Protocol
כל העכברים הם התרבו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים וכל פרוטוקולי העכבר מתנהלים בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.
1. הכנת Buffers ריאגנטים
- הכן מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני (10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פניצילין (100 IU / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol ).
- כן 20x תמיסת מלח מאוזן (BSS) במלאי 1 ומלאה 2, בנפרד.
- כן 20x BSS מניות 1 (111 מ"מ דקסטרוז, פוספט אשלגן 8.8 מ"מ, 26.7 מ"מ dibasic פוספט נתרן 1 מי L סטרילי) ולהוסיף 40 מיליליטר 0.5% פנול אדומים כדי 20x BSS מנייה 1 לפני התאמת נפח סופית. סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
- הכן 20x BSS המניות 2 (מימית סידן כלורי 25.8 מ"מ, 107 מ"מ אשלגן כלורי, 2.73 M נתרן chloride, 19.6 hexahydrate מגנזיום כלוריד מ"מ, מגנזיום סולפט 16.6 מ"מ 1 מים L סטרילי). סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
- כדי להכין 1x BSS לשימוש ניסיוני, לדלל 50 מ"ל BSS מניות 1 ו -50 מ"ל BSS המניות 2, בנפרד, ב 400 מ"ל מים סטריליים כל. שלב שני פתרונות מדולל, להסתגל pH 7, ולהוסיף 20 FBS מ"ל (2%). למעלה עד 1 L באמצעות מים סטריליים סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר הסינון.
הערה: פתרונות מניות BSS צריכים להיות מוכנים בנפרד בגלל הערבוב של מניות BSS מרוכזות ישירות עלול לגרום משקעים.
- תאי דם אדומים (RBC) הצפת תמוגה
- כדי להכין חיץ תמוגה RBC, לערבב 9 חלקים כלוריד אמוניום המניות (אמוניום כלוריד 155 מ"מ במים סטריליים) עד 1 חלק המניה טריס-בסיס (130 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane במים סטריליים, pH 7.65) לפני השימוש.
הערה: חנות פתרונות מניות סטרילי כלוריד אמוניום טריס-בסיס על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמוגה בuffer טרי על מנת להבטיח תמוגה יעיל של RBCs.
- כדי להכין חיץ תמוגה RBC, לערבב 9 חלקים כלוריד אמוניום המניות (אמוניום כלוריד 155 מ"מ במים סטריליים) עד 1 חלק המניה טריס-בסיס (130 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane במים סטריליים, pH 7.65) לפני השימוש.
הדור 2. של השעיה לימפוציטים מן הטחול או בלוטות לימפה
הערה: חשוב להכין את כל החומרים כימיים והציוד הנדרשים לצורך הניסוי לפני המתת חסד עכבר כדי ליצור השעיות תא בודדות של לימפוציטים בהקדם האפשרי כדי לשמור viabilities תא גבוה.
- להרדים העכבר ניסיוני על ידי נקע בצוואר הרחם או מחנק 2 CO.
הערה: משלב זה ואילך, כל הפרוצדורות צריכות להתבצע בסביבה נקיה מחיידקים. - טובל את העכבר כולו לתוך אתנול 70% לפני ביצוע כל חתכים. הסר את בלוטות הטחול והלימפה 8 בסביבה נקייה מחיידקים, ומניחים אותם 15 נפרד צינורות מ"ל המכיל 5 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS (RPMI עם 2% FBS) או BSS / FBS (משלב 1.2.3).
הערה: מאז BSS מונע תמוגה RBC יעיל, להשתמש RPMI לעריכת ההשעיה תא הטחול ולעבור BSS after RBC תמוגה. - כדי ליצור השעיה תא בודד מן הצמתים הטחול או הלימפה, למקם את איבר (ים) בין שתי חתיכות של רשת מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי בצלחת פטרי המכילה 2 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל, ומועכים את איבר (ים) עד שהוא נקרע לחלקים עדינים מאוד.
- מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל ולשטוף את מסננת תא רשת עם קרים כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. אסוף את ההשעיה תא הנותרים, להוסיף אותו צינור 15 מ"ל אותו, ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant.
הערה: Re- להשעות את התאים pelleted על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות לפני הוספת RBC תמוגה חיץ או בינוני בשלבים הבאים. - הכן בטמפרטורת החדר (RT) חיץ תמוגה RBC במהלך צנטריפוגה של השעיה התא (ראה שלב 1.3.). לאחר pelleting את התאים הסרת supernatant, מחדש להשעות את התאים עם חיץ תמוגה 1 מ"ל RBC עבור כל 10 8 תאים. Incuבייט התגובה תמוגה ב RT במשך 3-4 דקות.
