAタンパク質を準備し、各レシピエントマウス5に、皮下注射（SI）を経由して、OVAタンパク質/ PBSまたはPBS対照の100μLを注入します。 - 収穫し、3日間OVAタンパク質またはPBSで免疫した後、レシピエントマウスのリンパ器官（リンパ節および脾臓）からの単一細胞懸濁液を生成します。腸間膜、膝窩、鼠径部、腰部、および尾部リンパ節を含んで腋窩、上腕および表在性頸部リンパ節を含んで近位リンパ節（PLN）、）および遠位リンパ節（DLN）への個別のリンパ節、。 T細胞の増殖を確認するために、適切なFACS抗体を用いて染色細胞。
注：このCFSE細胞追跡実験において、PBSを注射した対照マウスからのCFSE標識T細胞は非 - ジのベースライン蛍光を確立します細胞をviding。増殖の細胞分裂は、抗原刺激、CFSE標識細胞は、蛍光ピーク12,13を測定することによって可視化されます。 PBSコントロールで、増殖の細胞分裂の数は、CFSE標識T細胞は、12,13を決定することができます。 - サンプル間の細胞分裂またはピーク数を比較することによって、CFSE標識細胞増殖データを分析した （ 図1及び2）。
注：例えば、養子OVA抗原を受けたレシピエントマウスに移しCFSE標識、OVA特異的T細胞は、PBS注射コントロールマウス5,12に比べて活発な増殖を受けます。また、ホーキンスら14により示されるようにCFSE細胞増殖データを分析するための多くの方法が存在することを指摘することは注目に値します。
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Representative Results
リンパ球の磁性細胞精製は、ユーザが比較的短い時間で、標的細胞集団を精製することができます。我々の枯渇のプロトコルを用いて、精製した後、94.2％（に72.8％（前の精製）から（組換え活性化遺伝子1（RAG-1）欠損マウスにおけるOT-I）CD8 T細胞の割合を増加させることができました。 図1A）4,5。これらの精製されたリンパ球は、その後、リンパ球増殖およびシグナル伝達4,5を決定するために、下流の機能的アッセイのために使用することができます。例えば、我々は、APCのインビボでの T細胞刺激能を検討することができ 野生型（WT）および適当な抗原5で免疫化した変異体（MT）マウスにCFSE標識した、抗原特異的T細胞を転送することによって。
当社の代表的な実験では、我々は、精製され、CFSE標識、オボアルブミン（OVA）特異的なOT-I CD8 T cを転送しましたコントロールにells（WT）および変異型（MT）マウスおよびOVAタンパク質で1日後、これらのマウスを免疫しました。三日目の免疫化後、我々は、リンパ節（近位および遠位）および脾臓を回収し、フローサイトメトリーによりT細胞を分析しました。 CD45の対立遺伝子形態は、より優れた非標識レシピエントCD8 T細胞の分裂、CFSE標識、ドナーOT-I CD8細胞を分離するために利用することができます。この例では、ドナーとレシピエント細胞（ 図1B）は、それぞれ、CD45.1およびCD45.2マウスからのものです。この時点での生存のCFSEレベル、非刺激OT-I T細胞は、非増殖性細胞（ 図1C、点線）のピークを定義するために使用されます。刺激を受けると、OT-I T細胞におけるCFSEレベルの強度は、各部門で半分に削減されます。 T細胞増殖によりCFSEは6,12のピーク数をカウントすることによって決定することができます。当社の代表的な結果では、WTとMT APCのクロスプレゼンテーション能力の違いを（表示されません図1C、実線）、T細胞は両方のマウスにおいて同様の速度で増殖するからです。
別の実験において、我々は、活性化された制御およびMT T細胞の細胞増殖を研究するために、[3 H] -チミジン取り込みアッセイを行いました。精製されたWTおよびMT T細胞を、48時間、様々な刺激で刺激し、最後の8時間、[3 H] -チミジンでパルスしました。細胞周期のS期の細胞が放射標識ヌクレオチド、[3 H] -チミジンを取り込むであろう増殖、新たに合成されたデオキシリボ核酸（DNA）中に、従って、液体シンチレーション計数を用いて、細胞増殖は、[3 H]で測定することができます。 - チミジンの取り込み。分当たりのカウント数（CPM）は、直接T細胞増殖の[3 H] -チミジン取り込み量と相関します。当社の代表的な結果では、刺激によりMT T細胞から得られたcpmの数の減少は、cと比較しますWT T細胞からountsは、MT T細胞（ 図1D）の妥協増殖能を示します。