- עצור תמוגה RBC עם 14 מ"ל קר כקרח BSS / FBS ומסובב ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
טיהור 3. B ותאי T
- טיהור של תאי B
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 8 תאים הטחול ב 300 μl BSS / FBS ולהוסיף 50 μl אנטי CD43 microbeads מגנטי 9,10. כדי להסיר תאים מתים, להוסיף 30 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
- טיהור של תאי T
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 8 תאים קוקטייל נוגדנים דלדול התאים הלא-T (נוגדנים biotinylated נגד CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 ו CD4 או CD8 תלוי אוכלוסיית תאים היעד להיטהר), מדולל 1: 200 ב 200 μl BSS / FBS 4,5. דגירת השעית התא4 ° C במקרר במשך 15 דקות.
- לאחר דגירה, להוסיף 10 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 165 μl BSS / FBS עם 30 microbeads μl streptavidin ו -15 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
הערה: כדי להבטיח אפילו תיוג עם microbeads מגנטי, דגירה התאים עם microbeads במשך 15 דקות, ואז לערבב את ההשעיה תא בעדינות על ידי הקשה על שפופרת 15 מ"ל ו דגירה 15 דקות אחר במהלך שלב 3.1.1. או 3.2.2.
- הכנת טור הפרדה עבור טיהור Cell
- כן עמודת פרדה בשימוש במהלך תיוג microbead של התאים (שלב 3.1.1. או 3.2.2.). טרום חמים BSS (ללא FBS) RT ולהשתמש 2 מ"ל לשטוף לאזן את העמודה בסביבה נקייה מחיידקים. לאחר איזון עם BSS, בעמודת השטף אסור להתייבש.
הערה: אנו משתמשים ג LSolumn במקום בעמודה LD מומלץ בשל מחדש השימושיות שלה (ראה שלב 3.4.). - לאחר תיוג עם חרוזים מגנטיים, להוסיף 14 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 1-3 מ"ל RT BSS.
- צרף מחט 21 G סטרילי אל קצה הטור להפחית את קצב הזרימה במהלך תהליך של היטהרות. טען את השעית התא על טור equilibrated לאסוף את הזרימה דרך המכיל את תאי היעד המטוהרים.
הערה: הימנע החדרת בועות לתוך הטור בעת טעינה. - לשטוף את העמודה פעם עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. רענן בעמודה עם הזרם דרך שוב. אסוף את הזרימה דרך לאחר הטעינה השנייה בצינור אותו 15 המ"ל.
- לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל BSS / FBS כדי thבעמודת E ו-, עם בוכנה, לשטוף את התא המגנטי שכותרתו מהטור לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
- בדוק את הטוהר של התאים שנאספו על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים הנקשרים אל פני השטח אנטיגנים של B מטוהרים או תאי T 4,5.
- כן עמודת פרדה בשימוש במהלך תיוג microbead של התאים (שלב 3.1.1. או 3.2.2.). טרום חמים BSS (ללא FBS) RT ולהשתמש 2 מ"ל לשטוף לאזן את העמודה בסביבה נקייה מחיידקים. לאחר איזון עם BSS, בעמודת השטף אסור להתייבש.
- שימוש מחדש טור ההפרדה
הערה: הטור LS ניתן לעשות שימוש חוזר עד 4 פעמים מבלי להשפיע יעילות הטיהור.- לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 5 מ"ל בופר פוספט (PBS) ו -3 פעמים עם 5 מ"ל מים מזוקקים מלמעלה באמצעות הבוכנה.
- לשטוף את העמודה עם אתנול 5 מ"ל 70% ולייבש את העמודה באמצעות ברז אוויר נרחב כדי למנוע הצטברות של חלודה בעמודה.
- כדי להכין עמודת LS משומשת עבור ניסוי לטיהור נפרד, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה עם אתנול 5 מיליליטר 70% באמצעות מתאם המזרק. לאחר מכן, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה פעמיים עם 5 מ"ל סטרילי PBS, ואחריו 5 מ"ל PBS פעם מהחלק העליון של העמודה. מוסיפים 2מ"ל RT BSS כדי לאזן את העמודה ולאחר מכן להמשיך טעינת עמודה עם תאים שכותרתו.
4. תיוג CFSE גירוי
הערה: מטוהרי תאים יכולים להיות נתונה למגוון במבחנת מבחנים תפקודיים vivo. כאן, אנו משתמשים בתאי T מטוהרים כדי לקבוע את יכולת גירוי תא T של נגמ"שים 5.
- פתרון תיוג טרום חם (FBS 0.1% ב- PBS) עד 37 ° C לפני CFSE טעינה.
הערה: שימוש באחוז נמוך של FBS ב PBS מפחיתה מוות של תאים במהלך טעינת CFSE וממזערת אובדן תאים במהלך צנטריפוגה. עם זאת, מדי FBS הרבה יכול להפריע טעינת CFSE. - פעמיים שטפו תאים מטוהרים עם פתרון תיוג, אז מחדש תלויה ב -2 x 10 7 תאים / מ"ל בתמיסה תיוג מחומם מראש בתוך שפופרת 15 מ"ל.
- הכן 10 מיקרומטר פתרון CFSE (1: 500 דילול של 5 מ"מ CFSE פתרון המניות) בתמיסה תיוג מחומם מראש. צריך CFSE פתרוןטרי להיות מוכן כל זמן כדי להשיג תיוג אופטימלי.
- כדי לטעון תאים עם CFSE, להוסיף ההשעיה תא 1 חלק 1 חלק 10 פתרון מיקרומטר CFSE בתוך שפופרת 15 מ"ל ו דגירה בחושך במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לריכוז סופי של 5 מיקרומטר CFSE משמש התווית 1 x 10 7 תאים / מ"ל.
- להפוך את הצינור כל 2 דקות כדי להבטיח תערובת הומוגנית של תאים במהלך טעינת CFSE.
- כדי לעצור את התגובה, להוסיף כמה כרכים של מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בטעינת CFSE מוצלחת, התא הגלול יופיע צהבהב.
- לשטוף CFSE טעון תאים עוד פעם אחת עם מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C לפני השימוש עבור culturing במבחנה או בגירוי vivo.
5. גירוי חוץ-גופית
- כן פתרון 2x מניות של גירויים (פתרון מניות 2x גירויים) מייד לפני שימוש כך 100 μl של פתרון גירויים המניות 2x ניתן להוסיף 100 μl של תאים כדי לנפח סופי של 200 μl לכל היטב צלחת 96-היטב.
- אם צלחת מצופה גירויים (IgM או CD40 בתאי B או CD3 ו CD28 בתאי T) נדרש, לדלל את הגירויים PBS מראש מעיל הצלחת תרבות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחלופין, הצליח התרבות יכולה להיות מצופה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ביום הניסוי. פעמים לשטוף את הצלחת המצופית עם PBS (אל תאפשרו הצליח להתייבש בכל עת).
| עבור תאי B | |
| גירויים | ריכוז סופי |
| F (ab ') 2 עיזים אנטי עכבר IgM | 0.6-2.4 מיקרוגרם / מ"ל |
| אנטי עכבר CD40 מב | 0.5-2 מיקרוגרם / מ"ל |
| רקומביננטיעכבר IL-4 | 25 U / ml |
| lipopolysaccharide | 0.1-10 מיקרוגרם / מ"ל |
| (LPS) מ א coli סרוטיפ 055: B5 | |
| עבור תאי T | |
| גירויים | ריכוז סופי |
| Anti-CD3 (צלחת מצופה) | 2-10 מיקרוגרם / מ"ל |
| (50 μl / טוב לציפוי) | |
| אנטי CD28 (צלחת מצופה) | 2 מיקרוגרם / מ"ל |
| IL-2 רקומביננטי | 40 U / ml |
| PDBu (אסתר phorbol) | 5-50 ng / ml |
| A23187 (ionophore סידן) | 250 ng / ml |
טבלה 1: ריכוזים של גירויים משמש כדי לעורר לימפוציטים בתרבות במבחנה.
- עבור תאים B שכותרתו CFSE, מחדש להשעות עד 3 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 3 x 10 5 תאים / גם ב 96-היטב צלחות שטוחות התחתונה למשך 72 שעות.
- עבור תאים T שכותרתו CFSE, מחדש להשעות כדי 0.5-3 x 10 מ"ל 6 תאים / במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 0.5-3 x 10 5 תאים / גם ב 96-גם בסיבוב צלחות התחתונה למשך 48 או 72 שעות .
גירוי 6. Vivo
- עבור in vivo גירוי, העברת adoptively 4 x 10 6 CFSE שכותרתו תאים T לכל עכבר (לווריד (iv) ב 200 μl PBS) לתוך כל עכבר הנמען MHC בהתאמה.