B細胞増殖能を決定するために、我々は、記載枯渇ストラテジーを使用して、脾臓B細胞を精製しました。精製の際に、我々は98.4％に（精製前）63.9パーセントからB220 B細胞（WTマウス）の割合を増加させることができた（精製後; 図2A）4。 T細胞を精製したと同様に、精製された脾臓B細胞は、リンパ球増殖およびシグナル伝達4を評価するために、下流の機能的アッセイのために使用することができます。その後、我々は、CFSEで精製WT脾臓B細胞を標識し、サイトカインIL-4を補充した抗CD40でコーティングしたプレートを用いてインビトロでこれらの細胞を刺激しました。三日間の刺激の後、我々は、フローサイトメトリーによる生存、活性化B細胞を分析しました。生存のCFSEレベルは、この時点で、非刺激B細胞がために使用され非増殖細胞（ 図2B、点線）のピークを定義します。 T細胞と同様に、B細胞におけるCFSEレベルの強度は、各部門6,12と半分に減少します。
図1： 免疫後の養子移入された精製されたOT-I T細胞のCFSEプロファイル OT-Iから単離された細胞の（A）CD4とCD8の染色;。 RAG-1欠損マウス（上パネル）および後（下パネル）の非T細胞枯渇の前に。 （B）脾臓からのT細胞の代表的なFACSプロット（SP）、近位リンパ節（PLN）および遠位のリンパ節（DLN）。ドナーOT-I CD8 T細胞は、CD45.1陽性です。 WT（影付き曲線）の脾臓から移し、CFSE標識OT-IドナーT細胞の（C）代表CFSEプロファイル（SP）、近位リンパ節（PLN）および遠位のリンパ節（DLN）とMT（実線）3日間OVAタンパク質およびLPSによる免疫化後のレシピエントマウス。点線は、（PBSを注射）免疫なしWTレシピエントマウスからのOT-I T細胞を示しています。 （D）[3 H] -チミジン取り込みアッセイによって測定されるように活性化制御またはMT T細胞の細胞増殖。結果は、分当たりのカウント（cpm）で提示されます。精製されたコントロール（オープンバー）またはMT（クローズドバー）T細胞は培地のみ（培地）中で48時間インキュベートしたかとの、または組換えIL-なしのプレート結合抗CD3または抗CD3 +抗CD28の存在下で、 2。ポリクローナル細胞の活性化は、PMA（ホルボールエステル）およびA23（カルシウムイオノフォア）によってトリガされました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： のCFSEプロフィールin vitro 刺激時のB細胞（A）B220及び（上パネル）前と（下のパネル）、非B細胞枯渇後のWTマウスから単離した脾細胞のCD3染色。 （B）抗CD40およびIL4で被覆したプレートを用いたin vitro刺激の3日後のCFSE標識WT（斜線曲線）脾臓B細胞の代表的CFSEプロファイル。点線は刺激なしCFSE標識WT B細胞を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は、リンパ器官からのリンパ球を精製するための手順を示します。磁気ビーズ選別を用いた細胞の精製は、実行可能な、高度に精製された標的細胞をもたらす迅速かつ簡単な方法です。
プロトコル内の重要なステップ
細胞生存率および細胞収量
in vitroで造血系細胞の生存率を維持することに成功し、再現性のある実験を確保するために重要です。化学的および生物学的試薬は、準最適な実験条件または摘出臓器の不適切な保存条件は、全ての細胞生存率に影響を与えることができます。マウスから切除時に、リンパ器官を氷とできるだけ早く調製単一細胞懸濁液上に格納する必要があります。細胞懸濁液の高速遠心分離も避けるべきです。さらに、細胞ペレット、上清を除去した後に指でチューブをフリックすることによって緩めなければなりません。そうではないピペッティングにより媒体の大量の直接への再懸濁ペレット推奨。