הערה: בפרוטוקול זה, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן להעביר adoptively באמצעות וריד הזנב או רטרו מסלולית הזרקת תאים אלה יהיה ביתם הלימפה לאיברים כגון בלוטות הטחול והלימפה. - אתגר עכברי נמען יום אחד מאוחר עם האנטיגן.
הערה:בדוגמה זו, אנו משתמשים ovalbumin (חלבון OVA, 50 מיקרוגרם / עכבר) כמו אנטיגן כי OVA ספציפי, הקולטן של תאי T (TCR) -transgenic תאי T הועברו adoptively לעכברים הנמען. כן חלבון OVA ב PBS סטרילית להזריק 100 μl של חלבון OVA / PBS או שליטת PBS, באמצעות זריקה תת עורית (סי), לתוך כל עכבר נמען 5. - קציר וליצור השעיות תא בודדות מאיברים הלימפה (בלוטות הלימפה טחול) של עכברי נמען 3 ימים לאחר חיסון עם חלבון OVA או PBS. בלוטות הלימפה נפרדות לתוך בלוטות הלימפה הפרוקסימלית (PLN), הכולל בית השחי, זרוע ובלוטות לימפה צוואריות שטחיות) ובלוטות לימפה דיסטלי (DLN), הכולל mesenteric, popliteal, מפשעתי, המותני, ובלוטות לימפה זנב. תאי כתם באמצעות נוגדני FACS המתאימים כדי לבדוק התפשטות תאי T.
הערה: בניסוי מעקב CFSE התא הזה, CFSE שכותרתו תאי T מעכברי שליטה הזריקו PBS להקים קרינת בסיס הלא-dividing תאים. חלוקות תא של מתרבים, מגורה-אנטיגן, שכותרתו תאי CFSE הם דמיינו ידי מדידת פסגות קרינת 12,13. באמצעות השלט PBS, מספר חלוקות תא של מתרבים, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן לקבוע 12,13. - לנתח את נתוני התפשטות תאים שכותרתו CFSE על ידי השוואת מספר חלוקות תא או שיאים בין דגימות (איורים 1 ו -2).
הערה: לדוגמה, CFSE שכותרתו, OVA הספציפי בתא T adoptively הועבר לעכברי נמען מקבלים את האנטיגן OVA יעבור התפשטות פעילה לעומת עכברי השליטה הזריק PBS 5,12. יתר על כן, ראוי לציין לציין כי ישנן דרכים רבות כדי לנתח נתוני התפשטות תאי CFSE, כפי שהוכחו על ידי הוקינס ועמיתיו 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיהור תא מגנטית של לימפוציטים מאפשרת למשתמשים לטהר אוכלוסיית תא המטרה בסכום זמן קצר יחסית. שימוש בפרוטוקול הדלדול שלנו, הצלחנו להגדיל את אחוז תאי CD8 T (OT-I-הפעלת רקומבינציה גן-1 (RAG-1) עכברי -deficient) מ 72.8% (טיהור לפני כן) 94.2% (לאחר טיהור; 4,5 איור 1A). לימפוציטים המטוהרים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחנים פונקציונליים במורד לקבוע תמרת התפשטות אות הלימפוציטים 4,5. לדוגמה, אנו יכולים ללמוד את קיבולת גירוי תא in vivo T של נגמ"שים על ידי העברת CFSE שכותרתו, תאי T אנטיגן ספציפי לתוך wildtype (WT) ואת מוטציה (MT) עכברים שחוסנו עם אנטיגן מתאים 5.
בניסוי הנציג שלנו, העברנו מטוהרים, CFSE שכותרתו, ovalbumin (OVA) הספציפי OT-I CD8 T גאמות לתוך מלא (WT) ואת מוטציה (MT) עכברים שחוסנו עכברים אלה יום אחד מאוחר יותר עם חלבון OVA. שלושה ימים לאחר חיסון מסקנו בלוטות הלימפה (הפרוקסימלית ומ דיסטלי) ו spleens וניתח את תאי T על ידי cytometry הזרימה. יכולות להיות מנוצלות צורות CD45 אללים להפריד את המפריד טוב, שכותרתו CFSE, תורם OT-I תאי CD8 מ שכותרתו עישון, תאי נמען CD8 T. בדוגמה זו, תאי התורם והמקבל הם מעכברים CD45.1 ו CD45.2, בהתאמה (איור 1 ב). רמות CFSE לשרוד, unstimulated OT-I תאי T בנקודה זו בזמן משמשים להגדיר את השיא עבור תאים שאינם מתרבים (תרשים 1C, קו מקווקו). על גירוי, עוצמת רמות CFSE ב OT-I תאי T תפחית בחצי כאשר כל חטיבה. התפשטות תאי T ניתן לקבוע ובכך ידי ספירת מספר CFSE פסגות 6,12. בתוצאות הנציג שלנו, אנחנו לא רואים הבדלים ביכולות הצגת צלב של WT ו MT נגמ"שים (תרשים 1C, קווים מלאים), מאז תאי T להתרבות בשיעורים דומים בשני עכברים.
בניסוי נפרד, ביצענו assay ההתאגדות [3 ח] -thymidine ללמוד את התפשטות תאים שליטה מופעל ותאי T MT. תאים המטוהרים WT ו MT T היו מגורה עם גירויים שונים במשך 48 שעות ו פעמו עם [3 ח] -thymidine עבור השעה 8 הסופית. מתרבה תאי S-השלב של מחזור התא ישלב נוקלאוטיד רדיואקטיבי, [3 ח] -thymidine, לחומצת deoxyribonucleic המסונתז חדש (DNA), ולכן, באמצעות ספירת נצנץ נוזלית, התפשטות תאים ניתן למדוד על ידי [3 ח] ספיגת -thymidine. מספר ספירות לדקה (CPM) בקורלציה ישירה עם כמות [3 ח] ספיגת -thymidine ב מתרבים תאי T. בתוצאות הנציג שלנו, במספר המופחת של CPM המתקבל תאי T MT על גירוי לעומת גounts מתאי WT T מצביע על יכולת שגשוג נפגעת של תאי T MT (1D איור).
כדי לקבוע תא B יכולת שגשוג, אנו מטוהרים תאי B טחול באמצעות אסטרטגית הדלדול תארה. לאחר הטיהור, הצלחנו להגדיל את אחוז תאי B B220 (עכברי WT) מ -63.9% (לפני הטיהור) ל -98.4% (לאחר טיהור; איור 2 א) 4. בדומה מטוהר תאי T, תאי B טחול מטוהרים יכולים לשמש גם עבור מבחנים פונקציונליים במורד להעריך התפשטות הלימפוציטים האות התמרה 4. בהמשך לכך, אנו שכותרתו תאי B טחול מטוהרים WT עם CFSE ועורר תאים אלה במבחנה באמצעות הצלחות מצופות אנטי CD40 בתוספת ציטוקינים IL-4. שלושה ימים לאחר גירוי, ניתחנו תאים קיימא, מופעל B על ידי cytometry הזרימה. רמות CFSE לשרוד, תאי B unstimulated בנקודת זמן זו משמשותלהגדיר את השיא עבור תאים שאינם מתרבים (איור 2B, הקו המקווקו). בדומה לתאי T, עוצמת רמות CFSE בתאי B תפחית בחצי כאשר כל חטיבה 6,12.
איור 1: פרופילים CFSE של adoptively תאים OT-I T מטוהרים הועבר לאחר חיסון (א) CD4 ו CD8 צביעת תאים מבודדים OT-I;. RAG-מחסר 1 עכברים לפני (הפאנל העליון) ואחרי (הפאנל התחתון) דלדול של התאים הלא-T. (ב) מגרשים FACS נציג של תאי T מן הטחול (SP), בלוטות לימפה הפרוקסימלית (PLN) ובלוטות לימפה דיסטלי (DLN). תורם OT-I תאי CD8 T הוא CD45.1 חיובי. (C) פרופילי הנציג CFSE של עבירה, CFSE שכותרתו תאי OT-I תורם T מן הטחול (SP), בלוטות לימפה הפרוקסימלית (PLN) ובלוטות לימפה דיסטלי (DLN) של WT (מוצל עקום) וMT עכברי נמען (מוצקים קווים) 3 ימים לאחר חיסון עם חלבון OVA ו LPS. הקו המקווקו מציין OT-I T תאים מעכברים הנמען WT ללא חיסון (PBS מוזרק). (ד) על שגשוג תאי שליטה מופעלת או MT בתאי T, כפי שהיא נמדדת על ידי [3 ח] assay הספיגה -thymidine. תוצאות מוצגות בספירה לדקה (CPM). שליטה מטוהרת (בר פתוח) או MT (בר סגור) תאי T הודגרו במשך 48 שעות במדיום בלבד (בינוני) או בנוכחות נכנסת צלחת אנטי CD3 או אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 עם או בלי אִי- רקומביננטי 2. הפעלת תא Polyclonal הופעלה על ידי PMA (אסתר phorbol) ו A23 (ionophore סידן). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: CFSE פרופיל שלתאי B על גירוי במבחנה. (א) B220 מכתים CD3 של תאי טחול מבודדים מעכברי WT לפני (פנל עליון) ואחרי (פנל תחתון) דלדול של תאים הלא-B. (ב) פרופיל הנציג CFSE של CFSE שכותרתו WT (עקומה מוצל) תאי B טחול לאחר 3 ימים של גירוי במבחנה עם הצלחות מצופות-CD40 אנטי IL4. קו מקווקו מציין תאי CFSE שכותרתו WT B ללא גירוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים נוהל טיהור לימפוציטים מאיברים הלימפה. טיהור תא באמצעות מיון חרוז מגנטי היא שיטה מהירה ופשוטה מניב קיימא, תאי יעד מטוהרים.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