約2~4×10 7の脾臓B細胞と2×10 7 Tすべての主要なリンパ節からの細胞は、一8〜10週齢のWTマウスから単離することができます。前述したように（期待値以下）で精製B及びT細胞の減少数は、準最適な条件を示しています。
細胞の純度
このプロトコルを使用して単離された細胞の平均の純度は、 インビトロまたはインビボ実験（ 図1A） の後続のために十分な純度である90〜95％の範囲内です。そうすることにより、列の制限された結合能力に細胞の純度を損なう可能性があるので、分離のプロセスの間に細胞の過剰な数と分離カラムが過負荷にならないことをお勧めします。
FBSの品質
ザFBSの質は、培養培地は、リンパ球のインビトロでの生存のために重要である補足するために使用されます。異なるソースやバッチからFBSは、in vitroリンパ球応答に支持する能力が変化してもよいです。したがって、低いバックグラウンドと高い特異的応答を与えるものを見つけるために、FBSの異なるタイプをテストすることが重要です。ボトルのかなりの数は株式として確保する必要があります。
修正およびトラブルシューティング
CFSE標識条件
CFSE標識プレーンRPMIで動作するにもかかわらず、我々は、PBS中のFBSの低いパーセンテージを使用する標識の効率を損なうことなく、ロード・プロセス中に細胞死を減少させることを見出しました。また、FBSの存在は、遠心分離中に細胞の損失を最小限に抑えることができます。
CFSE標識の重要な態様は、明確なピークを可視化するために、細胞の均一な標識を確保することです細胞分裂を表す秒。 CFSEのオーバーロードは、in vitroまたはin vivoで標識された細胞の貧しい回復に細胞死の増加につながる可能性があります。一方、ラベリングのプロセス中の標的細胞懸濁液中の不十分なCFSE標識または不均一性が不十分解決CFSEをもたらすことができる12のピーク。したがって、CFSE標識条件を最適化することが重要です。標識に使用CFSE量が過負荷から潜在毒性効果を減少させるために可能な限り低く保た、まだ実験的な時間枠内刺激によりうまく分離されたピークを検出するのに十分な標識を達成すべきです。また、難分解されたピークを回避するために、細胞塊は、CFSEをロードする前に単一細胞懸濁液から除去されるべきです。
細胞塊とセル損失
永遠のremovaため、次のステップに進む前に、細胞を完全に再懸濁されていることを確認することが重要です実験中の細胞塊のlは大幅に細胞数を減少させます。細胞塊は、通常、減少、細胞生存率または細胞ペレットの不十分な再懸濁に関連しています。
CFSEと発光スペクトルの重なり
CFSE標識細胞をさらに培養中の1日後のフルオロフォア標識抗体を使用して定義することができるが、これらのCFSE標識細胞は、依然として文化の中で一日の後に明るい蛍光のまま。 、このようなフィコエリトリン（PE）およびフィコエリトリンシアニン7（PeCy7）などのCFSEで発光スペクトルの重なりの最小量、明るい蛍光団に結合した抗体の組み合わせを使用することで、最適な染色結果を提供します。しかしながら、発光スペクトルの重なりを低減する補償が依然として必要とされています。また、原因FL-2チャンネルに溢れCFSE信号の高輝度（FL-1チャンネル）に、FL-2チャネルは、オプトインを達成するために、FL-2値の高い割合を控除することによって補償されなければなりませんimal CFSEプロファイル。一つはQuah ら 、トラブルシューティングのCFSE標識および結果12の分析のためのソリューションを提供することによって発表された論文を参照することができます。
CFSEの代替
CFSEの発光スペクトルは、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗体としてフルオレセイン誘導体とCFSEの組み合わせの使用を制限します。 、黄色（CTY、580分の555 nm）で、遠赤色（CTFR、630：紫色で等しく高い蛍光強度と低い細胞毒性（450分の405 nmのCTV、励起/発光）で、他の市販の細胞色素は、しかし、があります/ 661 nm以下CPD670、670分の647 nm）を赤（PKH26、567分の551 nm）を。異なる発光スペクトルを有する細胞標識色素を使用することにより、実験計画に柔軟性を提供します。一方、上記の細胞標識色素の全てが異なる細胞分裂ピークを生成することができます。比較研究は、使用して行います種々の細胞標識色素は、CTVは明確に定義された細胞分裂ピーク13のより多くの検出を可能にするため、CTVはCFSEのためのより良い代替品であると結論付けました。