כדאיויות תא תשואת תא
שמירה על כדאיות של תאים השושלת hematopoietic במבחנה היא קריטית כדי להבטיח ניסויים מוצלחים לשחזור. כימית ריאגנטים ביולוגיים, תנאי הניסוי אופטימלית משנה או תנאי אחסון לא נכון של איברים נכרת כל יכול להשפיע על כדאיות התא. לאחר כריתה מעכברים, איברים הלימפה צריכים להיות מאוחסנים על קרח השעיות תא בודדים המוכנות בהקדם האפשרי. צנטריפוגה מהיר של מתלי תא יש להימנע גם. יתר על כן, כדורי התא צריך להיות משוחרר על ידי מצליף צינורות עם האצבעות לאחר הסרת supernatant. זה לאמומלץ מחדש להשעות כדורים ישירות עם כמויות גדולות של מדיום על ידי pipetting.
כ 2-4 x 10 7 תאי הטחול B ו- 2 x 10 7 בתאים T מכל בלוטות הלימפה העיקריות ניתן לבודד מאחד 8-10 שבועות בן עכבר WT. מספרי מופחת של B מטוהר ותאי T (מתחת לערך הצפוי) מעידים על תנאים תת אופטימלית, כפי שהוזכר קודם לכן.
טוהר נייד
הטוהר הממוצע של תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה נמצא בטווח של 90 עד 95%, שהוא טהור מספיק עבור באים במבחנה או בניסויי vivo (איור 1 א). רצוי לא להעמיס על עמודת ההפרדה עם מספרים מוגזמים של תאים במהלך התהליך של פרדה מכיוון שפעולה זו עלולה לסכן טוהר תא עקב יכולת המחייב המוגבלת של הטור.
איכות FBS
האיכות FBS לשמש כתוספת מדיום התרבות הוא קריטי להישרדות חוץ גופייה של לימפוציטים. FBS ממקורות קבוצות שונות עשוי להשתנות ביכולתם לתמוך בתגובות לימפוציטים חוץ גופית. לכן, חשוב לבדוק סוגים שונים של FBS למצוא אחד שנותן תגובה גבוהה ספציפית עם רקע נמוך. חלק ניכר של בקבוק צריך להיות שמורה אז כמו מניה.
שינויים ופתרון בעיות
תנאי תיוג CFSE
למרות תיוג CFSE עובד רגיל RPMI, מצאנו כי באמצעות אחוז נמוך של FBS ב PBS מפחית מוות של תאים במהלך תהליך הטעינה, מבלי להתפשר על היעילות של תיוג. יתר על כן, נוכחותם של FBS ממזערת אובדן התא במהלך צנטריפוגה.
היבט חשוב של תיוג CFSE הוא להבטיח אפילו תיוג של התאים כדי להמחיש את השיא הברורים המייצגים חלוקת התא. עומס יתר של CFSE עלול לגרום למות תא גדל במבחנה או התאוששות עניה של תאים שכותרתו in vivo. מצד השני, תיוג CFSE מספיק או הטרוגניות השעית תא המטרה במהלך התהליך של תיוג יכול לגרום גרוע נפתר CFSE פסגות 12. לכן, חשוב כדי לייעל את תנאי תיוג CFSE. כמות CFSE המשמשת תיוג צריכה להישמר נמוכה ככל האפשר כדי להפחית השפעות רעילות פוטנציאליות מפני עומס יתר, אך עדיין להשיג תיוג מספיק כדי לזהות פסגות נפתרו יפה על גירוי בתוך מסגרת זמן הניסוי. בנוסף, כדי למנוע פסגות נפתרו גרוע, גושי תאים יש להסיר מן השעיות תא בודדות לפני טעינת CFSE.