制限事項
磁気細胞ソーティングの主要な制限は、単純な細胞選別のためにのみ適していることです。この例では、脾臓からすべての非B細胞を枯渇させるためにCD43を使用することができます。しかしながら、我々は、辺縁帯B細胞から濾胞性B細胞を分離することができません。これらのサブ集団は、複数の表面マーカーを使用して定義することができます。それは正に、複数の表面マーカーに基づいて磁気細胞ソーティングを用いて細胞を選択することが可能であるが、第2のマーカに進む前に、選別の最初のラウンド後に標的細胞からのマイクロビーズの放出を可能にする特別に調製、市販の試薬に依存しています。これにより、ユーザは、市販のキットに完全に依存することになります。このような場合には、FACS I洗練された細胞集団を分離することで、はるかに有利です。
技術の意義
このような磁気細胞選別およびFACSなどの抗体ベースの細胞選別のアプローチは、15とデートする選別技術最も信頼性の高い電池です。細胞分離の他の方法は、しかし、リンパ球は難接着性細胞であり、密度ベースと付着ベースの技術を含め、存在するとその部分集団は、このようadherence-密度ベースの適用のいずれかではない技術であり、密度が比較的類似しているか、非常に非効率的である15 。
導入、急速な、シンプルな、高い細胞生存率、および任意の洗練された機器に依存しないで述べたようにFACSを介して磁気細胞ソーティングの受賞機能です。特に、磁気細胞選別標識を使用して、負の枯渇、最小限modificatioで標的細胞を分離しながら、磁気分離カラムを用いて、望ましくない細胞を枯渇させます細胞表面にナノ秒とナイーブな状態を維持します。
将来の応用
この磁気ベースの精製技術を用いて精製し、高度に濃縮された実行可能な、そしてナイーブリンパ球は、リンパ球の挙動の種々の機能的アッセイおよびインビトロおよびインビボで のシグナル伝達機構に供することができます。このプロトコルでは、我々は2つの異なる細胞増殖アッセイを用いて実証- [3 H] -チミジン取り込みアッセイおよびCFSE細胞増殖アッセイ-活性化リンパ球の細胞増殖能力を調べます。
[3 H] -チミジン取り込みアッセイおよびCFSE細胞増殖アッセイ間の選択は、サンプルサイズおよび実験条件に大きく依存します。大きなサンプルサイズを用いた実験において、[3 H] -チミジン取り込みアッセイを利用するハイスループット細胞増殖データを生成します。最適な[を確保するために<細胞の大部分は、活発に分裂しているときSUP> 3 H] -チミジン取り込み及び結果の再現性は、[3 H] -チミジンを培養物に添加されるべきです。標識プロトコールの最適化は、異なる細胞型および刺激に必要とされます。また、による[3 H] -チミジンの放射性性質のため、この取り込みアッセイは、（ 図2B）は、 インビトロで活性化または養子レシピエントマウスに移入することができる、細胞のCFSE標識と異なり、 インビトロで行うことができる（ 図1Bおよび1C）。
CFSE細胞増殖アッセイは、他の一方で、[3 H] -チミジンの取り込みよりも細胞増殖に関する詳細な情報を提供しています。 CFSE標識細胞におけるCFSEの強度は、各細胞分裂で半分に減少するので、一つのピークの数と大きさをカウントすることによって細胞分裂の数と各部門における細胞の割合を決定することができます
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Acknowledgments
研究は、シンガポール（ACRFのTier1-RG40 / 13およびTier2の-MOE2013-T2-2-038）、教育省によってサポートされています。原稿がObrizusコミュニケーションズからのエイミー・サリバンが編集しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
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