גושי תא אובדן תא
זה חיוני כדי להבטיח כי תאים מחדש מושעים באופן מלא לפני שתמשיך לשלב הבא, שכן remova התמידיl של גושי תאים במהלך הניסוי מפחית מספרים סלולריים דרסטי. גושי תאים הם בדרך כלל משויכים כדאיויות תא מופחתות או מחדש השעיה לקוית של התא הגלול.
CFSE ספקטרום פליטת חפיפה
CFSE שכותרתו תאים יכולים להיות מוגדרים נוסף עם נוגדני fluorophore מצומדות לאחר יום אחד בתרבות, לעומת זאת, תאי CFSE שכותרתו אלה עדיין נשארים ניאון בהיר אחרי יום בתרבות. באמצעות שילובים של נוגדנים מצומדות כדי fluorophores בהיר עם כמויות מינימליות של חפיפה ספקטרום פליטה עם CFSE, כגון Phycoerythrin (PE) ו Phycoerythrin-cyanine 7 (PeCy7), מספק תוצאות מכתים אופטימלי. עם זאת, פיצוי לצמצום חפיפת ספקטרום הפליטה עדיין נדרשת. בנוסף, בשל האינטנסיביות הגבוהה של אות CFSE (FL-1 ערוץ) כי נשפכה לתוך תעלת FL-2, בערוץ FL-2 צריך להיות מתוגמל על ידי ניכוי האחוז הגבוה של ערך FL-2 כדי להשיג optפרופיל imal CFSE. אפשר להתייחס במאמר שפורסם על ידי Quah et al., המספקת פתרונות תיוג תקלות CFSE וניתוח של תוצאות 12.
תחליפי CFSE
ספקטרום הפליטה של CFSE מגביל את שימוש שילובים של CFSE עם נגזרים והעמסה כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו isothiocyanate והעמסה (FITC) נוגדנים מצומדות. יש, עם זאת, אחרים זמינים מסחרי צבעי תא עם עוצמת קרינה גבוהה לא פחות רעיל לתא נמוך בסגול (CTV, עירור / פליטה: 405/450 ננומטר), צהוב (CTY, 555/580 ננומטר), הרבה אדום (CTFR, 630 ננומטר או CPD670 / 661, 647/670 ננומטר) ואדום (PKH26, 551/567 ננומטר). באמצעות צבעי תיוג תא עם ספקטרום פליטה שונה מספק גמישות בתכנון ניסוי. מצד השני, לא כל צבעי תיוג תא המתואר לעיל ניתן להפיק פסגות חלוקת תא ברורות. מחקר השוואתי בוצע באמצעותצבעי תיוג תאים שונים הגיעו למסקנה כי CTV מהווה תחליף טוב יותר עבור CFSE כי CTV מאפשרת זיהוי של מספר גדול יותר של פסגות חלוקת תא ברורות 13.
מגבלות
המגבלה העיקרית של מיון תא המגנטי הוא שזה מתאים רק מיון תא פשוט. בדוגמה שלנו, נוכל להשתמש CD43 כדי לרוקן כל התאים הלא-B מן הטחול; עם זאת, אנחנו לא יוכל להפריד תאי B פוליקולרית מתאי B אזור שולי. תת אוכלוסיות אלו יכולות להיות מוגדרות רק עם משטח סמנים מרובים. למרות זאת, ניתן לבחור תאים חיוביים באמצעות תא מגנטי מיון בסיס סמני משטח מרובים, היא תלויה שהוכנו במיוחד עם ריאגנטים זמינים מסחרי המאפשרים שחרור microbeads מתאי היעד לאחר הסיבוב הראשון של מיון לפני שתמשיך את הסמן השני. לפיכך, המשתמש יהיה תלוי לחלוטין על הערכות הזמינות המסחרי. במקרה כזה, FACS iזה הרבה יותר יתרון בהפרדת אוכלוסיות תאים מעודנים.
המשמעות של טכניקה
נוגדן מבוסס גישות מיון תא, כגון מיון תא מגנטי FACS, הם התא הכי האמין מיון טכניקות עד היום 15. שיטות אחרות של פרדת תא קיימות, כוללים טכניקות צפיפות המבוססת מבוסס דבקות, לעומת זאת, לימפוציטים הם תאים חסידים גרועות subpopulations שלהם הם יחסית דומה בצפיפות, ובכך adherence- וטכניקות מבוססי צפיפות הם או לא רלוונטיים או הם מאוד לא יעילים 15 .
כפי שהוזכר במבוא, מהירות, פשוטות, כדאיויות תא גבוהות, ועצמאי של כל מכשיר אלקטרוני מתוחכם הם המאפיינים המנצחים של תא מגנטי מיון על FACS. בפרט, דלדול שלילי באמצעות תא מגנטי מיון תוויות מכלת תאים לא רצויים באמצעות טור פרדה מגנטי, בעוד לבודד תאי יעד עם modificatio המינימאליNS אל פני התא ושמירה על המדינה הנאיבית.
יישומים עתידיים
הלימפוציטים המועשרים, קיימא, ונאיביים מאוד המטוהרים באמצעות טכניקת טיהור מגנטית מבוסס זה יכול להיות כפוף להם מבחני פונקציונליים שונים של התנהגות הלימפוציטים ומנגנוני איתות במבחנה ובחי. בפרוטוקול זה, הראינו באמצעות שני מבחני התפשטות תאים שונים - [3 ח] assay ההתאגדות -thymidine ו assay שגשוג התאים CFSE - לחקור את יכולות שגשוג התא של לימפוציטים הופעל.
הבחירה בין [3 ח] assay ההתאגדות -thymidine ו assay שגשוג התאים CFSE תלוי במידה רבה על גודל המדגם תנאי הניסוי. ניצול assay ההתאגדות [3 ח] -thymidine בניסויים עם מדגמים גדולים מייצר נתוני התפשטות תאי תפוקה גבוהה. על מנת להבטיח אופטימלי [<sup> 3 ח] ספיגת שחזור -thymidine של תוצאות, [3 ח] -thymidine יש להוסיף לתרבות כאשר רוב התאים המתחלקים באופן פעיל. אופטימיזציה של פרוטוקול תיוג נדרש עבור סוגים וגירויים תאים שונים. יתר על כן, בשל האופי רדיואקטיבי של [3 ח] -thymidine, assay התאגדות זה יכול להתבצע רק במבחנה, בניגוד תיוג CFSE של תאים, אשר יכולה להיות מופעל במבחנה (איור 2 ב) או adoptively הועבר לעכברי נמען (איור 1B ו 1C).
את assay התפשטות תאים CFSE, מצד שני, מציע מידע נוסף על תא התפשטות מ [3 ח] ההתאגדות -thymidine. מאז עוצמת CFSE בתאים שכותרתו CFSE מפחיתה בחצי עם כל חלוקת תא, אפשר לקבוע את מספר חלוקות תא ואת חלקם של תאים בכל חלוקה על ידי ספירת המספר והגודל של פסגות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי משרד החינוך, סינגפור (AcRF Tier1-RG40 / 13 ו Tier2-MOE2013-T2-2-038). כתב היד בעריכת איימי סאליבן מתקשורת Obrizus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI 1640 (without L-Glutamine) | Gibco | 31870025 | |
| Fetal Bovine Serum | Heat inactivated | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-CD43 magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mix well prior use |
| Streptavidin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mix well prior use |
| Anti-Annexin V magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mix well prior use |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-well U-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-well F-bottom sterile culture plate | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μm cell strainer mesh | To sterilize using UV radiation prior use | ||
| 0.2 μm sterile disposable filter units | Nalgene | 567-0020 | Can be substituted with any sterile filter device |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY for short; alternative to CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR for short; alternative to CFSE |
| Cell Proliferation Dye eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 for short; alternative to CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternative to CFSE |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | S7653 | Can use from other sources |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | Molecular Probes | C-1157 | Reconstitute in DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Calcium ionophore) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and recombinant protein | |||
| CD11b biotin (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | T cell depletion cocktail |
| CD11c biotin (clone N418) | Biolegend | 117304 | T cell depletion cocktail |
| Gr-1 biotin (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | T cell depletion cocktail |
| Ter119 biotin (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | T cell depletion cocktail |
| TCR-γδ biotin (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | T cell depletion cocktail |
| CD19 biotin (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | T cell depletion cocktail |
| B220 biotin (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | T cell depletion cocktail |
| CD49b biotin (clone DX5) | Biolegend | 108904 | T cell depletion cocktail |
| CD4 biotin (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | T cell depletion cocktail |
| CD8 biotin (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | T cell depletion cocktail |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (plate coated) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (plate coated) | Pharmingen | 553722 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS from E. coli Serotype 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (plate coated) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µl/well for coating (96-well) |
| Recombinant IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Albumin from chicken egg white, Ovalbumin | Sigma Aldrich | A7641 |
References
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765 (2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
